專利名稱：施用針對登革病毒的疫苗的組合物和方法
施用針對登革病毒的疫苗的組合物和方法優(yōu)先權(quán)
本申請要求在2009年6月01日提交的臨時美國專利申請序列號61/183，020在 35USC§ 119(e)下的權(quán)益，其以其全部內(nèi)容通過引用并入本文。MM本發(fā)明的實施方式報道了用于將針對登革病毒的疫苗施用給對象的組合物和方法。在一些實施方式中，疫苗組合物可通過皮內(nèi)注射施用。在某些實施方式中，在對象中皮內(nèi)注射針對登革病毒的疫苗可包括在最初接種之后一次或多次皮內(nèi)加強(boost)。其他實施方式包括皮內(nèi)注射針對登革病毒的疫苗組合物，其中所述組合物提供針對一種以上血清型登革病毒諸如DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的保護(防護，protection)。^M,針對病毒感染的防護疫苗已經(jīng)被有效地用于降低人類疾病的發(fā)病率。病毒疫苗最成功的技術(shù)之一是用削弱的或減毒的病毒毒株(“活的減毒病毒”)免疫動物或人。由于免疫后有限的復(fù)制，減毒株沒有引起疾病。然而，有限的病毒復(fù)制足以表達病毒抗原的全部組成成分，并且能產(chǎn)生對病毒有效且持久的免疫反應(yīng)。因此，在隨后暴露于病毒的致病毒株之后，免疫的個體受到保護免于生病。這些活的減毒病毒疫苗在用于公共健康的最成功的疫苗之列。鍵本發(fā)明的實施方式一般涉及通過例如給對象施用針對登革病毒的疫苗在對象中引起對登革病毒的防護的方法和組合物。一些實施方式可包括經(jīng)由皮內(nèi)(ID)注射向?qū)ο笾幸胍呙缃M合物。根據(jù)這些實施方式，疫苗組合物可被皮內(nèi)引入到對象中，以例如防護一種或一種以上登革血清型(例如，交叉保護)。在某些實施方式中，疫苗組合物可包括但不限于施用給對象的單劑量一種血清型登革病毒(例如，DENVax 4)。在其它實施方式中，疫苗組合物可包括但不限于；初始劑量的一種血清型登革病毒(例如，DENVax 4或其它血清型)以及隨后相同的、組合型或不同血清型的一次或多次加強可被施用給對象。本文的其它方面可涉及通過例如經(jīng)由皮內(nèi)引入將疫苗組合物引入對象而在對象中誘發(fā)細胞免疫反應(yīng)，其中疫苗組合物包括但不限于登革病毒疫苗。根據(jù)這些實施方式， 所公開的組合物可被皮內(nèi)施用給對象，用于調(diào)節(jié)對象中針對登革病毒血清型的中和抗體產(chǎn)生。一些方面涉及在單一疫苗組合物中各種血清型登革病毒或其片段或其減毒組合物的預(yù)定組成比例(例如，1 1、1 2、1 4，考慮兩種或更多種血清型的任何比例)，以當(dāng)對象被皮內(nèi)施用單一疫苗組合物時在對象中增加針對一些或所有登革病毒血清型的交叉保護。在某些實施方式中，采用皮內(nèi)引入針對登革病毒的疫苗的一些益處可包括但不限于，在對象中針對一些或所有登革病毒血清型的多重防護，通過采用小劑量與皮下注射相比成本降低，在對象中調(diào)節(jié)針對一些或所有登革病毒血清型產(chǎn)生的抗體，以及在施用了針對登革病毒的疫苗組合物的對象中的施用部位處的疼痛減少。在一些實施方式中，針對登革病毒的單劑量疫苗可包括一種或多種登革病毒血清型(一種或多種)。根據(jù)這些實施方式，對象可用在與第一次注射分開的部位一例如對象上鄰近的部位或者分離的解剖學(xué)部位處施用的至少一次另外的皮內(nèi)注射(一次或多次)進行治療。此外，至少一次另外的皮內(nèi)注射(一次或多次)可在給對象第一次施用后少于30 天進行。本文公開的這些或其它實施方式的疫苗組合物可包括預(yù)定比例的兩種或更多種登革病毒血清型。附圖簡述下列附圖構(gòu)成本說明書的部分并且被包括以進一步說明某些實施方式。一些實施方式可通過僅僅參考這些附圖中的一幅或多幅或者與所提供的具體實施方式
