專利名稱：一種提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘變育種及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種提高ε -聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
ε -聚賴氨酸(ε -polylysine, ε -PL)是20世紀(jì)80年代由日本首先發(fā)現(xiàn)的一種新型、安全、高效的防腐保鮮劑。在中性和偏酸性條件下對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌、酵母及其他真菌、病毒都有抑制作用，具有抗菌譜廣等特性。在歐美日等發(fā)達(dá)國(guó)家，ε -聚賴氨酸已被批準(zhǔn)用于食品防腐劑，主要用于肉制品、高鹽食品、快餐、色拉、蛋糕和面點(diǎn)類食品。由于聚賴氨酸是一種營(yíng)養(yǎng)型抑菌劑，抑菌范圍較廣，成為高附加值的生物防腐保鮮劑。另外，ε -聚賴氨酸富含陽離子，被廣泛用于醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥制造領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景。日本是生物發(fā)酵法生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的主要國(guó)家，采用誘變育種是選育高產(chǎn)突變菌株行之有效的方法，誘變育種包括誘變和篩選兩步，用誘變劑使細(xì)胞核物質(zhì)發(fā)生突變，從變異群體中篩選出的菌株再進(jìn)行誘變，然后再篩選，通過誘變和篩選的交替進(jìn)行，選育出高產(chǎn)菌株，自然篩選分離出的白色鏈霉菌菌株產(chǎn)聚賴氨酸的能力很低，從而限制了對(duì)它的進(jìn)一步研究和利用。為了提高生物發(fā)酵法生產(chǎn)ε_(tái)聚賴氨酸的產(chǎn)量，本發(fā)明對(duì)白色鏈霉菌菌株采用了微波、化學(xué)試劑誘變的方法，以此提高該菌株發(fā)酵產(chǎn)量，為大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸提供科學(xué)的理論依據(jù)和有效的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高ε -聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其是通過微波、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法，顯著提高白色鏈霉菌CGMCC 4. 121的正突變率，從而獲得高產(chǎn)菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種提高聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其是將白色鏈霉菌CGMCC 4. 121的菌懸液在室溫下以200r/min 250r/min振蕩培養(yǎng)Ih 釙小時(shí)，然后進(jìn)行微波和硫酸二乙酯復(fù)合誘變，將誘變后的白色鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸。前述的方法，所述白色鏈霉菌CGMCC 4. 121的菌懸液是將白色鏈霉菌CGMCC 4. 121與生理鹽水混合形成濃度為IO6 IO8個(gè)細(xì)胞/mL。前述的方法，微波的條件為M50MHz，850W，微波的時(shí)間為20 70s，優(yōu)選為30 50s，更優(yōu)選為40s。前述的方法，所述硫酸二乙酯的濃度為1 ν/ν % 4ν/ν %，處理時(shí)間為60 120min，優(yōu)選為70 90min，更優(yōu)選為80min。前述的方法，誘變后的白色鏈霉菌使用篩選平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述篩選平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、酵母膏4g/L、小麥胚芽lg/L和瓊脂粉20g/L，以水配制；培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時(shí)間7 8天。
前述的方法，誘變后的白色鏈霉菌使用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖 50g/L、(NH4)2SO4 10g/L, K2HPO4 1. 6g/L, KH2PO4 0. 8g/L,MgSO4 0. 5g/L 和酵母膏5，以水配制，ρΗ6· 8，培養(yǎng)條件為280C，300r/min,培養(yǎng)時(shí)間7 8天。本發(fā)明提供的微波、化學(xué)試劑復(fù)合誘變的方法能夠顯著提高白色鏈霉菌的正突變率，從而提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵水平。結(jié)果表明ε-聚賴氨酸搖瓶發(fā)酵水平由0.60g/L提高到0. 85g/L，該方法簡(jiǎn)單易行。此外，本發(fā)明提供的方法對(duì)其他菌株的誘變具有一定的借鑒意義。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11)平板篩選培養(yǎng)將白色鏈霉菌str印tomyces albulus (CGMCC4. 121)在無菌條件下接種于平板篩選培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7 8d。2)將步驟1)培養(yǎng)的菌種挑選80株在無菌條件下接種到發(fā)酵瓶中J8°C，300r/ min，恒溫培養(yǎng)8d。其中步驟1)使用的篩選平板培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖10，酵母膏4，小麥胚芽1， 瓊脂粉20。其中步驟2)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖50，(NH4)2SO4 10, K2HPO4 1.6， KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。發(fā)酵培養(yǎng)過程條件下，300r/min，恒溫培養(yǎng)8d，平均發(fā)酵水平達(dá)到0. 60g/L。實(shí)施例21)將白色鏈霉菌與生理鹽水混合形成濃度為IO6個(gè)細(xì)胞/mL。