專利名稱：一種魚類腸道粘膜細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物腸道粘膜細(xì)胞分離和培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種魚類腸道粘膜細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是動(dòng)物的結(jié)構(gòu)和功能的基本組成單位，利用培養(yǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能損傷作用機(jī)理等基礎(chǔ)理論研究、新型藥物篩選、新型飼料添加劑研究等眾多研究領(lǐng)域得到廣泛性的使用，與活體動(dòng)物(魚類)相比較，具有研究周期短、實(shí)驗(yàn)條件容易控制、 可以實(shí)現(xiàn)批量化的規(guī)模性實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，且使用原代培養(yǎng)細(xì)胞較使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難度降低、實(shí)驗(yàn)成本降低，也更接近于魚體自身生理?xiàng)l件。魚類是生活于水域環(huán)境的變溫動(dòng)物，與陸生恒溫動(dòng)物在許多方面有顯著性的差異。現(xiàn)代基礎(chǔ)科學(xué)研究和水產(chǎn)藥物、水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要建立魚類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃脱芯康膶?shí)驗(yàn)平臺(tái)，這是推動(dòng)魚類基礎(chǔ)研究和相關(guān)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究發(fā)展的重要關(guān)鍵性領(lǐng)域。魚類腸道粘膜細(xì)胞是研究魚類消化和吸收生理機(jī)制、飼料非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)腸道損傷與修復(fù)機(jī)制、篩選防治腸道粘膜細(xì)胞損傷的藥物或飼料添加劑的重要基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)驗(yàn)平臺(tái)， 具有重要的意義。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，魚類腸道粘膜細(xì)胞研究領(lǐng)域目前還沒(méi)有成熟的細(xì)胞系，因此只能利用腸道粘膜原代細(xì)胞作為細(xì)胞材料。利用從健康魚體腸道分離腸道粘膜細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)，以原代培養(yǎng)的粘膜細(xì)胞作為不同實(shí)驗(yàn)研究材料仍然面臨下列難題
(1)利用膠原蛋白酶分離腸道粘膜細(xì)胞是動(dòng)物腸道粘膜細(xì)胞分離主要的技術(shù)，但傳統(tǒng)方法主要適合陸生恒溫動(dòng)物如小白鼠、大鼠、家禽等，對(duì)于水生的變溫動(dòng)物不完全適用，具體地，首先，現(xiàn)有技術(shù)中適用于陸生恒溫動(dòng)物腸道粘膜細(xì)胞分離的膠原蛋白酶種類、酶濃度不適用于魚類腸道粘膜細(xì)胞分離；其次，傳統(tǒng)的方法是將腸道剪碎后進(jìn)行膠原蛋白酶的消化處理，但得到的細(xì)胞、組織塊、死細(xì)胞等混雜，是細(xì)胞的分離難度很大，同時(shí)，破碎的細(xì)胞、組織是細(xì)胞內(nèi)溶酶體釋放出很多水解酶類，對(duì)分離的細(xì)胞產(chǎn)生較大的影響。因此，需要研究一種適用于魚類的腸道粘膜細(xì)胞的消化分離方法，要求得到純凈的、生理功能性完整的粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)；
⑵現(xiàn)有技術(shù)中，通常采用鼠尾膠原作為細(xì)胞培養(yǎng)和生長(zhǎng)的細(xì)胞支持載體，但是效果不理想，因此需要篩選適用于魚類細(xì)胞培養(yǎng)、生長(zhǎng)的細(xì)胞支持載體。我們利用魚皮膠原蛋白作為魚類腸道粘膜細(xì)胞培養(yǎng)的支持載體，細(xì)胞生長(zhǎng)效果、細(xì)胞功能性顯著優(yōu)于利用鼠尾膠原的效果；
⑶需要調(diào)整魚類腸道粘膜細(xì)胞接種的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)濃度，含有一定量的粘膜細(xì)胞團(tuán)更有利于魚類腸道粘膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其是新生培養(yǎng)細(xì)胞的凝聚效果更好；
