專利名稱：一種采用磁性納米粒子提取細菌基因組dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用磁性納米粒子提取細菌基因組DNA的方法，屬于納米材料和 分子生物學技術領域。
背景技術：
細菌廣泛分布于自然界，其中某些病原微生物可以侵犯人體和動物，引起感染甚 至傳染病，對人類和動物健康都會構成極大危害。食用被這些細菌污染的食品、飲用被細菌 污染的水是食源性疾病的主要傳播途徑。據(jù)統(tǒng)計，我國每年實際發(fā)生食物中毒至少有20-40 萬人。近幾年來，食物中毒逐年增多。引起食物中毒的致病性微生物較多，最為常見的是腸 炎弧菌、沙門氏菌、彎曲菌屬和致病性大腸菌。傳統(tǒng)的細菌檢驗的方法需要生化培養(yǎng)、分離鑒定，程序復雜繁瑣、報告檢驗結果大 致需4 7d，不僅耗時太長，而且檢測靈敏度低。所以，建立快速而準確的檢測方法一直是 病原微生物檢驗研究的核心問題。隨著分子生物學的發(fā)展，以核酸為基礎的聚合酶鏈反應 方法(PCR)，已被廣泛應用于病原微生物菌的檢測工作，與傳統(tǒng)方法相比，這種檢測方法更 快速、更方便、更靈敏。目前，廣泛用于細菌基因組DNA的提取方法主要是傳統(tǒng)的核酸分離方法，存在使 用有毒試劑(苯酚、氯仿)、耗時長、提取效率低等不足，這已經(jīng)不能達到現(xiàn)代檢測對快速、 準確、靈敏、方便的要求。因此有必要發(fā)明一種新的細菌基因組DNA的提取方法，通過無機 或有機聚合物表面修飾或包裹的磁性微米、納米級材料粒子作為核酸分離的載體可克服這 些不足。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確、操作簡便的細菌基因組DNA的提取方法，為 DNA雜交和聚合酶鏈式反應(PCR)和后續(xù)的測序反應提供途徑。本發(fā)明的技術方案一種采用磁性納米粒子提取細菌基因組DNA的方法，包括磁 性納米粒子聚集體的制備，細菌裂解液的配制，吸附緩沖液的配制及添加，磁鐵吸附，用70% 的乙醇漂洗，用TE緩沖液洗脫，獲得細菌基因組DNA溶液；
(1)磁性納米粒子聚集體的制備。①稱取0. 65g無水三氯化鐵和0. 4g檸檬酸三鈉，量取20mL乙二醇，攪拌20min，使 之全部溶解；
②稱取1.2g無水乙酸鈉加入到上述反應體系中，攪拌lOmin，置于四氟乙烯反應釜中 油浴加熱至230°C，同時進行磁力攪拌，反應IOh后停止加熱，繼續(xù)磁力攪拌冷卻至室溫；
③反應后的溶液加入20mL的無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；
④下層沉淀加入20mL無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；
⑤下層沉淀加入20mL去離子水，超聲清洗lOmin，5000rpm離心lOmin，棄上清；
⑥下層沉淀懸浮于IOmL去離子水中，得磁性納米粒子聚集體，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (2)細菌裂解液的配制
對于革蘭氏陰性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒掉上 清液，將沉淀溶解于ImL細菌裂解液中，渦旋震蕩15s混合均勻，70°C水浴IOmin ；
所述細菌裂解液組成為50mM Tris-HCiaOmM EDTA，1% SDS，5mg/mL 蛋白酶 K，pH8. O ； 或對于革蘭氏陽性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒 掉上清液，將沉淀溶于500μ 緩沖液A中，渦旋震蕩1 混合均勻，37°C水浴30min后，加入 500ML緩沖液B中，渦旋震蕩1 混合均勻，70°C水浴IOmin ；
所述緩沖液A組成為含50mM Tris-HClUOmM EDTA、1. 2%曲拉通、20mg/mL溶菌酶， pH8. O ；
所述緩沖液B組成為含1% SDS、5mg/mL蛋白酶K，ρΗ8· O。(3)吸附緩沖液的配制及添加
