針對(duì)多種登革病毒亞型的新穎疫苗的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】針對(duì)多種登革病毒亞型的新穎疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及改進(jìn)的登革疫苗、用于誘導(dǎo)針對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng)和用于預(yù)防性地 和/或治療性地針對(duì)登革病毒免疫個(gè)體的改進(jìn)的方法。
[0002] 背景
[0003] 登革病毒（DENV)是一種新出現(xiàn)的引起登革熱（DF)和嚴(yán)重的威脅生命的疾病登革 出血熱/登革休克綜合征（DHF/DSS)的蚊媒病原。DENV是一種小的、包膜的正鏈RNA病毒， 它屬于黃病毒科（Flaviviridae)家族的黃病毒屬。登革病毒的四種不同的亞型或血清型 (DV-1到DV-4)通過(guò)蚊種埃及伊蚊（Aedes aegypti)和白紋伊蚊（Aedes albopictus)的 叮咬傳播給人類(lèi)。據(jù)估計(jì)每年出現(xiàn)5千萬(wàn)至1億的DF病例和250, 000至500000的DHF病 例。登革成為了巨大的國(guó)際公共衛(wèi)生問(wèn)題，因?yàn)槭澜缛丝诘奈宸种钤诘歉锏牧餍袇^(qū) 域并且每年出現(xiàn)估計(jì)5千萬(wàn)至1億的登革感染病例。此外，在不存在有效干涉的情況下，在 世界的亞熱帶和熱帶區(qū)域，25億人處在感染的危險(xiǎn)之下。
[0004] 超過(guò)100個(gè)熱帶國(guó)家具有流行性登革病毒感染，并且已證明DHF在大于60個(gè)這些 國(guó)家中存在。在大多數(shù)國(guó)家缺乏對(duì)DF/DHF的監(jiān)視并且過(guò)去主要集中于DHF ;因此只能估計(jì) 每年出現(xiàn)的DF病例的數(shù)目。然而在1998年，主要的流行病發(fā)生遍及亞洲和美國(guó)，其中向 世界衛(wèi)生組織（WHO)報(bào)告了大于120萬(wàn)例DF/DHF病例。DHF的全球報(bào)告在過(guò)去20年內(nèi)已 平均增加五倍。在21世紀(jì)初，根據(jù)流行病活性，估計(jì)每年出現(xiàn)5千萬(wàn)至1億的DF病例和幾 十萬(wàn)DHF病例。病死率（CFR)在國(guó)家之間有差異，但是在一些國(guó)家可以高達(dá)10- 15%而在 另一些國(guó)家〈1%。
[0005] 存在四種登革病毒亞型：登革1型（DV-1)、登革2型（DV-2)、登革3型（DV-3)和 登革4型（DV-4)。這些亞型中的每一個(gè)在黃病毒家族內(nèi)形成抗原上不同的亞類(lèi)。它們是 編碼十種蛋白的包膜的RNA病毒：三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白。所述結(jié)構(gòu)蛋白是衣殼 (C)、包膜（E)和預(yù)膜前體（preM)。DV的生命周期開(kāi)始于受體介導(dǎo)的病毒進(jìn)入細(xì)胞的胞吞作 用，接著病毒的包膜蛋白與晚期內(nèi)含體膜融合，這導(dǎo)致病毒的基因組釋放到細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。
[0006] DV感染可能無(wú)癥狀或者以發(fā)熱、寒戰(zhàn)、額痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛和疹為特征。隨后感染不 同的血清型可導(dǎo)致包括血漿滲漏或出血（登革出血熱）和休克（登革休克綜合征）的更為 嚴(yán)重的疾病表現(xiàn)。雖然多年來(lái)已進(jìn)行廣泛研究來(lái)了解DENV感染的病原性，但在特效的抗DV 化合物的研制上沒(méi)有取得什么進(jìn)展。目前在美國(guó)沒(méi)有批準(zhǔn)的針對(duì)登革感染的特定抗病毒劑 或疫苗。
[0007] 包膜（E)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是一種 I型整合膜蛋白。已證明成熟登革病毒的E蛋白以反向平行方式（頭到尾方向）形成同型 二聚體。每個(gè)單體被折疊成三種不同的結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域I (DI，中心的N端結(jié)構(gòu)域）、結(jié)構(gòu) 域II (DII，二聚化結(jié)構(gòu)域）和結(jié)構(gòu)域III (PRM/E，免疫球蛋白（Ig)樣的C端結(jié)構(gòu)域）。E蛋 白的PRM/E結(jié)構(gòu)域由C端的100個(gè)氨基酸（殘基303-395)組成。這個(gè)結(jié)構(gòu)域已表明是受 體識(shí)別和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PRM/E蛋白中存在的Ig樣折疊通常與具有附著功能的結(jié)構(gòu)有關(guān)。這 個(gè)結(jié)構(gòu)域垂直地延伸到病毒的表面，具有一個(gè)從病毒粒子表面伸出的比E蛋白的任何其他 部分更遠(yuǎn)的尖端。此外，研究已證明重組PRM/E蛋白和產(chǎn)生的抗黃病毒的E蛋白的PRM/E 的抗體均能抑制黃病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。此外，具有E蛋白的PRM/E的突變的黃病毒顯示出減 弱的毒力或逃避免疫中和的能力。