⑷現(xiàn)有技術(shù)中，適用于陸生恒溫動(dòng)物的細(xì)胞原代培養(yǎng)的條件不適用于魚類，因?yàn)?，例如魚類是長(zhǎng)期生活在水域環(huán)境中的變溫水生動(dòng)物，其腸道粘膜細(xì)胞的培養(yǎng)條件如溫度等與陸生恒溫動(dòng)物有很大的差異；魚類是生活在水域環(huán)境中，魚類細(xì)胞生長(zhǎng)需要的參透壓與陸生動(dòng)物有差異，魚類細(xì)胞培養(yǎng)液要做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種魚類腸道粘膜細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，包括取材和培養(yǎng)兩個(gè)步驟，其中，所述取材步驟包括消化和分離、步驟，具體為
1、消化按照常規(guī)方法取出魚的腸道，清除腸道外脂肪，然后采用下述兩種方法中的任一種消化分離魚類腸道粘膜細(xì)胞，得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液
方法一使用含抗生素的D-HankS液沖洗腸道粘膜表面，去除腸道粘膜表面的黏液與雜物，然后結(jié)扎腸道的一端，向腸道內(nèi)灌注體積為509Γ70%腸道內(nèi)容積的混合消化液，結(jié)扎剩余的腸道一端；然后在25 30°C水浴中消化20 40min，再向腸道加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 6% 新生牛血清的DMEM，用鑷子提起腸道的兩端，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化；放出含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，備用；
方法二 將腸道完全翻轉(zhuǎn)，黏膜面朝外，腸壁朝內(nèi)，使用含抗生素的D-Hanks液沖洗腸道粘膜表面，，去除腸道粘膜表面的黏液與雜物，然后結(jié)扎腸道的兩端，將腸道浸沒(méi)在混合消化液中，在25 30°C水浴中消化20 40min，再向混合消化液中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 6%新生牛血清的DMEM，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化；取出腸道，得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，備用；
2、分離取步驟1所得含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，在300r/min 500r/min 的轉(zhuǎn)速下離心3 5min，得到粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物，以所得粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物作為原代培養(yǎng)的接種材料細(xì)胞；
所述培養(yǎng)步驟中，以魚皮膠原蛋白作為培養(yǎng)支持載體，以改良的DMEM液作為培養(yǎng)基， 以改良的D-Hanks液作為平衡鹽溶液，按照2. 3 X IO4個(gè)/cm2 4. 7 X IO4個(gè)/cm2的粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)濃度，將粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物加入到培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度26 28°C下， PH7. 2-7. 4條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)24小時(shí)以上即可貼壁生長(zhǎng)。上述技術(shù)方案中，消化步驟中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法為使用前臨時(shí)在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、慶大霉素、鏈霉素，并且青霉素濃度為20萬(wàn)U/L、慶大霉素濃度為20萬(wàn)U/L、鏈霉素濃度為200mg/L ；所述混合消化液含膠原酶I 0. 15 0. 3mg/ ml、膠原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml，混合消化液的使用量為體重IOOg/尾左右的魚體大約需要3 8ml，DMEM的使用量為體重IOOg/尾左右的魚體大約需要3 8ml。上述技術(shù)方案中，分離步驟所得粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物中，細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量比為2.5 5比1。上述技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)支持載體魚皮膠原蛋的制備方法、魚皮膠原蛋白包被培養(yǎng)板的方法可參照申請(qǐng)?zhí)枮?01010288301. 