配制吸附緩沖液PEG/NaCl (10%/6M)水溶液，其中聚乙二醇6000質量濃度10%、NaCl 濃度6M ；
在步驟(2)所得ImL細菌裂解液中加入制備好的磁性納米粒子聚集體ΙΟμ ，再加入吸 附緩沖液PEG/NaCl水溶液500μ ，使NaCl終濃度控制為2Μ，上下顛倒數(shù)次，混合均勻，震蕩 反應lOmin，獲得吸附細菌基因組DNA的磁性納米粒子。(4)磁鐵吸附用磁鐵將吸附有細菌基因組DNA的磁性納米粒子與溶液分離，倒掉 上清液。(5)用70%的乙醇漂洗用70%乙醇漂洗液清洗吸附有細菌基因組DNA的磁性納 米粒子兩次，室溫放置0. 5h，使殘留乙醇揮發(fā)完全。(6)用TE緩沖液洗脫加入50μ ΤΕ緩沖液，混勻后65°C水浴孵育lOmin，磁分離， 取上清，即為細菌基因組DNA溶液，保存于-20°C，備用。所述TE緩沖液為含IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH8. O的混合溶液。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用合成的磁性納米粒子提取細菌基因組的DNA，相 比傳統(tǒng)的酚/氯仿DNA提取方法，整個實驗耗時短，操作簡單，提取效率高，提取的細菌基因 組DNA完全可以用于DNA雜交和PCR等后續(xù)實驗，為以后的研究分析提供了基礎。


圖1磁性納米粒子的透射電鏡(TEM)圖。圖2磁性納米粒子提取的細菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式( 1)磁性納米粒子聚集體的制備 ①
稱取0. 65g無水三氯化鐵和0. 4g檸檬酸三鈉，量取20ml乙二醇，攪拌20min，使之全部
溶解；
②稱取1.2g無水乙酸鈉加入到上述反應體系中，攪拌lOmin，置于四氟乙烯反應釜中 油浴加熱至230°C，同時進行磁力攪拌，反應IOh后停止加熱，繼續(xù)磁力攪拌冷卻至室溫；
③反應后的溶液加入20ml的無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；④下層沉淀加入20ml無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；
⑤下層沉淀加入20ml去離子水，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；
⑥下層沉淀溶于IOml去離子水中，室溫保存?zhèn)溆谩?
(2)磁性納米粒子提取細菌基因組DNA
①細菌裂解液的配制
對于革蘭氏陰性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒掉上 清液，將沉淀溶解于ImL細菌裂解液中(50mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 1%SDS，5mg/mL蛋白酶 K，ρΗ8· 0)，渦旋震蕩15s混合均勻，70°C水浴IOmin ；
對于革蘭氏陽性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒掉上 清液，將沉淀溶于500μ 緩沖液(50mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 1.洲曲拉通，20mg/mL溶菌酶， pH8. 0)，渦旋震蕩15s混合均勻，37°C水浴30min后，加入500μ 溶液(1%SDS，5mg/mL蛋白 酶K，ρΗ8· 0)，渦旋震蕩15s混合均勻，70°C水浴IOmin ；
②吸附緩沖液的配制及添加加入制備好的磁性納米粒子，500μ 吸附緩沖液PEG/ NaCl (10%/6M),使NaCl終濃度為2M，上下顛倒數(shù)次，混合均勻，震蕩反應IOmin ；
③磁鐵吸附用磁鐵將吸附有細菌基因組DNA的磁性納米粒子與溶液分離，倒掉上清
液；
④用漂洗液(70%乙醇)清洗磁性納米粒子兩次，室溫放置半小時，使殘留乙醇揮發(fā)完
全；
