專利名稱：一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種和培養(yǎng)基及其培養(yǎng)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及具有高溫條件下有效降解纖維素能力的厭氧細(xì)菌復(fù)合系及其培養(yǎng)，以及該菌系對(duì)纖維素分解的產(chǎn)物作為培養(yǎng) SRB(Sulfate-reducing Bcteria)的碳源。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三種成分組成，它們相互結(jié)合形成復(fù)雜的超分子復(fù)合物。木質(zhì)纖維素被分解為小分子有機(jī)物后，可用作肥料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽飼料以促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，可用作沼氣發(fā)酵以及乙醇生產(chǎn)的原料而獲得清潔能源。因此，分離培養(yǎng)具有纖維素分解能力的微生物，將廉價(jià)的可再生植物纖維素資源轉(zhuǎn)化為對(duì)環(huán)境友好的產(chǎn)品，變廢為寶，是解決我國能源與環(huán)境問題、實(shí)現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。
此外，利用硫酸鹽還原菌處理酸性礦山廢水具有成本低、適用性強(qiáng)、無二次污染、 可以回收酸性礦山廢水中的重金屬等特點(diǎn)。該方法中的工作主體硫酸鹽還原菌的生長需要外加額外的碳源才能完成，目前現(xiàn)有工藝中使用的碳氮源通常為化學(xué)藥品，價(jià)格較貴，藥劑消耗成本高，不利于在工業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。因此選擇適于細(xì)菌生長的、廉價(jià)的、甚至于作為廢棄物的有機(jī)質(zhì)，作為硫酸鹽還原菌的碳源用以培養(yǎng)菌種是實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種，菌種名稱為 Thermoanaerobacterium sp. L_D，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)， 保藏日2008年10月17日，保藏登記號(hào)CCTCC NO :M208166)該菌系對(duì)濾紙具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)稻草亦表現(xiàn)了較強(qiáng)的分解能力。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可以富集、分離、培養(yǎng)纖維素分解菌的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用該纖維素分解菌系高溫發(fā)酵稻草的分解產(chǎn)物作碳源培養(yǎng)SRB的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明所用的富集分離纖維素分解菌的樣品為活性污泥。
本發(fā)明使用的菌種富集分離培養(yǎng)基為
酵母粉(Yeastextract)1-5. OOg
氯化銨(NH4Cl)0. 5-2. 5g
硫酸鎂(MgS04x7H20)0. 5_2g
濾紙條12X120_
磷酸氫二鉀(K2HPO4)0. 1-0. 5g
三氯化鐵(FeCl3)
氯化鈉(NaCl)
普通自來水
pH1000. OOml
鑒于以上兩點(diǎn)，本發(fā)明通過富集分離的一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種 (該菌名稱為ThermoanaercAacterium sp. L-D，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2008年10月17日，保藏登記號(hào)CCTCC NO :M208166)有效降解纖維素，并利用降解纖維素的小分子產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)硫酸鹽還原菌(SRB)。
本發(fā)明采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)對(duì)纖維素分解復(fù)合菌系中微生物種群組成進(jìn)行分析。


圖1為本發(fā)明菌種的相差顯微鏡照片
圖2為復(fù)合菌系對(duì)濾紙和稻草的分解情況
圖3SRB的生長情況(大量FeS黑色沉淀形成)
本發(fā)明利用該復(fù)合菌系高溫降解稻草的產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)SRB。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
實(shí)施例1、高溫降解纖維素厭氧復(fù)合菌系L-D的獲得
培養(yǎng)基制作每升培養(yǎng)基(自來水)含有如下組分酵母粉，3g;K2HP04，1.5g; MgSO4 · 7H20, Ig ；NaCl，2g ；NH4Cl, 0. 6g ；FeCl3,0. 005g ；ρΗ7· 5。
稱取相應(yīng)藥品倒入事先裝有部分蒸餾水的燒杯中，藥品充分溶解后用蒸餾水定容至990ml，調(diào)pH到7. 2，最后定容到1000ml。將20ml培養(yǎng)基分裝到18X 150mm的螺口厭氧管(預(yù)先放置12X 120mm的濾紙條)中，并用真空抽換氣裝置除氧，121°C高壓蒸汽滅菌。
FeCl3配制成lg/L的儲(chǔ)存液。按比例稱取剩余相應(yīng)藥品倒入事先裝有部分自來水的燒杯中，藥品充分溶解后用自來水定容至990ml，加入6ml的FeCl3儲(chǔ)存液，調(diào)pH至7. 2， 最后定容到1000ml。
復(fù)合菌系的富集培養(yǎng)將1. Og厭氧活性污泥接入到滅好菌的培養(yǎng)基中，放入65°C 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。濾紙分解后用相同培養(yǎng)條件逐次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)接過程中，菌系對(duì)濾紙的分解能力不斷加強(qiáng)。轉(zhuǎn)接4-5次后，最終在20小時(shí)之內(nèi)即可將濾紙條完全泥化。將富集分離到的纖維素分解復(fù)合菌系保藏(該菌名稱為菌種名稱為ThermoanaercAacterium sp.L-D保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)，保藏日2008年10月17日， 保藏登記號(hào)CCTCC NO :M208166)。