0的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)，具體地，一種魚皮膠原蛋白的制備方法，包括原料處理、提取、鹽析、純化透析干燥步驟，其中，所述原料處理、提取步驟具體包括⑴原料處理清除魚鱗，將魚皮剪成碎粒，按照固液比為1 15 25，將氫氧化鈉(NaOH)水溶液加入魚皮碎粒，廣5°C下浸泡3 5h，用20目篩卷網(wǎng)過(guò)濾得魚皮濾渣，風(fēng)干；以魚皮濾渣的體積份為1份，用3飛份的無(wú)水乙醚于35、0°C回流3、h，除去魚皮的脂肪，然后風(fēng)干，得到除脂后的魚皮渣；其中，所述魚皮碎粒的尺寸約為2mmX2mmX2mm;所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0. 04M 0. 05M ；⑵提取按照固液比為1 50 70，將0. 5 0. 6M乙酸加入除脂后的魚皮渣中，浸提6(T80h，40目篩卷網(wǎng)過(guò)濾得到含魚皮膠原蛋白的濾液；重復(fù)進(jìn)行一次；所述原料選自草魚、斑點(diǎn)叉尾鮰或羅非魚的魚皮，魚皮可以是干燥的也可以是新鮮的；所述鹽析步驟為經(jīng)終濃度為2. 5M氯化鈉(NaCl)鹽析得到膠原蛋白沉淀；所述純化透析干燥步驟為將步驟⑶所得膠原蛋白沉淀溶解于0. 5M乙酸，然后先以0. 5M乙酸為透析外液進(jìn)行透析3飛次、再以雙蒸水作為透析外液進(jìn)行透析，直至透析外液檢測(cè)不到氯離子，以保留分子量IOOkDa以上的膠原蛋白；收集透析后的膠原蛋白液體，采用冷凍干燥方法進(jìn)行干燥，得到魚皮膠原蛋白。魚皮膠原蛋白包被培養(yǎng)板的方法具體為在對(duì)或96孔培養(yǎng)板中加入魚皮膠原蛋白1 3ml到每孔中，靜置5min，吸出多余的膠原；把培養(yǎng)板放入一干燥器中，另用一培養(yǎng)皿盛1 2ml氨水，蓋好干燥器；20min后取出培養(yǎng)板，放入4°C冰箱中存放；使用前用無(wú)菌D-Hanks清洗液清洗培養(yǎng)板3 5次，以IOmin內(nèi)保持血紅色作為清晰完畢的標(biāo)志。上述技術(shù)方案中，培養(yǎng)步驟中，所述改良的DMEM液中包含2 μ g/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子，2. 5mg/ml胰島素，8% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))新生牛血清，0. 85 1. 15mg/ml的谷氨酰胺，20 萬(wàn)U/L青霉素、20萬(wàn)U/L慶大霉素、200mg/L鏈霉素；使用時(shí)需要用水稀釋1. 4 1. 5倍體積；所述改良的D-Hanks液的配置方法為按照常規(guī)方法配制D-Hanks液，并通過(guò)改變NaCl 的濃度，調(diào)節(jié)滲透壓到225mmol/kg，成為改良的D-Hanks液，4°C下貯存，使用前用0. 22 μ m 過(guò)濾除菌；具體配置方法可以參考文獻(xiàn)吳康等，鯉血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及初步鑒定， 2001。上述技術(shù)方案中，所述魚優(yōu)選為體重90 IlOg/尾的健康魚，在取出腸道前該魚已被處死。由于上述技術(shù)方案的采用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、由于本發(fā)明創(chuàng)造性的優(yōu)化了適合魚類腸道粘膜細(xì)胞的消化分離方法(消化方式、消化液、消化條件)和原代培養(yǎng)方式(接種材料為細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物、改良的D-Hanks液、 改良的DMEM液)，結(jié)合傳統(tǒng)的動(dòng)物細(xì)胞分離、原代培養(yǎng)技術(shù)，建立魚類腸道粘膜細(xì)胞分離、原代培養(yǎng)的系統(tǒng)化技術(shù)，采用本發(fā)明所得魚類腸道粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)良好，結(jié)構(gòu)和功能性標(biāo)志性指標(biāo)體系完善，可以作為基礎(chǔ)研究、藥物篩選、飼料添加劑篩選等的試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮囼?yàn)平臺(tái)。2、本發(fā)明中魚類腸道粘膜細(xì)胞消化分離效果好與傳統(tǒng)的剪碎腸道分離腸道粘膜細(xì)胞的方法向比較，本發(fā)明選用組合的膠原蛋白酶對(duì)腸囊、翻轉(zhuǎn)腸囊進(jìn)行粘膜細(xì)胞的消化分離，粘膜細(xì)胞可以成多個(gè)細(xì)胞團(tuán)、或單個(gè)細(xì)胞從粘膜上分離出來(lái)，有效控制腸道其他組織中的雜細(xì)胞被分離、混雜在粘膜細(xì)胞中，得到的粘膜細(xì)胞純度很好，可以得到較多的粘膜細(xì)胞；同時(shí)，可以得到一定比例的細(xì)胞團(tuán)，以單個(gè)細(xì)胞一起作為原代培養(yǎng)的細(xì)胞種子，有利于腸道粘膜細(xì)胞的培養(yǎng)和生長(zhǎng)。