的詳述組合而更好地理解。

圖1顯示目前可用的皮內(nèi)注射裝置的實例。圖2顯示在皮內(nèi)引入針對登革病毒的疫苗的對象中的注射部位的實例。圖3顯示針對登革病毒的疫苗的皮下和皮內(nèi)注射以及在初次施用后針對不同登革病毒血清型產(chǎn)生的中和抗體滴度的柱狀圖比較。圖4顯示針對登革病毒的疫苗的皮下和皮內(nèi)注射以及在第二次加強施用后針對不同登革病毒血清型產(chǎn)生的中和抗體滴度的柱狀圖比較。圖5顯示小鼠中用針對登革病毒血清型的疫苗的皮下和皮內(nèi)免疫的直方圖。圖6A和6B顯示攻擊試驗的圖示，所述攻擊試驗利用兩種不同登革病毒血清型對用另一登革病毒血清型接種小鼠后的登革血清型免疫小鼠群體進行。定義如本文所用，“一(a)”或“一(an)”可意味著一個或一個以上的項目。如本文所用，容器(vessel)可包括但不限于試管、小型或微型離心管、通道 (channel)、小瓶、微量滴定板或容器(container)。如本文說明書所用，“對象(subject)”或“對象(sub jects) ”可包括但不限于哺乳動物諸如人或哺乳動物，馴養(yǎng)的或野生的，例如狗、貓、其它家庭寵物(如，倉鼠、豚鼠、小鼠、大鼠)、雪貂、兔、豬、馬、牛、土撥鼠或動物園動物。如本文所用，“大約”可意味著加或減百分之十。如本文所用，“減毒病毒”可意味著當(dāng)施用給對象諸如哺乳動物(例如人或動物) 時證實具有減輕的或沒有疾病臨床指征的病毒。

發(fā)明內(nèi)容
在下面的部分中，為了詳述各種實施方式描述了各種示例性組合物和方法。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的是，實施各種實施方式不需要應(yīng)用本文所概述的所有具體細節(jié)甚或其中的一些，但是濃度、時間和其它具體細節(jié)可通過常規(guī)試驗進行改進。在一些情況下， 熟知的方法和成分沒有被包括在說明中。本發(fā)明的某些方面包括但不限于施用針對登革病毒的疫苗組合物。本發(fā)明的實施方式一般涉及用于在對象中誘導(dǎo)針對登革病毒血清型的保護的方法和組合物。其它實施方式可包括經(jīng)由皮內(nèi)(ID)注射將疫苗組合物引入對象，其中皮內(nèi)引入的疫苗組合物誘導(dǎo)針對一些或所有登革熱血清型的交叉保護。在某些實施方式中，疫苗組合物包括施用給對象的單劑量的針對登革病毒血清型4 (DENVax 4)的疫苗。在其它實施方式中，疫苗組合物包括施用給對象的初始劑量的DENVax 4，然后一次或多次加強的該疫田O
本發(fā)明的其它方面包括與給對象皮下施用相比調(diào)節(jié)對皮內(nèi)施用的針對登革病毒的疫苗的免疫反應(yīng)。針對登革病毒的疫苗可包括這樣的組合物，其包括一定比例的登革病毒血清型、活的減毒登革病毒、或其片段諸如從登革病毒血清型衍生或獲得的蛋白質(zhì)或核酸。各種血清型的比例可以是相等的，或者某種血清型可顯示比其他的多，這取決于需要或?qū)Σ《镜谋┞痘蚩赡艿谋┞?。根?jù)這些實施方式，比例可以是1 2、1 3、1 4、1 10、
1 20 ； 1 1 1、1 2 2、1 2 1、1 1 1 1、1 2 1 2 ;1 3 1 3、
2 3 3 3、5 4 5 5、1 2 2或任何血清型1、2、3和/或4的任意比例，這取決于例如制劑中顯示的血清型數(shù)、預(yù)定的反應(yīng)和期望的效果?？紤]任何登革病毒血清型制劑可被用于產(chǎn)生用于皮內(nèi)施用給需要其的對象的疫苗(例如減毒病毒等)?？紤]一些制劑當(dāng)皮內(nèi)引入時可比其他制劑更有效。在其它實施方式中，登革病毒疫苗制劑的組合物可在對象暴露于登革病毒之前、 期間或之后皮內(nèi)引入到對象中。根據(jù)這些實施方式，對象可接受單次皮內(nèi)注射，或者一次以上包括登革病毒制劑的注射，任選地接著一次或多次另外的注射。