專利名稱：利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵及生物煉制領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物(甘油和以及殘留在甘油中的脂肪酸)生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。
背景技術(shù)：
琥珀酸，學(xué)名丁二酸，是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的四碳二羧酸。琥珀酸作為30 多種重要工業(yè)產(chǎn)品如1，4_ 丁二醇、四氫呋喃等的前體物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、 樹脂聚合體、印染、化妝品等方面。目前琥珀酸的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)法。由于環(huán)境問題，許多研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向于微生物發(fā)酵來生產(chǎn)琥珀酸，以可再生資源為原料的琥珀酸發(fā)酵法將逐步取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法。通過代謝工程構(gòu)建以多種可再生碳源為底物的、易培養(yǎng)的、高轉(zhuǎn)化效率、高產(chǎn)量的琥珀酸發(fā)酵菌株，提高微生物琥珀酸的產(chǎn)量、降低琥珀酸發(fā)酵成本具有巨大的應(yīng)用潛力。。目前，研究較多的產(chǎn)琥珀酸微生物菌株有產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens),產(chǎn)玻拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)禾口大腸桿菌(Escherichiacoli)等菌禾中。聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是細(xì)菌體內(nèi)一種酯類的累積物， 主要被用來作為碳源和能源的儲備物。同時(shí)它是一類新型的天然高分子材料，具有良好的生物降解性、生物相容性、壓電效應(yīng)、光學(xué)活性等特點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域。同時(shí)， PHA有良好的生物可降解性，其分解產(chǎn)物可全部為生物利用，對環(huán)境無任何污染。PHA的熔融溫度為175 180°C，是一種可完全分解的熱塑性塑料。自然界中積累PHA的菌株主要是假單胞菌屬(Pseudomonas)中的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)和門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)等。其中，銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa)研究的最多。銅綠假單胞菌中存在功能相似的II型PHA 聚合酶phaCl和phaC2。在不良條件下生長時(shí)，銅綠假單胞菌(I^seudomonas aeruginosa) 積累中長鏈的PHA。大腸桿菌作為生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)物的宿主由于其遺傳背景清楚、易操作、生長速率快、易培養(yǎng)及可利用多種碳源，而受到越來越多的重視。正是基于這些原因，大腸桿菌已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程中，已知的通過代謝工程改造的大腸桿菌可成功地以葡萄糖等可再生的、 廉價(jià)的碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸、乳酸以及乙醇等。大腸桿菌本身也不存在PHA合成和降解途徑，通過基因工程可以將PHA合成途徑構(gòu)建在大腸桿菌內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)PHA。由于石油價(jià)格的上漲和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重。生物柴油作為一個(gè)產(chǎn)業(yè)得到了各國的重視并迅速發(fā)展。而在生產(chǎn)生物柴油的過程中，特別是酶法合成生物柴油的過程中，甘油和甘油中的部分脂肪酸以副產(chǎn)物的形式而積累下來。如何變廢為寶？如何同時(shí)有效利用甘油和剩余的脂肪酸轉(zhuǎn)化為高附加值的生物材料或化工原料是一個(gè)重要問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決目前生物柴油生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物甘油和甘油中的脂肪酸的回收和利用問題，本發(fā)明通過構(gòu)建重組大腸桿菌，提供了一種利用重組大腸桿菌同時(shí)利用生物柴油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物甘油和甘油中的脂肪酸生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用基因工程改造大腸桿菌，在同一大腸桿菌菌株內(nèi)構(gòu)建同時(shí)利用甘油和脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸和PHA的合成途徑(見圖1)。琥珀酸是三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物之一。以代謝流分析，本發(fā)明采用大腸桿菌缺失中長鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(fad 、短鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(atoC)、碳源代謝途徑中的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II (PtsG)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhA)及乙酸生成途徑(Pta-ackA)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。fadR和atoC基因的敲除解除了對大腸桿菌利用脂肪酸包括短鏈脂肪酸的抑制作用，PtsG基因的敲除解除了分解代謝物的阻遏效應(yīng)，同時(shí)減少了乙酸的生成；sdhA基因的敲除，使得琥珀酸不被氧化利用，從而在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)積累下來；pta基因的敲除減少了乙酸的生成，增加了乙酰-CoA流向TCA循環(huán)，從而生成更多的琥珀酸。PHA合成基于脂肪酸氧化中的中間產(chǎn)物3-羥基-脂酰-CoA，通過人為表達(dá)來自銅綠假單胞菌的PHA合成酶基因(phaCl)催化3-羥基-脂酰-CoA生成PHA。本發(fā)明在同一大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建了琥珀酸和PHA合成代謝途徑，以生物柴油生產(chǎn)中的副產(chǎn)物甘油和甘油中的脂肪酸為底物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸和PHA。具體的，本發(fā)明所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法如下所述(1)琥珀酸代謝途徑的構(gòu)建通過Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌E. coli中敲除中長鏈脂肪酸代謝阻遏物基因 (fadR)、短鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(atoC)，葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II基因(ptsG)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhA)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?Pta)，構(gòu)建含琥珀酸好氧發(fā)酵途徑的大腸桿菌菌株 E. coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta。利用Red重組系統(tǒng)，根據(jù)Genbank公布的大腸桿菌基因組序列，設(shè)計(jì)引物對fadR、 atoC、ptsG、sdhA和pta基因進(jìn)行敲除。以pKD3或pKD4為模板，通過PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增帶有氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的同源重組片斷。培養(yǎng)帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌并制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將50 100 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞與8 12ng的同源重組片斷混合加入電擊杯中(購買于Bio-Rad公司)，通過電穿孔儀(購買于Bio-Rad公司) 電擊，電壓設(shè)置為1800 2500v。將電擊液用900 μ L的SOC培養(yǎng)基稀釋，然后通過氯霉素抗性或卡那霉素抗性平板篩選重組子，然后設(shè)計(jì)引物PCR驗(yàn)證敲除的正確性。然后培養(yǎng)重組大腸桿菌并制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化PCP20質(zhì)粒，通過溫度誘導(dǎo)表達(dá)FLP內(nèi)切酶將抗性基因從基因組上切除掉。上述敲除基因fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta所用的引物分別為pKD-fadR primer 1 5 ‘ -GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-fadR-primer2 5 ‘ -ACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-fadR-test 1 5' -ACGGTCAGGCAGGAGTGAG-3‘
pKD-fadR-test2 5' -AGCATCGAGTTGCTGGAACG-3‘pKD-atoC primer 1 5 ‘ -GCTTATTTTACCGATCAACCCGCAGGGAAATCAGACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-atoC primer2 5 ‘ -TTGCGCACTGTGCAAATTTCTGCATAGCAAGTTTTGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-atoC testl 5' -ATCAGGGTGATATTCGCGTCG-3‘pKD-atoC tes2 5' -AACTAATTGAATATGAAGGGA-3‘pKD-ptsG primerl 5 ‘ -ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-ptsG primer2 5 ‘ -AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-ptsG testl 5' -CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3‘pKD-ptsG test2 5' -AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3‘pKD-sdhA primerl 5 ‘ -TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-sdhA primer2 5 ‘ -ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-sdhA testl 5' -GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3‘pKD-sdhA test2 5' -GAGCATCATCAACATCCGGG-3‘pKD-pta primerl 5 ‘ -GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-pta primer2 5 ‘ -TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-pta test 1 5' -TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3‘pKD-pta test 2 5' -ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3‘上述質(zhì)粒pKD46(oriR101r印AlOlts ParaB-gam-bet-exo Amp)是溫度敏感型，能在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下表達(dá)同源重組需要的三個(gè)λ噬菌體重組酶Gam，Bet和Εχο，提高重組效率。上述質(zhì)粒pKD3含有兩邊為FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因；質(zhì)粒pKD4含有兩邊為FRT 位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因。上述質(zhì)粒pCP20為溫度敏感型，熱誘導(dǎo)后表達(dá)FLP重組酶，能識別FRT位點(diǎn)并促進(jìn)重組的發(fā)生。所述質(zhì)粒PKD46、pKD4、pKD3及pCP20的構(gòu)建及應(yīng)用見(1. Datsenko KA, WannerBL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli using PCR products. Proc NatlAcad Sci USA2000，97 :6640 6645 ;2. Red 重組技術(shù)研究進(jìn)展， 中國生物工程雜志，2006:81 86 ；3. Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的應(yīng)用， 遺傳，2003,25(5) :6 632 ；4.利用Red重組系統(tǒng)對大腸桿菌ClpP基因的敲除，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21 (1) :35 38)。( phaC基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基本方法是將來源于假單胞菌屬(I^eudomonas)的PHA合成酶基因(phaC)克隆至質(zhì)粒 pBluescript SIT、pUC18、pUC19、pCL1920 或 pTrc99_A 中獲得 PHA 表達(dá)重組質(zhì)粒 p-phaCo(3)構(gòu)建能同時(shí)發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物(甘油和甘油中的脂肪酸)生產(chǎn)琥珀酸和 PHA的重組大腸桿菌將phaC基因表達(dá)載體p-phaC轉(zhuǎn)化所構(gòu)建的琥珀酸發(fā)酵大腸桿菌 E. coli AfadR AatoCΔptsGΔ sdhAΔpta，從而獲得生產(chǎn)琥珀酸和PHA的重組大腸桿菌 E. coliΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta/p-phaC?；蛘咴谝褬?gòu)建有PHA發(fā)酵途徑的大腸桿菌E. coli/p-phaC中，利用Red重組系統(tǒng)敲除中長鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(fadR)、短鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(atoC)，葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II基因(PtsG)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhA)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；富?Pta)，從而獲得生產(chǎn)琥珀酸和PHA的重組大腸桿菌E. coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/p-phaC。上述大腸桿菌Ε. coli屬于大腸桿菌Ε. coli k_12系列。優(yōu)選k_12系列中的Ε. coli MG1655。