3、本發(fā)明中以細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)混合作為原代培養(yǎng)的材料效果好使用細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)一起作為原代培養(yǎng)的接種材料細(xì)胞，更有利于細(xì)胞的離體培養(yǎng)生長(zhǎng)，也有效減少了在消化分離時(shí)過(guò)度消化對(duì)細(xì)胞的損傷，從實(shí)際效果分析，采用本發(fā)明，將腸囊、翻轉(zhuǎn)腸囊消化液在 300r/min 500r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 5min，得到的細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)的比例為1 :4左右，按照2. 3 X IO4個(gè)/cm2 4. 7 X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)濃度加入到培養(yǎng)液中，粘膜細(xì)胞修復(fù)時(shí)間縮短，很快就進(jìn)入生長(zhǎng)時(shí)期，且細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)效果好，細(xì)胞主要功能性指標(biāo)達(dá)到要求。4、本發(fā)明對(duì)D-Hanks液、魚類細(xì)胞DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行改良在參透壓、酸堿度、有效成分組成與劑量濃度等方面，研究得到了適合魚類腸道粘膜原代培養(yǎng)的D-Hanks液和DMEM 培養(yǎng)液，可以對(duì)魚類腸道粘膜細(xì)胞進(jìn)行批量處理、批量培養(yǎng)，且不同批次試驗(yàn)的重復(fù)性非常好。

5、利用本發(fā)明所述魚類腸道粘膜細(xì)胞可以成功建立基礎(chǔ)研究、藥物篩選、飼料添加劑篩選的細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ?、試?yàn)平臺(tái)的系統(tǒng)化技術(shù)，可以使這類試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮囼?yàn)平臺(tái)的建設(shè)實(shí)現(xiàn)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。說(shuō)明書附圖

圖la、lb為實(shí)施例一中經(jīng)過(guò)腸囊、翻轉(zhuǎn)腸囊消化得到的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行顯微光鏡分析結(jié)果圖2原代培養(yǎng)48h后生長(zhǎng)良好的草魚腸道粘膜細(xì)胞形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例一
一種魚類腸道粘膜細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟
⑴選用經(jīng)過(guò)強(qiáng)化腸道粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)的飼料培育2 3周后的試驗(yàn)材料魚腸道為材料， 所述材料魚的體重在90 IlOg/尾，平均體重為IOOg/尾；實(shí)驗(yàn)魚經(jīng)過(guò)酒精消毒后，在無(wú)菌室用剪刀搗碎魚體腦部，快速剖開魚腹，取出腸道，清除腸道外脂肪；
⑵將腸道制成腸囊或翻轉(zhuǎn)腸囊然后進(jìn)行消化，有效分離腸道粘膜細(xì)胞；然后在300r/ min 500r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 5min得到腸道粘膜細(xì)胞團(tuán)粘膜細(xì)胞比例達(dá)到1 :2. 5 5的混合細(xì)胞懸浮液，能滿足后續(xù)試驗(yàn)的接種濃度要求。所述將腸道制成腸囊然后進(jìn)行消化的過(guò)程為用注射器吸取D-Hanks液(臨時(shí)加入抗生素，濃度為20萬(wàn)U/L青霉素、20萬(wàn)U/L慶大霉素、200mg/L鏈霉素)灌注、沖洗腸道數(shù)次，沖出腸道中黏液與雜物。用細(xì)線結(jié)扎腸道一端。用注射器加入含膠原酶I 0.15 0. 3mg/ml、膠原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml的混合消化液60%充滿腸道(對(duì)于體重IOOg尾左右的魚體大約需要3 8ml)。結(jié)扎剩余的腸道一端。在28°C水浴消化20 40min。用注射器加入含5%新生牛血清的DMEM 3 8ml，用椰子提起腸道的兩端，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化。剪開腸囊一端，放出含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液供下一步試驗(yàn)。所述將腸道制成翻轉(zhuǎn)腸囊然后進(jìn)行消化的過(guò)程為右手拿住細(xì)竹簽或細(xì)鐵絲接觸到腸道一端的外壁，左手食指輕扶腸道外壁輕輕向細(xì)竹簽或細(xì)鐵絲方向推進(jìn)，使腸道套住細(xì)竹簽或細(xì)鐵絲將腸道完全翻轉(zhuǎn)，黏膜面朝外，腸壁朝內(nèi)。