[0008] 研制安全且有效的針對(duì)登革病毒感染的疫苗仍是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生目標(biāo)。假 定免疫性與登革病毒的主要關(guān)聯(lián)被認(rèn)為是中和抗體的存在，那么用于比較和優(yōu)化疫苗候 選物的前提是精確地測(cè)量由疫苗誘發(fā)的中和抗體反應(yīng)的能力。來(lái)自所有四種血清型的包 含減弱的活病毒的疫苗的組合已顯示導(dǎo)致幾種并發(fā)癥（Guy B, Almond JW, Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2008年3月；31 (2-3):239-52)。此外，存在很少的關(guān)于基于腺病 毒的登革抗原的遞送的報(bào)告。盡管如此，腺病毒系統(tǒng)的這個(gè)眾所周知的問(wèn)題是大多數(shù)的人 類(lèi)群體已知具有抗腺病毒之一的抗體，并且此類(lèi)預(yù)先存在的抗體能夠引起這些基于腺病毒 的疫苗失效。
[0009] 因此，仍有必要研制提供針對(duì)多種且優(yōu)選所有四種血清型的登革病毒的廣泛免疫 性或通用免疫性（universal immunity)的疫苗，以及優(yōu)選地是經(jīng)濟(jì)的且在所有血清型之間 有效的疫苗。此外，存有需要向哺乳動(dòng)物施用疫苗諸如DNA疫苗或DNA質(zhì)粒疫苗以在預(yù)防 上或治療上提供針對(duì)登革病毒的免疫的有效方法。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供能夠表達(dá)引發(fā)哺乳動(dòng)物針對(duì)多于一種登革病毒亞型的免 疫反應(yīng)的多肽的核酸構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體由編碼核苷酸序列和與所述編碼核苷酸序列 可操作地連接的啟動(dòng)子組成。所述編碼核苷酸序列表達(dá)所述多肽，其中所述多肽包括來(lái)自 至少兩種不同的登革病毒亞型的包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域π I (PRM/E結(jié)構(gòu)域或PRM/E)。所述啟動(dòng) 子調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中所述多肽的表達(dá)。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)多種登革病毒亞型的免 疫反應(yīng)的DNA質(zhì)粒疫苗。所述DNA質(zhì)粒疫苗由能夠在所述哺乳動(dòng)物中表達(dá)共有登革抗原的 DNA質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的賦形劑組成。所述DNA質(zhì)粒由與編碼所述共有登革PRM/E抗原 的編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子組成。所述共有登革抗原由登革病毒亞型1、登革病毒亞 型2、登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的共有PRM/E結(jié)構(gòu)域組成。
[0013] 本發(fā)明的另一方面提供了引發(fā)哺乳動(dòng)物針對(duì)多種病毒亞型的免疫反應(yīng)的方法，所 述方法包括向所述哺乳動(dòng)物的組織遞送DNA質(zhì)粒疫苗，并用能量脈沖以有效允許所述DNA 質(zhì)粒進(jìn)入所述細(xì)胞的恒定電流將所述組織的細(xì)胞電穿孔，所述DNA質(zhì)粒疫苗包含能夠在所 述哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)衍生自所述病毒亞型的多種共有抗原以引發(fā)所述哺乳動(dòng)物的免 疫反應(yīng)的DNA質(zhì)粒，所述多種共有抗原包含來(lái)自所述至少兩種不同的病毒亞型的抗原結(jié)構(gòu) 域。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述
[0015] 圖1示出對(duì)比來(lái)自接種DlprME的小鼠的血清與來(lái)自接種DU的小鼠的血清的、針 對(duì)來(lái)自亞型1的所有登革PRM/E結(jié)構(gòu)域的結(jié)合滴度。
[0016] 圖2示出對(duì)比來(lái)自接種D2prME的小鼠的血清與來(lái)自接種DU的小鼠的血清的、針 對(duì)來(lái)自亞型2的所有登革PRM/E結(jié)構(gòu)域的結(jié)合滴度。
[0017] 圖3示出對(duì)比來(lái)自接種D3prME的小鼠的血清與來(lái)自接種DU的小鼠的血清的、針 對(duì)來(lái)自亞型3的所有登革PRM/E結(jié)構(gòu)域的結(jié)合滴度。
[0018] 圖4示出對(duì)比來(lái)自接種D4prME的小鼠的血清與來(lái)自接種DU的小鼠的血清的、針 對(duì)來(lái)自亞型4的所有登革PRM/E結(jié)構(gòu)域的結(jié)合滴度。
[0019] 圖5示出染色凝膠，所述染色凝膠展示對(duì)用來(lái)自血清型1、2、3或4的PRM/E結(jié)構(gòu) 域免疫的小鼠來(lái)說(shuō)，針對(duì)prME蛋白類(lèi)型Dl、D2、D3和D4產(chǎn)生的結(jié)合抗體。