經(jīng)200r/min振蕩培養(yǎng)1小時(shí)后進(jìn)行微波輻射20s，再經(jīng)硫酸二乙酯處理60min，立即涂篩選平板進(jìn)行培養(yǎng)。2)平板篩選培養(yǎng)將經(jīng)過復(fù)合誘變的白色鏈霉菌str印tomyces albulus (CGMCC 4. 121)在無菌條件下接種于篩選平板培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)7 8d。3)將步驟幻培養(yǎng)的菌種隨機(jī)挑選80株在無菌條件下接種到發(fā)酵瓶中J8°C， 300r/min，恒溫培養(yǎng)8d。其中步驟幻使用的篩選平板培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖10，酵母膏4，小麥胚芽1， 瓊脂粉20。其中步驟3)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖50，(NH4)2SO4 10，K2HPO4 1.6, KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。發(fā)酵培養(yǎng)過程條件下，300r/min，恒溫培養(yǎng)8d，平均發(fā)酵水平達(dá)到0. 78g/L。實(shí)施例31)將白色鏈霉菌與生理鹽水混合形成濃度為IO8個(gè)細(xì)胞/mL。經(jīng)200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)1小時(shí)后進(jìn)行微波輻射40s，再經(jīng)乙酸二乙酯處理80min，立即涂篩選平板進(jìn)行培養(yǎng)。2)平板篩選培養(yǎng)將經(jīng)過復(fù)合誘變的白色鏈霉菌str印tomyces albulus (CGMCC 4. 121)在無菌條件下接種于平板篩選培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)78d。3)將步驟幻培養(yǎng)的菌種隨機(jī)挑選80株在無菌條件下接種到發(fā)酵瓶中J8°C， 300r/min，恒溫培養(yǎng)8d。
其中步驟幻使用的平板篩選培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖10，酵母膏4，小麥胚芽1， 瓊脂粉20。其中步驟3)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):葡萄糖50，(NH4)2SO4 10, K2HPO4 1.6， KH2PO4 0. 8，MgSO4 0. 5，酵母膏 5，ρΗ6· 8。發(fā)酵培養(yǎng)過程條件下，300r/min，恒溫培養(yǎng)8d，平均發(fā)酵水平達(dá)到0. 85g/L。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，將白色鏈霉菌CGMCC 4. 121的菌懸液在室溫下以200r/min 250r/min振蕩培養(yǎng)Ih 5h，然后進(jìn)行微波和硫酸二乙酯復(fù)合誘變，將誘變后的白色鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)聚賴氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述白色鏈霉菌CGMCC4. 121的菌懸液是將白色鏈霉菌CGMCC 4. 121與生理鹽水混合形成濃度為IO6 IO8個(gè)細(xì)胞/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，微波的條件為M50MHz，850W，微波的時(shí)間為20 70s。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，微波的時(shí)間為30 50s。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，微波的時(shí)間為40s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述硫酸二乙酯的濃度為lv/v% 4v/v%，處理時(shí)間為60 120min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，硫酸二乙酯的處理時(shí)間為70 90min。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，硫酸二乙酯的處理時(shí)間為80min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，誘變后的白色鏈霉菌使用篩選平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述篩選平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、酵母膏4g/L、小麥胚芽lg/L和瓊脂粉20g/L，以水配制；培養(yǎng)溫度為^°C，培養(yǎng)時(shí)間7 8天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，誘變后的白色鏈霉菌使用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 10g/L、K2HPO4 1. 6g/L、 KH2PO4 0. 8g/L、MgS04 0. 5g/L 和酵母膏 5，以水配制，pH6. 8，培養(yǎng)條件為 28°C，300r/min，培養(yǎng)時(shí)間7 8天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其是通過微波、硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法，顯著提高白色鏈霉菌CGMCC4.121的正突變率，從而獲得高產(chǎn)菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸，結(jié)果表明ε-聚賴氨酸搖瓶發(fā)酵水平由0.60g/L提高到0.85g/L。
文檔編號(hào)C12N13/00GK102154392SQ20101060920
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者張海濤, 李榮杰 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司