皮內(nèi)應(yīng)用本文所述的制劑可以與給對象的任何其它抗病毒治療或疫苗的施用模式(例如皮下注射)組合。在一些實施方式中，考慮皮內(nèi)引入本文考慮的制劑可被施用到對象身體的任何合適區(qū)域(例如臂、臀等)。此外，作為初始或加強施用的本文疫苗制劑的皮內(nèi)施用可發(fā)生在同一天、連續(xù)的幾天、每周、每月、兩月或其它合適的治療方案。方法核酸擴增核酸可被用于任何制劑或被用于產(chǎn)生本文考慮的任何制劑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，被用作擴增模板的核酸序列可以是分離的病毒(例如，登革病毒)。核酸序列可以是基因組DNA 或者分級的或全細胞RNA。在使用RNA的情況下，將RNA轉(zhuǎn)化為互補的cDNA可能是期望的。 在一些實施方式中，RNA是全細胞RNA，并且被直接用作擴增模板?？紤]本領(lǐng)域已知的擴增核酸分子的任何方法(例如PCR、LCR、Q β復(fù)制酶等)。表達的蛋白或肽基因可在任何數(shù)目的不同重組DNA表達系統(tǒng)中表達以產(chǎn)生大量的多肽產(chǎn)物，其然后可被純化并用在本文所報道的方法和組合物中?？紤]本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生和使用構(gòu)建物的任何方法。在某些實施方式中，編碼一種或多種多肽的基因或基因片段可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆或亞克隆技術(shù)插入到表達載體。蛋白質(zhì)、肽和/或抗體或其片段可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行檢測或分析。 在某些實施方式中，可以使用分離或分析分子的方法諸如凝膠電泳或柱層析方法。電泳電泳可被用于基于大小和電荷分離分子(例如大分子諸如蛋白質(zhì)或核酸)。有許多本領(lǐng)域已知的電泳變形形式。分子移動穿過的溶液可以是自由的，通常在毛細管中，或者它可被嵌入基質(zhì)或者本領(lǐng)域已知的其它材料中。常見的基質(zhì)可包括但不限于，聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、質(zhì)譜(mass spec)、印跡和濾紙。一些實施方式，其利用編碼多肽的基因或基因片段，可通過標(biāo)準(zhǔn) 亞克隆技術(shù)被插入到表達載體中?？梢允褂帽磉_載體，其產(chǎn)生作為融合蛋白的重組多肽，允許多肽或蛋白質(zhì)的快速親和純化。這種融合蛋白表達系統(tǒng)的實例是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Pharmacia， Piscataway，NJ)、麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB, Beverley, MA)、FLAG 系統(tǒng)(IBI, New Haven, CT)和 6XHis 系統(tǒng)(Qiagen, Chatsworth, CA)。
藥物制劑 本文考慮了用于疫苗的本領(lǐng)域已知的任何藥物制劑。在某些實施方式中，制劑可包含各種比例的一種或多種DEN血清型，這取決于登革病毒亞型的預(yù)定暴露或存在?？紤]制劑可包含用于接種對象的其它試劑，其包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它活性或非活性成分或組合物。試劑盒其它實施方式涉及與本文描述的方法(例如疫苗的應(yīng)用或施用方法)和組合物一起使用的試劑盒。一些實施方式涉及具有疫苗組合物的試劑盒，其用于預(yù)防或治療帶有、暴露于或懷疑暴露于一種或多種登革病毒的對象。