專利名稱：一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及動物疫病的預防控制。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)主要引起母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙 等為臨床特征的疾病。1991年，荷蘭學者Terpstra等人在感染豬體內(nèi)分離到歐洲型PRRSV， 命名為Lelystad病毒(LV)；同年，美國學者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為 VR-2332。該病毒1996年傳入中國并長期存在，成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要豬病病毒之一。近年來，我國學者相繼分離鑒定了美洲型PRRSV的CH-la、Si、HB-I和HB_2等毒 株。2006年6月份以來，我國多個省份的養(yǎng)豬場、戶爆發(fā)豬“高熱病”疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成 了巨大的經(jīng)濟損失，中請人在研究該病的過程中，發(fā)現(xiàn)了其主要病原——高致病性PRRSV變 異株，這一類的高致病性PRRSV變異株以Nsp2基因第1594 1680位核苷酸連續(xù)缺失為特 征，并分離鑒定了代表性病毒株——NVDC-JXAl株(分類命名繁殖與呼吸綜合征病毒；保 藏編號CGMCC No. 1964)。2006年，申請人針NVDC-JXAl病毒株建立了特異性的RT-PCR檢測方法，用于檢 測該病毒感染。但是2009年以來，通過在自然界中不斷演化，我國高致病性PRRSV變異株 已經(jīng)在基因組序列上發(fā)生了一些變化；同時，由于CHl-R疫苗等毒株逐漸推廣使用，對原有 RT-PCR檢測方法造成了非特異性的干擾。這些情況的出現(xiàn)，使得原有的RT-PCR檢測方法和 試劑盒已經(jīng)不能有效地鑒別檢測田間流行的高致病性PRRSV變異株。本發(fā)明基于對2006年至2010年分離的多個高致病性PRRSV變異株基因序列分 析，針對分離毒株Nsp2基因序列的共同特征，設(shè)計了一系列PCR引物，并經(jīng)過優(yōu)化和試驗 篩選，獲得了一對PCR引物。采用該引物組裝的RT-PCR試劑盒，可以檢測出當前發(fā)現(xiàn)的全 部高致病性PRRSV變異株，并且不受經(jīng)典PRRSV (是指Nsp2基因未發(fā)生第1594 1680位 核苷酸連續(xù)缺失的毒株)和CHl-R疫苗毒株的干擾，從而能夠特異、敏感地檢測出高致病性 PRRSV變異株。因此，該試劑盒能對高致病性PRRSV診斷和監(jiān)測起到重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本申請涉及針對高致病性PRRSV變異株NSP2基因片斷設(shè)計的RT-PCR引物對，用 于檢測高致病性PRRSV變異株(本發(fā)明中特指Nsp2基因第1594 1680位核苷酸連續(xù)缺 失為特征的毒株)。該引物對包括上游引物SEQ ID NO :1和下游引物SEQ ID NO :2的核苷 酸序列為SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3‘SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘本申請還提供一種能夠特異、敏感地檢測出高致病性PRRSV變異株的RT-PCR試劑盒，包含如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物對。試劑盒的其他組分均按照常規(guī)方 法配制，具體為1. RNA提取試劑由醋酸鈉溶液350 μ 1，酚/氯仿/異戊醇混合液3. 5ml，異丙醇 3. 5ml，75%乙醇12ml，無菌DEPC水450 μ 1，RNA酶抑制劑24 μ 1組成。2. RT-PCR反應試劑由RT反應液200 μ 1 (含反轉(zhuǎn)錄引物序列RT引物 5，-TCgCCCTAAT-3，) ,RNA 酶抑制劑 24 μ 1.AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 12 μ 1、PCR 反應液 200 μ 1,0. 5U/ μ LTaq DNA聚合酶25 μ 1、礦物油300 μ 1組成。3.電泳檢測試劑包括50ΧΤΑΕ電泳緩沖液20ml、溴化乙錠溶液100 μ 1、上樣緩 沖液50 μ 1。4.陰性對照350 μ 1、陽性對照350 μ 1,變性液7ml。