上述PHA合成酶基因phaC來源于能合成中長鏈PHA的假單胞菌屬。優(yōu)選銅綠假 Hfilif (Pseudomonas aeruginosa)。上述PHA合成酶基因phaC優(yōu)選來源于銅綠假單胞菌(I^seudomonas aeruginosa) 中 phaCl 和 phaC2 中的 phaCl。上述PHA合成酶phaCl表達(dá)載體優(yōu)選為pUC19。上述聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯和琥珀酸的重組大腸桿菌 E. coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/p-phaC 選擇 Ε· coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG ΔsdhAΔpta/pUC-phaCl。(4)利用步驟(3)所獲得的重組大腸桿菌首先以甘油和癸酸(Cltl脂肪酸)為底物進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)琥珀酸和PHA，以驗(yàn)證本發(fā)明的可行性利用構(gòu)建的重組大腸桿菌E. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ pUC-phaCl發(fā)酵甘油和癸酸生產(chǎn)琥珀酸和PHA。發(fā)酵過程將重組大腸桿菌E. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ pUC-phaCl從固體平板上挑取1 2環(huán)接入裝有LB培養(yǎng)基的試管中，30 40°C下，培養(yǎng) 12 20h ；然后以體積比計(jì)，按照1 10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，培養(yǎng)12-1 !后，再以體積比計(jì)，按照5-10%的接種量轉(zhuǎn)入IL 5L的發(fā)酵罐中， 30 40°C，溶氧控制在50%以上，ρΗ 6. 5 7. 5，發(fā)酵72h 150h。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為20-30g/L的甘油和l_5g/L的癸酸，(NH4)2HP043g/L，(NH4) H2PO4lg/L, KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素，100mg/L。發(fā)酵結(jié)果顯示Ε·coli MG1655 Δ fadR AatoC AptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phaCl 菌株可以有效利用甘油和癸酸，在積累21g/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的 5. 62%。(5)利用重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物甘油和脂肪酸生產(chǎn)琥珀酸和PHA以步驟(4)為基礎(chǔ)，利用重組的大腸桿菌E. col iMG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ PUC-phaCl發(fā)酵來自植物油脂生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物或來自動物油脂生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物。發(fā)酵過程將重組大腸桿菌E. coli MG1655 AfadR AatoCΔptsGΔ sdhA Apta/ pUC-phaCl從固體平板上挑取1 2環(huán)接入裝有LB培養(yǎng)基的試管中，30 40°C下，培養(yǎng) 12 20h ；然后以體積比計(jì)，按照1 10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，培養(yǎng)12-1 后，再以體積比計(jì)，按照5-10%的接種量轉(zhuǎn)入IL 5L的發(fā)酵罐中發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為含10-60g/L的甘油和l-10g/L脂肪酸(棕櫚酸或硬脂酸)的生物柴油副產(chǎn)物，(NH4)2HP043g/L，(NH4)H2PO4lg/L，KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉3g/L，氨芐青霉素，lOOmg/L。發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 72h ；發(fā)酵罐溫度設(shè)為30 40°C，溶氧控制在50%以上，pH 6. 5 7. 5，發(fā)酵時(shí)間 72h 150h。進(jìn)一步優(yōu)選的發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為37°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 60h ；發(fā)酵罐溫度設(shè)為37°C，溶氧控制在50%以上，pH 7. 0，發(fā)酵時(shí)間IOOh 120h。琥珀酸檢測每間隔2 4h取樣，將取的發(fā)酵液以4，000 12，000的轉(zhuǎn)速離心 2 20分鐘，上清液用于分析檢測琥珀酸。用0. 2μπι的濾膜過濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱HPX-87H，BioRad Labs ；流動相5mM H2SO4溶液；檢測器示差檢測器。PHA檢測每間隔2 4h取樣，將所取的發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。將上述制得的5mg干菌體，加入850 μ 1的甲醇，150 μ 1的98%硫酸和ImL的氯仿。沸水浴中加熱60分鐘，然后利用1毫升的雙蒸水，劇烈混勻后，靜置分層， 然后吸取下層溶液于管中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，利用氣相色譜檢測ΡΗΑ。發(fā)酵結(jié)果表明，重組大腸桿菌Ε. coli MG1655 AfadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ PUC-phaCl可以同時(shí)利用生物柴油副產(chǎn)物甘油和脂肪酸。同時(shí)利用來自植物油脂的生物柴油副產(chǎn)物條件下，在積累25. 3g/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的4. 13% ；而利用來自動物油脂的生物柴油副產(chǎn)物的條件下，在積累26. lg/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的3. 42%。本發(fā)明針對生物柴油過程中副產(chǎn)物甘油和甘油中的脂肪酸回收和利用的問題，提出了利用生物柴油副產(chǎn)物甘油和脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸和PHA的方法。即在同一大腸桿菌中構(gòu)建同時(shí)利用甘油和脂肪酸(C8-C24)的途徑，通過發(fā)酵生物柴油的副產(chǎn)物同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸和PHA。發(fā)酵結(jié)果表明生物柴油副產(chǎn)物甘油和脂肪酸得到了很好的利用，同時(shí)琥珀酸和PHA得到了有效積累。本發(fā)明方法應(yīng)用到生物柴油產(chǎn)業(yè)中，可以實(shí)現(xiàn)對副產(chǎn)物甘油和甘油中的脂肪酸的有效利用，從而降低生物柴油產(chǎn)業(yè)的成本，實(shí)現(xiàn)生物柴油產(chǎn)業(yè)的琥珀酸和PHA的低成本、高效率的聯(lián)產(chǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物甘油和脂肪酸生產(chǎn)琥珀酸和PHA的途徑。圖 2 為本發(fā)明構(gòu)建菌株 E.coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG, Ε. coliMG1655 Δ fadRAatoCAptsGA sdhA 及 E.coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta利用葡萄糖積累琥珀酸產(chǎn)量比較。圖 3 為本發(fā)明構(gòu)建菌株 Ε. coli MG1655 Δ fadR AatoC AptsG Δ sdhA Δ pta 甘油發(fā)酵結(jié)果。