專利名稱：雙并四氫呋喃類木脂體4位特異性葡萄糖基轉移酶及編碼該酶的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自連翹(> > ￥ 3々)的雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉移酶(7 α 7，>型彡V f > 4位々^ 二一 7転移酵素)、編碼該酶的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體以及使用該載體得到的轉化體等。
背景技術：
木脂體作為植物次級代謝產(chǎn)物中的一種在植物界中廣泛分布(非專利文獻1 Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390)，其中具有有用的生物活性的木脂體已被用作藥品或健康食品。例如，已知在胡麻科(pedaliaceae)芝麻(sesamum indicum)中含有的主要的雙并四氫呋喃型木脂體具有抗氧化性、改善脂質代謝、保護肝功能等功效，并且已在市售(非專利文獻 2 :Nakai，M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非專利文獻 3 =Tsuruoka, T. et al. (2005) Biosci. Biotech. Biochem. 69，179—188 ；非專利文獻 4 Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49，2647—2651)。另一方面，在小檗科盾葉鬼臼(美洲八角蓮)的根中含有的作為芳基四氫萘內酯型(7 U > y卜，u >，々 卜 >型)的抗腫瘤性木脂體的鬼白毒素，因為其具有細胞分裂抑制活性，所以已被用作治癌劑及用于新型治癌劑的開發(fā)(非專利文獻5 :AyreS，D.C.和Loike，J.D. (1990) Lignans Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K.)。此外，認為大多數(shù)木脂體在攝取后，在體內代謝為具有類似雌性荷爾蒙活性的腸內酯，因此木脂體成為近年來引起關注的次級代謝產(chǎn)物(非專利文獻6:Heinonen，S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186)。木犀科(oleaceae)連翹(連翹屬(forsythia))是多年生木本植物，因其頑強而易于栽培，因開鮮艷的黃花故多被用作庭院灌木。另一方面，已知在連翹的葉子、種子以及花瓣中蓄積了豐富的具有抗氧化或抗炎癥活性的木脂體類，在亞洲(特別是中國和日本)將其葉子作為茶飲用。(非專利文獻7 :Guo，H. et al. (2007) Rapid Communications in Mass Spectrometry 21，715—729 ；非專利文獻 8 :Chang，M-J. et al. (2008) Biosci. Biotech. Biochem. 72，2750_2755)。與芝麻或亞麻等一年生草本植物不同，連翹不需要每年播種及育苗，可數(shù)年連續(xù)從葉子中獲取功能性木脂體，因此認為連翹是有用的次級代謝產(chǎn)物的分子育種目標。在木犀科連翹中木脂體的生物合成，通過由結構式(I’)(參照圖IA ；以下其它結構式也相同)的單木質醇進行氧化聚合生成結構式(Ia)的雙并四氫呋喃型木脂體而開始(非專利文獻 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非專利文獻 10:Suzuki，S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53, 273-284) 結構式(Ia)的木脂體，經(jīng)過結構式(IV)及結構式(V)的木脂體(非專利文獻11 =Dinkova-Kostova, A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271,29473-29482 ；非專利文獻 12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非專利文獻 13 :Min，Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非專利文獻 14 :Gang, D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527)，轉化為結構式(VI)的木脂體(非專利文獻15 :Xia，Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 12614-12623 ；非專利文獻 16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926)。其后在轉化為結構式(VII)的木脂體糖苷之前，需要進一步經(jīng)過多個酶反應。這些在連翹中的一系列木脂體生物合成體系中，僅確認出幾種酶活性，目前仍未分離出負責各反應的催化酶、或編碼這些酶的基因。雖然在連翹中含有的所有木脂體均以糖苷的形式穩(wěn)定存在， 但僅檢測出向結構式(VII)的木脂體的7位轉移糖的活性(非專利文獻17 =Berim, A. et al. (2008)Phytochemistry 69，374-381)，還未鑒定出其它的木脂體糖基轉移酶。另一方面，在芝麻中雖然大部分木脂體也以糖苷的形式存在，但僅鑒定出對于結構式(III)表示的木脂體的糖基轉移酶UGT71A9。該酶對結構式(III)的化合物的2位以外的位置或對其它木脂體化合物無活性。對于除此之外的木脂體的糖基轉移酶仍然不明確(非專利文獻 18 :0no, Ε. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，10116-10121 ；非專利文獻 19 Noguchi，Α.，et al. (2008)Plant J. 54，415-427)。通常情況下，植物中的糖基轉移酶的位置選擇性高，在相同或類似化合物的相同位置進行反應的糖基轉移酶之間的氨基酸序列在不同的種間保守，因此，可利用序列的同源性分離該酶。但是，即使為相同的或類似的化合物，在不同位置添加糖的糖基轉移酶的氨基酸序列的同源性低，極難于以在其它位置反應的糖基轉移酶的序列信息為基礎分離該酶。