圖 1:SEQIDN0:1圖 2:SEQIDN0:2圖3 RT-PCR檢測部分PRRSV病毒樣品的電泳結(jié)果。注1.高致病性PRRSV NVDC-JXAl株；2.高致病性PRRSV TJ-F92疫苗；3.高致病性PRRSV HuM-Fl 12疫苗；4.混 樣1 (勃林格MLV疫苗+高致病性PRRSV JXAl-R疫苗)；5.高致病性PRRSV 2009當陽分離 毒株；6.經(jīng)典PRRSV NM191病毒株；7.經(jīng)典PRRSV DX F5病毒株；8.經(jīng)典PRRSV VR2332病 毒株；9.經(jīng)典PRRSV HB2病毒株；10.經(jīng)典PRRSV CH-I R疫苗；11.經(jīng)典PRRSV勃林格MLV 疫苗；12. SPF豬血清LOl ；13.陰性對照；14.陽性對照；15. DNA Marker0
具體實施例方式實施實例1RT-PCR引物合成與篩選根據(jù)2006年至2010年分離鑒定的高致病性PRRSV的NSP2基因序列，設(shè)計一系列 上游引物BUl BU34，設(shè)計一系列下游引物BDl BD27。引物由相關(guān)公司按常規(guī)方法合成。 用這些引物兩兩組成引物對，分別進行RT-PCR試驗，檢測各種有代表性的病毒樣品，包括A 高致病性PRRSV NVDC-JXA1株陽性對照；B 高致病性PRRSV變異株陽性組織； C 經(jīng)典PRRSV CH-IR疫苗；D 經(jīng)典PRRSV勃林格疫苗；E 陰性組織；F 陰性對照(純水)。通過多次測試，并比較檢測結(jié)果，最終確定了特異性最好，檢出率最高的引物對 BU21&BD16，作為RT-PCR試劑盒的引物。具體核苷酸序列為SEQ ID NO :1:5' -CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3 ‘ (BU21 序列)SEQ ID NO :2:5' -TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3‘ (BD16 序列)表1上游引物備選序列
BUlCCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTCBU3AGTGAGCCCGTACTTGTGCCCBU4AGTGAGCCCGTACTTGTGBU5ATGAGTGAGCCCGTACBU6GCGACGTGTCCCCAAGCTGBU7GACGTGTCCCCAAGCTGABU8GCGAGAACTCCCCAAGCTGBU9GCGAGAACTGCCCAAGCTGBUlOGACGTGGAACCAAGCTGABUllGACGGAACTGCAAGCTGABU12GAGTGAGCCCGTACTTGTGCBU13CTATGAGTGAGCCCGTACTTGBU14CCTATGAGTGAGCCCGTACBU15GCAGAACAAAGTCTGTCAMAGBU16TTGGAAGAGGTTGTCCTGGBU17GCACCCTGGTCCCTCCCBU18GTCAACTCATGCTGCACCCBU19GCCAGAGGACAAGCCTGTCBU20AMGCTTGCCAGAGGACAAGCCBU21CGCAGAACAMGTCTGTCMAAGBU22CMCCTCGCAGAACAAAGTCTGBU23GAGTTCAACCTCGCAGAACAAAGBU24GGGCGGCTGAGCAGGTCGBU25CCAGGCGACTTCAGAAATGATGBU26CTGCTAAAACTAGCCAACACCCBU27CTCATGTCCACTGGACTTGGC
權(quán)利要求
1.一種用于檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的RT-PCR引物對，其特征 在于其引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的RT-PCR 試劑盒，其特征在于包含如權(quán)利要求1所述的引物對。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株RT-PCR引物對和RT-PCR試劑盒，可以特異、敏感地檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征流行病毒株。
文檔編號C12N15/11GK102140526SQ20101060212
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者喬明明, 孫明, 曲萍, 王傳彬, 田克恭, 遇秀玲, 陳曦, 陳西釗 申請人:中國動物疫病預防控制中心