圖 4 為本發(fā)明工程菌株E.coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Δ pta/ pUC-phaCl發(fā)酵甘油和癸酸(Cltl)的結(jié)果。圖 5 為本發(fā)明工程菌株 E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/ PUC-phaCl發(fā)酵來自植物油脂生產(chǎn)生物柴的油副產(chǎn)物的結(jié)果。圖 6 為本發(fā)明工程菌株 E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/ pUC-phaCl發(fā)酵來自動物油脂生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式一般性說明本發(fā)明所用大腸桿菌初始菌株E. coli MG1655購自ATCC(美國菌種保藏中心)。 所述質(zhì)粒PKD3、pKD4、pKD46和pCP20質(zhì)粒購買于ATCC (美國菌種保藏中心)。所述質(zhì)粒 pBluescriptSK-、pUC19、pUC18 購買于 fermentas 公司。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，質(zhì)粒pCL1920和pTrc99_A購買于DSMZ (德國微生物菌種保藏中心)。大腸桿菌E.coli DH5a購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例1、琥珀酸發(fā)酵途徑的構(gòu)建(敲除fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta)初始菌種大腸桿菌E. coli MG1655。所述LB培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。所述氨芐霉素抗性平板為含有100mg/L的氨芐青霉素，1. 5%的瓊脂粉的LB固體
培養(yǎng)基。所述卡那霉素抗性平板為含有50mg/L的氨芐青霉素，1. 5%的瓊脂粉的LB固體培養(yǎng)基。所述氯霉素平板為含有30mg/L的氯霉素，1. 5%的瓊脂粉的LB固體培養(yǎng)基。所述SOC 培養(yǎng)基為蛋白胨 2g/L，酵母粉 0. 5g/L，NaCl 0. 0585g/L, KCl 0. 0186g/ L, MgCl2O. 203g, MgSO4O. 246g/L,葡萄糖 20mmol/L。(1)同源重組片斷的克隆利用Red重組系統(tǒng)對目的基因進(jìn)行敲除。根據(jù)Genebank公布的fadR、at0C、ptSG、 sdhA和pta基因序列設(shè)計(jì)引物pKD-fadR primerl 5 ‘ -GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-fadR-primer2 5 ‘ -ACCCCTCGTTTGAGGGGTTTGCTCTTTAAACGGAAGGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-atoC primerl
5 ‘ -GCTTATTTTACCGATCAACCCGCAGGGAAATCAGACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-atoC primer2 5 ‘ -TTGCGCACTGTGCAAATTTCTGCATAGCAAGTTTTGGTGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-ptsG primer1 5' -ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-ptsG primer2 5 ‘ -AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-sdhA primer1 5 ‘ -TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-sdhA primer2 5 ‘ -ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘pKD-pta primer 1 5 ‘ -GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘pKD-pta primer2 5' -TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3‘fadR和sdhA引物以pKD4為模板，ptsG、atoC禾口 pta引物以pKD3為模板，通過 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴(kuò)增獲得帶有卡那霉素抗性的重組片斷和氯霉素抗性的重組片段。PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20 μ mol/L)IOX 緩沖液 5μ1;25mmol/LMgC124y 1 ；10mmol/L 四種 dNTP 混合液 1 μ 1 ；上下游引物各Ιμ ;TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ 1 ；模板0嫩1“1，加水補(bǔ)至50口1;PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性60s，58°C退火30s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。通過DpnI內(nèi)切酶消化后，回收純化濃縮同源重組片斷。(2)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)挑取帶有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌MG1655，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入0. 2%的
阿拉伯糖，培養(yǎng)OD6tltl至0.5 ；(II)冰浴15分鐘，離心菌體，然后利用10%的甘油洗滌三次；(III)加入10%的甘油，濃縮至50倍，分裝感受態(tài)。(3)電轉(zhuǎn)化，篩選重組子(I)吸取7 lOyg/Ι的同源重組片斷，加入100 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。調(diào)節(jié)電穿孔儀，2. 5Κν，電擊；(II)加入900 μ 1的SOC培養(yǎng)基，37°C，150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)Ih ；(III) (fadR、sdhA敲除)涂布卡那霉素抗性平板，(ptsG和pta敲除)涂布氯霉素抗性平板，調(diào)取重組子。分別利用pKD-fadR-testl 5' -ACGGTCAGGCAGGAGTGAG-3‘
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pKD-fadR-test2 5' -AGCATCGAGTTGCTGGAACG-3‘檢測fadR基因的敲除；利用pKD-atoC testl 5' -ATCAGGGTGATATTCGCGTCG-3‘pKD-atoC tes2 5' -AACTAATTGAATATGAAGGGA-3‘檢測atoC基因的敲除；pKD-ptsG testl 5' -CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3‘pKD-ptsG test2 5' -AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3‘檢測ptsG基因的敲除；利用pKD-sdhA testl 5' -GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3‘pKD-sdhA test2 5' -GAGCATCATCAACATCCGGG-3‘檢測sdhA基因的敲除；利用pKD-pta test 1 5' -TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3‘pKD-pta test 2 5' -ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3‘檢測pta基因的敲除。(IV)PLP位點(diǎn)專一重組將pCP20轉(zhuǎn)入氯霉素抗性克隆，30°C培養(yǎng)他，后提高至42°C過夜，熱誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，質(zhì)粒也逐漸丟失。利用接種環(huán)蘸取菌液在無抗性培養(yǎng)基上劃線，將長出的單克隆同時(shí)轉(zhuǎn)入無抗性平板和卡那霉素抗性平板上培養(yǎng)，在無抗性平板上生長而在卡那霉素抗性平板上不生長的已被FLP重組酶刪除。(V)在敲除fadR基因后獲得菌株E. coli MG1655 Δ fadR,繼續(xù)敲除 atoC基因獲得菌株E. coliMG1655 Δ fadR AatoC,繼續(xù)敲除ptsG基因，從而獲得 E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG,繼續(xù)敲除 sdhA 基因，從而獲得 E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA 菌株；在 Ε. coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA 菌株中繼續(xù)敲除Pta基因，最終獲得工程菌株E. coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pt