⑤加入50μ 洗脫緩沖液(IOmMTris-HCl, ImM EDTA，ρΗ8. 0)，混勻后65°C水浴孵育 IOmin,磁分離，取上清，即為DNA溶液。保存于-20°C，備用。
權利要求
1. 一種采用磁性納米粒子提取細菌基因組DNA的方法，其特征在于包括磁性納米粒子 聚集體的制備，細菌裂解液的配制，吸附緩沖液的配制及添加，磁鐵吸附，用70%的乙醇漂 洗，用TE緩沖液洗脫，獲得細菌基因組DNA溶液；(1)磁性納米粒子聚集體的制備①稱取0.65g無水三氯化鐵和0. 4g檸檬酸三鈉，量取20mL乙二醇，攪拌20min，使之全 部溶解；②稱取1.2g無水乙酸鈉加入到上述反應體系中，攪拌lOmin，置于四氟乙烯反應釜中 油浴加熱至230°C，同時進行磁力攪拌，反應IOh后停止加熱，繼續(xù)磁力攪拌冷卻至室溫；③反應后的溶液加入20mL的無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；④下層沉淀加入20mL無水乙醇，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；⑤下層沉淀加入20mL去離子水，超聲清洗10min，5000rpm離心lOmin，棄上清；⑥下層沉淀懸浮于IOmL去離子水中，得磁性納米粒子聚集體，室溫保存?zhèn)溆茫?2)細菌裂解液的配制對于革蘭氏陰性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒掉上 清液，將沉淀溶解于ImL細菌裂解液中，渦旋震蕩15s混合均勻，70°C水浴IOmin ；所述細菌裂解液組成為50mM Tris-HCiaOmM EDTA，1% SDS，5mg/mL 蛋白酶 K，pH8. O ；或對于革蘭氏陽性菌，取ImL細菌增菌液于2mL滅菌離心管，IOOOOrpm離心5min，倒 掉上清液，將沉淀溶于500μ 緩沖液A中，渦旋震蕩1 混合均勻，37°C水浴30min后，加入 500ML緩沖液B中，渦旋震蕩1 混合均勻，70°C水浴IOmin ；所述緩沖液A組成為含50mM Tris-HClUOmM EDTA、1. 2%曲拉通、20mg/mL溶菌酶， pH8. O ；所述緩沖液B組成為含1% SDS、5mg/mL蛋白酶K，ρΗ8· O ；(3)吸附緩沖液的配制及添加配制吸附緩沖液10%/6Μ的PEG/NaCl水溶液，其中聚乙二醇6000質量濃度10%、NaCl 濃度6M ；在步驟(2)所得ImL細菌裂解液中加入制備好的磁性納米粒子聚集體ΙΟμ ，再加入吸 附緩沖液PEG/NaCl水溶液500μ ，使NaCl終濃度控制為2Μ，上下顛倒數(shù)次，混合均勻，震蕩 反應lOmin，獲得吸附細菌基因組DNA的磁性納米粒子；(4)磁鐵吸附用磁鐵將吸附有細菌基因組DNA的磁性納米粒子與溶液分離，倒掉上清液；(5)用70%的乙醇漂洗用70%乙醇漂洗液清洗吸附有細菌基因組DNA的磁性納米粒 子兩次，室溫放置0. 5h，使殘留乙醇揮發(fā)完全；(6)用TE緩沖液洗脫加入50μ ΤΕ緩沖液，混勻后65°C水浴孵育lOmin，磁分離，取上 清，即為細菌基因組DNA溶液，保存于-20°C，備用；所述TE緩沖液為含IOmM Tris-HClUmM EDTA、pH8. O的混合溶液。
全文摘要
一種采用磁性納米粒子提取細菌基因組DNA的方法，屬于納米材料和分子生物學技術領域。本發(fā)明包括磁性納米粒子聚集體的制備，細菌裂解液的配制，吸附緩沖液的配制及添加，磁鐵吸附，用70%的乙醇漂洗，用TE緩沖液洗脫，獲得細菌基因組DNA溶液。本發(fā)明利用合成的磁性納米粒子提取細菌基因組DNA，相比傳統(tǒng)的酚/氯仿DNA提取方法，整個實驗耗時短，操作簡單，提取效率高，具有快速、簡便、靈敏、得率高等優(yōu)點，提取的細菌基因組DNA完全可以用于DNA雜交和PCR等后續(xù)實驗，為以后的研究分析提供了基礎。
文檔編號C12N15/10GK102121002SQ201010602179
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者劉微波, 勇倩倩, 屈昌龍, 王利兵, 胥傳來, 趙書閣, 鄧小芳 申請人:江南大學