用吸管吸取D-Hanks液(臨時(shí)加入抗生素，濃度為20萬(wàn)U/L青霉素、20萬(wàn)U/L慶大霉素、200mg/L鏈霉素)反復(fù)沖洗腸道粘膜表面。用細(xì)線系結(jié)扎腸道的兩端，使消化液不能進(jìn)入空腔內(nèi)。將翻轉(zhuǎn)腸囊放入加入含膠原酶I 0. 15 0. 3mg/ml、膠原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml的混合消化液中(對(duì)于體重IOOg尾左右的魚體大約需要3 8ml)。在28°C水浴消化20 40min。加入含5 6%新生牛血清的 DMEM 3 8ml，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化。得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液供下一步試驗(yàn)。
對(duì)經(jīng)過(guò)腸囊、翻轉(zhuǎn)腸囊消化得到的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行顯微光鏡分析，得圖la、lb，可知經(jīng)過(guò)腸囊、翻轉(zhuǎn)腸囊消化得到的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)較為純凈，雜質(zhì)很少，細(xì)胞的功能裝填也非常好?；罴?xì)胞(團(tuán))比例越多、雜質(zhì)越少、細(xì)胞團(tuán)II與細(xì)胞團(tuán)III的總濃度越大，則相應(yīng)處理?xiàng)l件為最優(yōu)。不同消化時(shí)間所對(duì)應(yīng)的消化結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)不同消化時(shí)間的試驗(yàn)確定其最佳消化時(shí)間為20 40min。表1 不同消化時(shí)間細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的比例％
權(quán)利要求
1.一種魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，包括取材和培養(yǎng)兩個(gè)步驟，所述取材步驟包括消化和分離、步驟，其特征在于，1)消化步驟具體為按照常規(guī)方法取出魚的腸道，清除腸道外脂肪，然后采用下述兩種方法中的任一種消化分離魚類腸道粘膜細(xì)胞，得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液方法一使用含抗生素的D-HankS液沖洗腸道粘膜表面，去除腸道粘膜表面的黏液與雜物，然后結(jié)扎腸道的一端，向腸道內(nèi)灌注體積為50% 70%腸道內(nèi)容積的混合消化液，結(jié)扎剩余的腸道一端；然后在25 30°C水浴中消化20 40min，再向腸道加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5 6%新生牛血清的DMEM，用鑷子提起腸道的兩端，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化；放出含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，備用；方法二 將腸道完全翻轉(zhuǎn)，黏膜面朝外，腸壁朝內(nèi)，使用含抗生素的D-Hanks液沖洗腸道粘膜表面，去除腸道粘膜表面的黏液與雜物，然后結(jié)扎腸道的兩端，將腸道浸沒(méi)在混合消化液中，在25 30°C水浴中消化20 40min，再向混合消化液中加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 6% 新生牛血清的DMEM，反復(fù)振蕩5 8次，終止消化；取出腸道，得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，備用；2)分離步驟具體為取步驟1)所得含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，在300r/ min 500r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 5min，得到粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物，以所得粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物作為原代培養(yǎng)的接種材料細(xì)胞；所述培養(yǎng)步驟中，以魚皮膠原蛋白作為培養(yǎng)支持載體，以改良的DMEM液作為培養(yǎng)基， 以改良的D-Hanks液作為平衡鹽溶液，按照2. 3 X IO4個(gè)/cm2 4. 7 X IO4個(gè)/cm2的粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)濃度，將粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物加入到培養(yǎng)基中，在26 28°C培養(yǎng)的溫度下，pH7. 