在某些實施方式中，試劑盒可包括預(yù)定比例的一種或一種以上的登革病毒血清型(一種或多種)的制劑(例如減毒疫苗)。試劑盒可以是可攜帶的，例如，能被運輸并用于遙遠區(qū)域諸如軍事裝置或偏僻村莊。其它試劑盒可用于健康設(shè)施中以治療已經(jīng)暴露于一種或多種登革病毒或懷疑處于暴露于登革病毒的風(fēng)險的對象。試劑盒也可包括合適的容器，例如小瓶、小管、小型或微型離心管、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器。在提供另外的成分或劑的情況下，試劑盒可包含該劑或成分可被放入的一個或多個另外的容器。本文試劑盒也將一般包括將商業(yè)規(guī)模的劑、組合物和任何其它試劑容器包含在密閉空間中的工具。這樣的容器可包括期望小瓶被保留到其中的注射或吹模塑料容器。任選地，一種或多種另外的劑諸如免疫原性劑或其它抗病毒劑、抗真菌或抗細菌劑可以為所述組合物，例如用作針對一種或多種另外的微生物的疫苗的組合物所需。下列實例 被包括以證實本文所示的某些實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，在下面實施例中公開的技術(shù)遵循發(fā)現(xiàn)在本文公開的實踐中功能良好的代表技術(shù)。然而，鑒于本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在所公開的某些實施方式中可進行許多改變，并仍將獲得類似或相似的結(jié)果，而沒有背離本文的精神和范圍。
實施例實施例1前面的研究揭示使用各個DEN(登革病毒)血清型的自然感染導(dǎo)致免于由同源血清型引起的登革熱的長期保護。在某些實施方式中，有效的登革疫苗的施用緊密模仿自然感染并能作為施用針對登革病毒的疫苗的方式。本文報道的實施方式可涉及登革病毒 (DEN)感染的自然感染途徑，這類似于運輸宿主的皮內(nèi)遞送，蚊子咬傷。在某些實施方式中， 可以使用將疫苗病毒沉積到相同組織的皮內(nèi)注射。皮膚是非常易達到的器官并且代表有效的免疫屏障，這主要歸功于表皮中居留的朗格漢斯細胞(LCs)的存在。皮膚免疫引起寬范圍的免疫反應(yīng)，包括體液的、細胞的和粘膜的反應(yīng)，并且具有繞過預(yù)先存在的免疫性對所施用疫苗的免疫原性的作用的可能。報道了在需要這種治療的對象中皮內(nèi)(ID)施用四價登革疫苗的一些實施方式。 皮內(nèi)施用的一個示例性方法對通過皮內(nèi)施用在四個施用了 5 5 5 5 DENVax(登革病毒疫苗)的食蟹猴(Cynomologous macaques)進行。為了達到相等劑量的病毒，利用無針噴射注射器，在三個空間上接近的部位ID沉積0. 15ml疫苗(參見下面的圖1和2)。圖1 表示用于皮內(nèi)接種的皮內(nèi)注射(例如PharmaJet )裝置。圖2圖解在用PharmaJet裝置接種后食蟹猴上的接種部位。動物在60天后通過相同的途徑用相同的制劑加強。血清樣品在預(yù)定的時間間隔15、30、58、74和91天進行收集，并且測試針對四種登革血清型的中和抗體的存在。對血清類樣品進行PRNT(蝕斑減少中和試驗，在本領(lǐng)域中已知用于量化抗DEN中和抗體的水平)。證實的是，與初次施用(參見圖3)或二次施用(參見圖4)后的SC施用相比，ID 施用后，中和抗體滴度顯著地更高。因為部位在相同區(qū)域內(nèi)間隔接近，并且每個接種由所有的四種病毒組成，所以這種疫苗遞送模式非常類似于DENVax的單次施用。圖3圖解在第58 天(初次施用后58天)的50% PRNT幾何平均滴度。圖4圖解在第74天(在第60天的二次施用后14天)的50% PRNT幾何平均滴度。如圖中所示，針對所有四種登革病毒的中和抗體滴度在皮內(nèi)施用后比皮下施用高。此外，顯示中和抗體反應(yīng)的動物數(shù)(“血清轉(zhuǎn)化 (seroconversion) ”被定義為PRNT > 10)在第一劑量疫苗后更大(參見表1，顯示在初次和二次免疫后血清轉(zhuǎn)化成四種登革血清型中每一種的動物的百分數(shù))。表1 登革免疫后非人靈長類的血清轉(zhuǎn)化