實(shí)施例2、復(fù)合菌系中微生物種群組成進(jìn)行分析
本發(fā)明采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析復(fù)合菌系中微生物種群組成。技術(shù)路線為
總DNA提取一16S rDNA片段擴(kuò)增一與載體連接一轉(zhuǎn)化大腸桿菌一
篩選陽性克隆一酶切分型一測定序列一Blast比較分析
總DNA 的提取將 Iml 培養(yǎng)液放入 1. 5ml Eppendorf 管中，12000rpm，4°C離心 5min 收集菌體，用IXTES洗滌菌體2-3次。將菌體重新懸浮于435 μ 1 TES中打散菌體，加入溶菌酶(20mg/ml)125y 1，蛋白酶K(10mg/ml)2. 5μ 1，37°C水浴輕振保溫4小時(shí)，加入50 μ 1 20% SDS,于37°C水浴輕振保溫30分鐘，加入5M NaC104 125 μ 1，用等體積(560 μ 1)酚一氯仿一異戊醇05 24 1)抽提3-4次至界面無蛋白膜出現(xiàn)。吸取上層水相置于冰浴中加入1/10體積的3Μ NaAc-EDTA-Na2,加入2倍體積冷無水乙醇，翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5min。 12000rpm離心20min沉淀DNA。加入70%乙醇脫鹽，4°C過夜放置，7000rpm離心lOmin，吸出乙醇。風(fēng)干，加二次蒸餾水溶解。電泳檢查，調(diào)DNA濃度為25 μ g/ml。
PCR擴(kuò)增16S rDNA部分序列
選取通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTAC CTTGTT ACG ACT T_3')
PCR反應(yīng)體系(50 μ 1)
5Xbuffer10 μ 1
Mg2+(25mM)3 μ 1
dNTP(IOmM)1 μ 1
530F(50yM)0. 5μ 1
1490R(50yM)0. 5μ 1
Template DNA1 μ 1
GoTaq(Promega)0. 25 μ 1
ddH2033. 75 μ 1
PCR反應(yīng)條件
95 °C 2min
權(quán)利要求
1.一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種，其名稱為HiermoanaercAacterium sp. L-D, 保藏登記號(hào)為CCTCC NO :M208166，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi)。
2.一種厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種的富集、分離培養(yǎng)方法。
3.—種纖維素分解菌降解稻草的方法。
4.復(fù)合菌系分解稻草所得的產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)SRB的方法。
5.權(quán)利要求1所述的一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種，其特征在于該菌種是厭氧細(xì)菌復(fù)合菌系，通過利用16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析菌種中微生物種群組成表明， iM M M Thermoanaerobacterium polysaccharoIyticum> Τ. thermosaccharoIyticum> Τ. aciditolerans、Τ. thermosulfurigenes 4種不同的細(xì)菌組成，所占比例分別為37. 5%, 37. 5% 12. 5 和 12. 5%。
6.權(quán)利要求1所述的一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種，其特征在于該菌種的工作溫度為60-70°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于富集、分離培養(yǎng)該纖維素分解菌的培養(yǎng)基成分為酵母粉，l"5g ；氯化銨，0. 5-2. 5g ；硫酸鎂，0. 5-2g ；磷酸氫二鉀，0. 1-0. 5g ；三氯化鐵， l-5mg ；氯化鈉，2-4g ；普通自來水，IOOOml ；ρΗ，7· 0-8. 0。濾紙
8.權(quán)利要求3所述的一種纖維素分解細(xì)菌菌種對(duì)稻草分解的方法，其特征在于將稻草切成Icm的小段，加入1 % NaOH溶液浸泡M小時(shí)后用0. 5%的HCl清洗3次，將3% (w/ ν)裝入?yún)捬豕苤刑娲鸀V紙條，用酵母粉，3g ;Κ2ΗΡ04,1. 5g ；MgSO4 · 7H20, Ig ；NaCl,2g ；NH4Cl, 0.68疋冗13，0.0058;仏自來水，？!1為7.5配制成培養(yǎng)基并分裝、除氧、滅菌，5(% (ν/ν)的量接種本發(fā)明的厭氧復(fù)合菌系，65°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2-3周后大部分稻草被分解。
9.權(quán)利要求4所述的復(fù)合菌系分解稻草所得的產(chǎn)物作為碳源培養(yǎng)SRB的方法，其特征在于培養(yǎng)SRB時(shí)，降解產(chǎn)物用量為20-40% (10-20ml)
全文摘要
本發(fā)明提供一株高溫、厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種(Thermoanaerobacterium sp.L-D，保藏登記號(hào)為CCTCC NOM208166，保藏日2008年10月17日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)內(nèi))，該菌種對(duì)濾紙具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)稻草亦表現(xiàn)了較強(qiáng)的分解能力，同時(shí)提供該種厭氧的纖維素分解細(xì)菌菌種的富集、分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并將該復(fù)合菌系降解稻草的產(chǎn)物用于培養(yǎng)SRB的方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102533580SQ20101061853
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉興宇, 劉文彥, 張躍紅, 陳勃偉 申請(qǐng)人:北京有色金屬研究總院