3- ο實(shí)施例2、大腸桿菌 E.coli MG1655 AfadRAatoCAptsG, Ε. coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA及 Ε. coli MG1655MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsGA sdhAApta菌株發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量的比較菌種大腸桿菌Ε. coli MG1655 AfadRAatoCAptsG, Ε. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA R Ε. coli MG1655ΔfadRΔatoCΔptsGΔsdhAΔpta。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖18. 5g/L，(NH4)2HP043g/L，(NH4)H2PO4lg/L，KCl 1. 5g/L, MgSO4 · 7H200. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素 100mg/L。(1)發(fā)酵過程用接種環(huán)分別調(diào)取平板上的E.coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG, Ε. coliMG1655 Δ fadRAatoCAptsGA sdhA 及 E.coli MG1655 Δ fadR AatoC AptsG Δ sdhA Δ pta菌株，然后分別接入裝有IOml的發(fā)酵培養(yǎng)基的50ml的三角瓶中，于250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，然后以體積比計(jì)， 分別按照的接種量接入裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，培養(yǎng)溫度設(shè)為 37°C，以轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行發(fā)酵。每間隔4h取樣，發(fā)酵時(shí)間為72h。(2)琥珀酸的檢測將所取發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘。取上清液，用0. 2 μ m的濾膜過濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱HPX-87H，BioRad Labs ； 流動相5mM吐304溶液；檢測器示差檢測器。(3)發(fā)酵結(jié)果通過檢測顯示(發(fā)酵結(jié)果見附圖2)，E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG積累少量的琥珀酸0. 37g/L的同時(shí)積累乙酸5. 05g/L ；在敲除了 sdhA基因后，菌株E. coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA琥珀酸產(chǎn)量提高了 6倍多，為2. 43g/L，乙酸產(chǎn)量仍然較高，為5.91g/L;在敲除pta基因后，E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta菌株琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到了 4. 94g/L,而乙酸產(chǎn)量降至為 1. 56g/L。通過上述發(fā)酵結(jié)果可以看出，大腸桿菌E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta分泌乙酸大大降低，而琥珀酸產(chǎn)量得到了很大提尚。實(shí)施例3、E. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Δ pta 菌株發(fā)酵甘油檢測菌種Ε· coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Δ pta 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方為甘油20g/L，(NH4)2HPO4 3g/L，(NH4)H2PO4 lg/L，KCl 1. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素 lOOmg/L(1)發(fā)酵過程用接種環(huán)調(diào)取平板上的大腸桿菌Ε. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Δ pta菌株，接入裝有IOml的發(fā)酵培養(yǎng)基的50ml的三角瓶中，于250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，然后以體積比計(jì)，按照1 % 的接種量接入裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，以轉(zhuǎn)速為 250轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行發(fā)酵。每間隔4h取樣，發(fā)酵時(shí)間為72h。(2)琥珀酸的檢測將所取發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘。取上清液，用0. 2 μ m的濾膜過濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱HPX-87H，BioRad Labs ； 流動相5mM吐304溶液；檢測器示差檢測器。(3)發(fā)酵結(jié)果如附圖3所示，大腸桿菌E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta菌株有效利用甘油發(fā)酵琥珀酸，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到 T 7.44g/L，琥珀酸/甘油轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 0.37g琥珀酸/g甘油。而乙酸僅僅為1. lg/L。實(shí)施例4、phaCl基因表達(dá)質(zhì)粒pUC-phaCl的構(gòu)建培養(yǎng)基LB 蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L。PHA合成酶基因phaCl來源于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。載體優(yōu)選質(zhì)粒pUC19。氨芐霉素抗性平板含有1. 5%的瓊脂和100mg/L的氨芐霉青霉素的LB培養(yǎng)基。(l)phaCl基因的克隆