因此，即使是相同的木脂體化合物，也極難于以在上述結構式(III)化合物的2位添加糖的來自芝麻的UGT71A9的信息為基礎，類推在其它木脂體化合物、例如結構式(Ia)等的雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位上添加糖的糖基轉移酶的結構并將其分離?，F(xiàn)有技術文獻非專利文獻非專利文獻 1 =Umezawa, T. (2003) Phytochem. Rev. 2，371-390 ；非專利文獻2 =Nakai, M. et al. (2003) J. Agri. Food Chem. 51，1666-1670 ；非專禾Ij 文獻 3 :Tsuruoka，T. et al. (2005)Biosci. Biotech. Biochem. 69, 179-188 ；非專禾Ij 文獻 4 :Sirato-Yasumoto，S. et al. (2001) J. Agri. Food Chem. 49, 2647-2651 ；非專利文獻5 :Ayres,D. C. and Loike, J. D. (1990) Lignans =Chemical Biological and Clinical Properties. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U. K.；非專利文獻6 =Heinonen, S. et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，3178-3186 ；非專禾Ij 文獻 7:Guo，H. et al. (2007)Rapid Communications in Mass Spectrometry 21,715-729 ；非專禾Ij 文獻 8 :Chang，M-J. et al. (2008)Biosci. Biotech. Biochem. 72, 2750-2755 ；非專利文獻 9 =Davin, L. B. and Lewis, N. G. (2003) Phytochem. Rev. 2，257-288 ；非專利文獻10 =Suzuki, S. and Umezawa, Τ. (2007) J. Wood. Sci. 53，273-284 ；非專禾Ij文獻 11 :Dinkova-Kostova，A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 29473-29482 ；
非專利文獻12 =Nakatsubo, T. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283，15550-1557 ；非專利文獻13 :Min, Τ. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278，50714-50723 ；非專利文獻14 :Gang，D. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274，7516-7527 ；非專利文獻15 :Xia, Z-Q. et al (2001) J. Biol. Chem. 276，12614-12623 ；非專利文獻16 =Youn, B. et al (2005) J. Biol. Chem. 280，12917-12926 ；非專利文獻17 =Berim, A. et al. (2008) Phytochemistry 69，374-381 ；非專禾Ij文獻 18:0no，E.et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103， 10116-10121 ；非專利文獻19 =Noguchi, Α.，et al. (2008) Plant J. 54，415-427 ；

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題在這種狀況下，期望分離并鑒定出在雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位上添加糖的糖基轉移酶。解決技術問題的技術手段本發(fā)明是考慮到上述狀況而做出的發(fā)明，提供以下所示的多核苷酸(編碼雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉移酶的多核苷酸)、蛋白質(雙并四氫呋喃型木脂體 4位特異性葡萄糖基轉移酶)、含有該多核苷酸的載體以及導入了該載體的轉化體等。(1) 一種多核苷酸，其特征在于，為以下(a) (f)中任一項所述的多核苷酸(a) 一種多核苷酸，其含有由序列號3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸；(b) —種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸；(c) 一種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列中1 15個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(d) 一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(e) 一種多核苷酸，其含有與序列號3或5表示的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或者(f) —種多核苷酸，其含有與編碼序列號4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。(2)根據(jù)上述⑴所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(g)至(j)中任一項(g) 一種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列中10個以下的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(h) 一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；