2-7. 4條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)，24小時(shí)以上即可貼壁生長(zhǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，消化步驟中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法為使用前臨時(shí)在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、慶大霉素、鏈霉素，并且青霉素濃度為20萬(wàn)U/L、慶大霉素濃度為20萬(wàn)U/L、鏈霉素濃度為 200mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述混合消化液含膠原酶I 0. 15 0. 3mg/ml、膠原酶IV 0. 15 0. 3mg/ml，消化步驟中，混合消化液的使用量為體重IOOg/尾左右的魚體需要3 8ml混合消化液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，消化步驟中，DMEM的使用量為體重IOOg/尾左右的魚體需要3 8ml的DMEM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，分離步驟所得粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物中，細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量比為2. 5 5比1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)步驟中，所述改良的DMEM液中包含2μ g/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子，2. 5mg/ml胰島素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的新生牛血清，0. 85 1. 15mg/ml的谷氨酰胺，20萬(wàn)U/L青霉素、20萬(wàn)U/L慶大霉素、200mg/L鏈霉素；使用時(shí)用水稀釋1. 4 1. 5倍體積。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)步驟中，所述改良的D-Hanks液的配置方法為按照常規(guī)方法配制D-Hanks液，并通過(guò)改變NaCl的濃度，調(diào)節(jié)滲透壓到225mmol/kg，成為改良的D-Hanks液，4°C下貯存，使用前用-0. 22 μ m過(guò)濾除菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述魚類腸道粘膜細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述魚的體重為90 IlOg/尾。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物腸道粘膜細(xì)胞分離和培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種魚類腸道粘膜細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，包括取材和培養(yǎng)兩個(gè)步驟按照常規(guī)方法取出魚的腸道，清除腸道外脂肪，然后采用下述兩種方法中的任一種消化分離魚類腸道粘膜細(xì)胞，得到含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液將所得含有游離粘膜細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的消化液，離心得到粘膜細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物，作為原代培養(yǎng)的接種材料細(xì)胞；所述培養(yǎng)步驟中，以魚皮膠原蛋白作為培養(yǎng)支持載體，以改良的DMEM液作為培養(yǎng)基，以改良的D-Hanks液作為平衡鹽溶液，在培養(yǎng)溫度26～28℃下，pH7.2-7.4條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)24小時(shí)以上即可貼壁生長(zhǎng)。采用本發(fā)明所得魚類腸道粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)良好，結(jié)構(gòu)和功能性標(biāo)志性指標(biāo)體系完善。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102168063SQ20101062010
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者葉元土, 周志剛, 姚仕彬, 張寶彤, 秦杰, 蔡春芳 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)