(I)將銅綠假單胞菌接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12h，然后室溫下12，000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心2分鐘收集菌體。然后利用利用通用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取銅綠假單胞菌基因組(基因組提取試劑盒購于天根公司)。(II)根據(jù)Genbank公布的銅綠假單胞菌的基因組序列，設(shè)計(jì)引物phaClprimerl 5 ‘ -CCCAAGCTTAAAGGAGGAAAATCATGAGTCAGAAGAACAATAACGAGC-3‘phaClprimer2 5 ‘ -AATCTCGAGTCATCGTTCATGCACGTAGGTTCCG-3‘下劃線標(biāo)出為內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)AAGCTT =HindIII內(nèi)切酶CTCGAG =PstI內(nèi)切酶(III)克隆PHA合成酶基因以銅鋁假單胞菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增phaCl基因。PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20ymol/L)IOX 緩沖液 5μ1;25mmol/LMgC124y 1 ；10mmol/L 四種 dNTP 混合液 1 μ 1 ；上下游引物各Ιμ ;TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ 1 ；模板DNAl μ 1，加水補(bǔ)至50 μ 1 ；PCR反應(yīng)條件97°C預(yù)變性10分鐘，94°C變性60s，58°C退火30s，72°C延伸2. 0分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。(IV) PHA合成酶表達(dá)載體的構(gòu)建將pUC19和PCR產(chǎn)物通過HindIII和XhoI雙酶切反應(yīng)，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后利用T4連接酶連接，反應(yīng)為16°C，1他。從而獲得PHA合成酶表達(dá)載體 pUC-phaClο(2)大腸桿菌感受態(tài)的制備；(I)調(diào)取LB平板中的大腸桿菌E. coli DH5 α，培養(yǎng)過夜；(II)將培養(yǎng)過夜的大腸桿菌Ε. coli DH5a以體積比計(jì)，按照1 %的接種量轉(zhuǎn)入裝有50ml LB的300ml的三角瓶中培養(yǎng)，OD600至0. 4左右，停止培養(yǎng)，置冰上20分鐘，4°C， 4000g,離心10分鐘。棄上清，加入冰冷的CaCl2溶液懸浮，冰上靜置30分鐘。離心濃縮。 獲得感受態(tài)細(xì)胞。放于_70°C保存。(3) PHA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化(I)將8 μ g/1的PHA表達(dá)載體pUC-phaCl轉(zhuǎn)入100 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；(II)置冰上30分鐘；(III) 42°C熱激，冰上靜置2分鐘，加入900 μ 1的LB培養(yǎng)基，37°C，100轉(zhuǎn)/分鐘， 培養(yǎng)Ih。(IV)涂布氨芐霉素抗性平板，培養(yǎng)過夜，調(diào)取驗(yàn)證，篩選克隆正確的轉(zhuǎn)化子E. coli DH5α /pUC-phaCl。實(shí)施例5、聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵琥珀酸與PHA 的重組大腸桿菌E. coliMG1655 Δ fadR Δ ato C Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phaCl 的構(gòu)建
(1)大腸桿菌 E. coli MG1655 AfadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta 感受態(tài)細(xì)胞的制備(I )將大腸桿菌Ε. coli MG1655 AfadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta在 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；(II)將培養(yǎng)過夜的大腸桿菌 Ε. coli MG1655 AfadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta 以體積比計(jì)，按照的接種量轉(zhuǎn)入裝有50ml LB的300ml的三角瓶中培養(yǎng)，0D_至0. 4左右， 停止培養(yǎng)，置冰上20分鐘，4°C，4000g,離心10分鐘。棄上清，加入冰冷的CaCl2溶液懸浮， 冰上靜置30分鐘。離心濃縮。獲得感受態(tài)細(xì)胞。放于-70°C保存。(2) PHA表達(dá)載體pUC-phaCl的轉(zhuǎn)化(I)將 8yg/l 的 PHA 表達(dá)載體 pUC-phbCl 轉(zhuǎn)入 100 μ 1 的 Ε. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta 感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；(II)置冰上30分鐘；(III) 42°C熱激90秒，冰上靜置2分鐘，加入900 μ 1的LB培養(yǎng)基，37°C，100轉(zhuǎn)/ 分鐘，培養(yǎng)Ih。(IV)涂布氨芐霉素和卡那霉素雙抗性平板(所述氨芐霉素抗性平板含有質(zhì)量百分比為1. 5%的瓊脂，100mg/L的氨芐霉青霉素及50mg/L的卡那霉素)，培養(yǎng)過夜，調(diào)取驗(yàn)證，篩選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子 E. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phaCl。(V)獲得重組菌株 Ε. coli MG1655 Δ fadR AatoC AptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phaCl。實(shí)施例6、重組工程菌株 Ε. coli MG1655 Δ fadR AatoC AptsG Δ sdhA Δ pta/ pUC-phaCl發(fā)酵甘油與癸酸菌種重組大腸桿菌E.coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Δ pta/ pUC-phaClο發(fā)酵培養(yǎng)基配方甘油48g/L，癸酸 3g/L，(NH4)2HP043g/L，(NH4)H2PO4lg/L，KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素 100mg/L。⑴發(fā)酵培養(yǎng)用接種環(huán)調(diào)取平板上的菌種接入裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，于 250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，然后以體積比計(jì)，按照1 %的接種量接入裝有200ml的培養(yǎng)基的1000ml的三角瓶中，培養(yǎng)過夜；再以體積比計(jì)，按照5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，溶氧控制在50%以上， 利用2mol/L的NaOH和lmol/L的HCl控制pH在6. 5-7. 5。培養(yǎng)至12h，加入IPTG至終濃度為0.4mM。發(fā)酵96h，每間隔4h取樣。(2)琥珀酸和PHA的檢測(I)琥珀酸的檢測將所取發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘。取上清，用 0. 2 μ m的濾膜過濾，然后利用HPLC (高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱HPX_87H， BioRadLabs ；流動相5mM 溶液；檢測器示差檢測器。(II)PHA 的檢測收集細(xì)胞將所取的發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。