[0020] 圖6示出展示對(duì)于對(duì)照豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的每一 種的中和抗體的圖。
[0021] 圖7示出展示對(duì)于DU-DIII豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的 每一種的中和抗體的圖。
[0022] 圖8示出展示對(duì)于Dl_D4prME豚鼠血清（所有四種疫苗組合成一種混合物并且一 起施用）來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的每一種的中和抗體的圖。
[0023] 圖9示出展示對(duì)于Dl_D4prME豚鼠血清（單獨(dú)地施用每一種疫苗）來(lái)說(shuō)針對(duì)登革 PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的每一種的中和抗體的圖。
[0024] 圖10示出展示對(duì)于DlprME豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的 每一種的中和抗體的圖。
[0025] 圖11示出展示對(duì)于D2prME豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的 每一種的中和抗體的圖。
[0026] 圖12示出展示對(duì)于D3prME豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的 每一種的中和抗體的圖。
[0027] 圖13示出展示對(duì)于D4prME豚鼠血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革PRM/E蛋白類(lèi)型（1至4)中的 每一種的中和抗體的圖。
[0028] 圖14示出展示對(duì)于來(lái)自用所有四種Dl_D4prME接種的動(dòng)物的血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革 1病毒的中和抗體的圖。
[0029] 圖15示出展示對(duì)于來(lái)自用所有四種Dl_D4prME接種的動(dòng)物的血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革 2病毒的中和抗體的圖。
[0030] 圖16示出展示對(duì)于來(lái)自用所有四種Dl-D4prME接種的動(dòng)物的血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革 3病毒的中和抗體的圖。
[0031] 圖17示出展示對(duì)于來(lái)自用所有四種Dl-D4prME接種的動(dòng)物的血清來(lái)說(shuō)針對(duì)登革 4病毒的中和抗體的圖。
[0032] 優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0033] 給出下述簡(jiǎn)略或簡(jiǎn)短的定義以幫助理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。這里所給出的簡(jiǎn) 略的定義絕不是詳盡的，它們與本領(lǐng)域理解的定義或字典含義也絕不矛盾。在這里給出簡(jiǎn) 略的定義是為了補(bǔ)充或更清晰地界定本領(lǐng)域中已知的定義。
[0034] 定義
[0035] 如本文使用，核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST(Altschul等人，Nuc. Acids Res.，1997, 25, 3389,其通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本 文）以及 PAUP*4. OblO 軟件（D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)確定。 簡(jiǎn)言之，BLAST算法代表基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool)， 它適合于確定序列相似性（Altschul等人，J. Mol. Biol.，1990, 215, 403-410,其通過(guò)引用 將其全部?jī)?nèi)容并入本文）。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公共 可利用的。由BLAST算法提供的相似性的一個(gè)量度是最小和概率（P(N))法，它提供了兩 條核苷酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的概率的指示。例如，如果在檢測(cè)核酸與另一種核酸的 比較中最小和概率小于大約1、優(yōu)選地小于大約0. 1、更優(yōu)選地小于大約0. 01且最優(yōu)選地小 于大約0. 001，那么認(rèn)為所述核酸與所述另一種核酸是相似的?？墒褂肞AUP*4. OblO軟件 (D.L.Swofford，Sinauer Associates, Massachusetts)計(jì)算"相似性的百分比"。計(jì)算出共 有序列與系統(tǒng)樹(shù)（phylogenic tree)中的所有序列相比的平均相似性。
[0036] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA 分子。編碼序列或"編碼核