(i) 一種多核苷酸，其含有與序列號3或5表示的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或者(j) 一種多核苷酸，其含有與編碼序列號4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。在上述(1)及O)的多核苷酸中，對木脂體的葡萄糖基轉移活性，包括例如對雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉移酶活性，更加具體地說，對雙并四氫呋喃型木脂體的4 位及/或4'位的羥基的葡萄糖基轉移酶活性。在此，所述雙并四氫呋喃型木脂體包括，例如下述結構式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體。
權利要求
1.一種多核苷酸，其特征在于，為以下(a) (f)中任一項所述的多核苷酸(a)一種多核苷酸，其含有由序列號3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸；(b)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸；(c)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列中1 15個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(d)一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號4或6表示的氨基酸序列有80%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(e)一種多核苷酸，其含有與序列號3或5表示的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或者(f)一種多核苷酸，其含有與編碼序列號4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，為以下(g) (j)中任一項所述的多核苷酸(g)一種多核苷酸，其含有編碼由序列號4或6表示的氨基酸序列中10個以下的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(h)一種多核苷酸，其含有編碼具有與序列號4或6表示的氨基酸序列有90%以上同源性的氨基酸序列、且具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；(i)一種多核苷酸，其含有與序列號3或5表示的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸；或者(j) 一種多核苷酸，其含有與編碼序列號4或6表示的氨基酸序列所組成的蛋白質的多核苷酸的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交、且編碼具有針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性的蛋白質的多核苷酸。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述針對木脂體的葡萄糖基轉移酶活性為針對雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉移酶活性。
4.根據(jù)權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述針對雙并四氫呋喃型木脂體的葡萄糖基轉移酶活性為針對雙并四氫呋喃型木脂體的4位及/或4'位的羥基的葡萄糖基轉移酶活性。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于，所述雙并四氫呋喃型木脂體為下述結構式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體
6.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有由序列號3或5表示的堿基序列組成的多核苷酸。
7.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有編碼由序列號4或 6表示的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
8.根據(jù)權利要求1 7中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為DNA。
9.一種蛋白質，其特征在于，所述蛋白質由權利要求1 8中任一項所述的多核苷酸編碼。
10.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1 8中任一項所述的多核苷酸。
11.一種轉化體，其特征在于，其中導入了權利要求1 8中任一項所述的多核苷酸。
12.—種轉化體，其特征在于，其中導入了權利要求10所述的載體。
13.—種制造權利要求9所述的蛋白質的方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求11或12所述的轉化體。
14.一種制造葡萄糖糖苷的方法，其特征在于，所述方法包括以權利要求9所述的蛋白質為催化劑，由UDP-葡萄糖和糖基受體底物生成葡萄糖苷。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于，所述糖基受體底物為雙并四氫呋喃型木脂體。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其特征在于，所述雙并四氫呋喃型木脂體為下述結構式(la)、(Ib)或(Ic)所表示的木脂體
全文摘要
本發(fā)明提供編碼雙并四氫呋喃型木脂體4位特異性葡萄糖基轉移酶的多核苷酸等。所述多核苷酸含有包含序列號3或5表示的堿基序列的多核苷酸或編碼包含序列號4或6表示的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸。
文檔編號C12N1/15GK102428181SQ20108002199
公開日2012年4月25日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2009年5月19日
發(fā)明者佐竹炎, 小野榮一郎, 金賢仲 申請人:三得利控股株式會社