樣品檢測將上述制得的5mg干菌體，加入850 μ 1的甲醇，150 μ 1的98%硫酸和 ImL的氯仿。沸水浴中加熱60分鐘，然后利用1毫升的雙蒸水，劇烈混勻后，靜置分層，然后吸取下層溶液于管中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，利用氣相色譜檢測ΡΗΑ。檢測結(jié)果通過圖4可以看出，本發(fā)明方法構(gòu)建的重組大腸桿菌E.coliMG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phbCl以甘油和癸酸為底物，能有效積累琥珀酸和 PHA。在積累21g/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的5. 62%。實(shí)施例7、重組工程菌株 E. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ pUC-phaCl發(fā)酵來自植物油脂的生物柴油副產(chǎn)物菌種重組大腸桿菌E.coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Apta/ pUC-phaCl。所述發(fā)酵基本培養(yǎng)基生物柴油副產(chǎn)物(約含20g/L的甘油和5g/L的棕櫚酸)， (NH4) 2HP043g/L，(NH4) H2PO4lg/L, KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素 100mg/L。⑴發(fā)酵培養(yǎng)用接種環(huán)調(diào)取平板上的菌種接入裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，于 250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，然后以體積比計(jì)，按照1 %的接種量接入裝有200ml的培養(yǎng)基的IOOOml的三角瓶中，培養(yǎng)過夜，再以體積比計(jì)，按照5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，溶氧控制在50%以上， 利用2mol/L的NaOH和lmol/L的HCl控制pH在6. 5-7. 5。培養(yǎng)至12h，加入IPTG至終濃度為0. 4mM。發(fā)酵96h，每間隔4h取樣。(2)琥珀酸和PHA的檢測(I)琥珀酸的檢測將所取發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘。取上清，用 0. 2 μ m的濾膜過濾，然后利用HPLC (高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱HPX_87H， BioRadLabs ；流動相5mM 溶液；檢測器示差檢測器。(II)PHA 的檢測收集細(xì)胞將所取的發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。樣品檢測將上述制得的5mg干菌體，加入850 μ 1的甲醇，150 μ 1的98%硫酸和 ImL的氯仿。沸水浴中加熱60分鐘，然后利用ImL的雙蒸水，劇烈混勻后，靜置分層，然后吸取下層溶液于管中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，利用氣相色譜檢測ΡΗΑ。檢測結(jié)果通過圖5可以看出，本發(fā)明方法中的重組大腸桿菌Ε. coli MG1655 Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phbCl能有效利用來自植物油脂的生物柴油副產(chǎn)物，有效積累琥珀酸和PHA。在積累25. 3g/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的4. 13%。實(shí)施例8、重組工程菌株 E. coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsG Δ sdhA Apta/ pUC-phaCl發(fā)酵來自動物油脂的生物柴油副產(chǎn)物菌種重組大腸桿菌E.coli MG1655 Δ fadR AatoC Δ ptsGAsdhA Apta/ pUC-phaCl。所述發(fā)酵基本培養(yǎng)基生物柴油副產(chǎn)物(約含20g/L的甘油和4g/L的硬脂酸)，(NH4) 2HP043g/L，(NH4) H2PO4lg/L, KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素 100mg/L。(1)發(fā)酵培養(yǎng)用接種環(huán)調(diào)取平板上的菌種接入裝有50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基的300ml的三角瓶中，于 250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，然后以體積比計(jì)，按照1 %的接種量接入裝有200ml的培養(yǎng)基的IOOOml的三角瓶中，培養(yǎng)過夜，再以體積比計(jì)，按照5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，溶氧控制在50%以上， 利用2mol/L的NaOH和lmol/L的HCl控制pH在6. 5-7. 5。培養(yǎng)至12h，加入IPTG至終濃度為0.4mM。發(fā)酵96h，每間隔4h取樣。(2)琥珀酸和PHA的檢測(I)琥珀酸的檢測將所取發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘。取上清，用 0.2μπι的濾膜過濾，然后利用HPLC(高壓液相色譜)檢測。檢測條件為檢測柱ΗΡΧ-87Η， BioRadLabs ；流動相5mM 溶液；檢測器示差檢測器。(II)PHA 的檢測收集細(xì)胞將所取的發(fā)酵液樣品在12，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心2分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞3次后，5，000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。樣品檢測將上述制得的5mg干菌體，加入850 μ 1的甲醇，150 μ 1的98%硫酸和 Iml的氯仿。沸水浴中加熱60分鐘，然后利用Iml的雙蒸水，劇烈混勻后，靜置分層，然后吸取下層溶液于管中，經(jīng)微孔濾膜過濾后，利用氣相色譜檢測ΡΗΑ。(III)發(fā)酵結(jié)果通過圖6的檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明的重組大腸桿菌Ε. coliMG1655AfadRAa toC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/pUC-phaCl能有效利用來自動物油脂的生物柴油副產(chǎn)物，有效積累琥珀酸和PHA。在積累26. lg/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的3. 42%。
權(quán)利要求
1.利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，步驟包括(1)構(gòu)建好氧發(fā)酵琥珀酸的大腸桿菌；(2)在構(gòu)建的好氧發(fā)酵琥珀酸的大腸桿菌中構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑；獲得可同時(shí)生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌；或者(1)在大腸桿菌中構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯合成途徑；(2)在構(gòu)建的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的大腸桿菌中構(gòu)建好氧發(fā)酵琥珀酸的途徑；獲得可同時(shí)生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌；(3)利用構(gòu)建的重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯；其特征是步驟(1)所述構(gòu)建好氧發(fā)酵琥珀酸的大腸桿菌的方法是通過Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌E. coli中敲除中長鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(fadR)、短鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(atoC)、碳源代謝途徑中的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II (ptsG)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhA)及乙酸生成途徑(Pta-ackA)，構(gòu)建好氧產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌菌株 E. col i Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta ；步驟(2)所述在構(gòu)建的好氧發(fā)酵琥珀酸的大腸桿菌中構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑的方法是將來源于假單胞菌屬(I^seudomonas)的聚羥基脂肪酸酯合成酶基因 phaC 克隆至質(zhì)粒 pBluescript SK_、pUC18、pUC19、pCL1920 或 pTrc99-A 中獲得聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒p-phaC，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌琥珀酸發(fā)酵菌株 E. coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta中，獲得聯(lián)產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌 E. col i Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/p-phaC ；或者步驟(1)所述在大腸桿菌中構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑的方法是將來源于假單胞菌(Pseudomonas)的聚羥基脂肪酸酯合成酶基因phbC克隆至質(zhì)粒pBluescript SK_、pUC 18、pUC 19、pCL 1920或pTrc99_A中獲得聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒p-phaC，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli，得含聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑的大腸桿菌E. coli/p-phaC ；步驟( 所述在構(gòu)建的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的大腸桿菌中構(gòu)建好氧發(fā)酵琥珀酸的途徑的方法是通過Red重組系統(tǒng)在含聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑的大腸桿菌 E.coli/p-phaC中敲除中長鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(fadR)、短鏈脂肪酸代謝阻遏物基因(atoC)、碳源代謝途徑中的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)II (ptsG)、琥珀酸脫氫酶基因(sdhA) 及乙酸生成途徑(Pta-ackA)，獲得聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯和琥珀酸的重組大腸桿菌 E.coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/p-phaC ；步驟C3)所述利用構(gòu)建的重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 72h ；發(fā)酵罐溫度設(shè)為30 40°C，溶氧控制在50%以上，pH 6. 5 7. 5，發(fā)酵時(shí)間 72h 150h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述敲除基因fadR、atoC、ptsG、sdhA和pta所用的引物分別為pKD-fadR primer 1 .5 ‘ -GAGTCCAACTTTGTTTTGCTGTGTTATGGAAATCTCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3‘
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述用于表達(dá)聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PhaC優(yōu)選來源于銅綠假單胞菌的聚羥基脂肪酸酯合成酶(PhaC)基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述用于表達(dá)聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PhaC優(yōu)選來源于銅綠假單胞菌的phaCl 基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是在構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯發(fā)酵途徑中獲得聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PtibCl所用的引物分別為phaCl primer 1 5 ‘ -CCCAAGCTTAAAGGAGGAAAATCATGAGTCAGAAGAACAATAACGAGC-3‘phaCl primer 2 /5 ‘ -AATCTCGAGTCATCGTTCATGCACGTAGGTTCCG-3‘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述用于表達(dá)聚羥基脂肪酸酯合成酶基因PlibCl的質(zhì)粒選pUC19。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述用于生產(chǎn)琥珀酸和PHA的大腸桿菌E. coli出發(fā)菌株屬于大腸桿菌 E. colik-12 系列，優(yōu)選 k-12 系列中的 E. coli MG1655。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是所述聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯和琥珀酸的重組大腸桿菌 E. coli Δ fadR Δ atoC Δ ptsG Δ sdhA Δ pta/p-phaC 1 選大腸桿菌Ε. coliMG1655 Δ fadR Δ at oCΔptsGΔsdhAΔpta/pUC-phaCl。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟C3)所述發(fā)酵條件是搖瓶溫度設(shè)為37°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48h 60h ；發(fā)酵罐溫度設(shè)為37°C，溶氧控制在50%以上，pH 7. O，發(fā)酵時(shí)間60h 120h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法， 其特征是步驟C3)所述利用構(gòu)建的重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為含10-60g/L的甘油和l-10g/L的脂肪酸的生物柴油副產(chǎn)物，(NH4) 2HP043g/L, (NH4) H2PO4lg/L, KCl 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，酵母粉 3g/L，氨芐青霉素，100mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生物柴油副產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸和聚羥基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明通過在同一大腸桿菌中構(gòu)建同時(shí)利用甘油和脂肪酸(C8-C18)的途徑，實(shí)現(xiàn)了對生物柴油產(chǎn)業(yè)中的副產(chǎn)物甘油和脂肪酸的發(fā)酵利用，獲得了高附加值的化工原料琥珀酸和生物材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)；實(shí)驗(yàn)表明本方法在積累25.3g/L～26.1g/L的琥珀酸的同時(shí)，PHA積累達(dá)到了細(xì)胞干重的3.42％～4.13％，為降低生物柴油產(chǎn)業(yè)的污染和成本，實(shí)現(xiàn)生物柴油產(chǎn)業(yè)中琥珀酸和PHA的低成本、高效率的聯(lián)產(chǎn)開辟了新的途徑。
文檔編號C12R1/19GK102154387SQ20101060565
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者康振, 祁慶生 申請人:山東大學(xué)