權(quán)利要求
1.在對象中誘導(dǎo)針對多種登革病毒血清型的保護的方法，其包括通過皮內(nèi)引入向?qū)ο笫┯冕槍Φ歉锊《镜膯蝿┝恳呙?，在所述對象中誘導(dǎo)針對多種登革病毒血清型的保護。
2.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括施用至少一次另外皮內(nèi)注射(一次或多次)所述針對登革病毒的疫苗。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述針對登革病毒的單劑量疫苗包括一種或多種登革病毒血清型。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種另外皮內(nèi)注射(一次或多次)在所述對象上分開的部位處進行。
5.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種另外皮內(nèi)注射(一次或多次)在第一次施用給所述對象后少于30天進行。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述疫苗包括預(yù)定比例的至少兩種登革病毒血清型。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述疫苗包括所有四種登革病毒血清型。
8.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括給所述對象施用至少一種免疫原性劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫原性劑包括至少一種Toll受體(TLR)配體(一種或多種)。
10.保護對象免于登革病毒血清型的組合物，其包括皮內(nèi)(ID)施用預(yù)定比例的至少兩種登革病毒血清型的單劑量組合物。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中，相比皮下施用IO2至IO5Pfu范圍的一種或多種活的減毒登革疫苗的組合物，所述組合物濃度減少10%或更多。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述組合物包括所有四種登革病毒血清型。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述四種血清型為預(yù)定比例。
14.權(quán)利要求10的組合物，其進一步包括至少一種免疫原性劑。
15.權(quán)利要求10的組合物，其進一步包括至少一種Toll受體(TLR)配體(一種或多種)或其它佐劑。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述至少一種Toll受體配體(一種或多種)包括 CpG_ODN、Poly I:C、咪喹莫特(imiquimod)、菊粉衍生的佐劑、MPL Toll受體4配體、聚I :U Toll受體3配體、熱不穩(wěn)定腸毒素、熱不穩(wěn)定腸毒素的非毒性突變體和其組合。
17.將登革疫苗組合物施用給對象的系統(tǒng)，包括針對登革病毒的疫苗組合物和裝置，其能夠通過非注射方法將所述疫苗組合物皮內(nèi)引入對象，將所述登革疫苗組合物施用給所述對象。
18.權(quán)利要求17的系統(tǒng)，其中所述非注射方法沒有針并且沒有注射器。
19.疫苗試劑盒，其包括至少一種針對登革病毒的疫苗組合物，其包括一種或多種登革病毒血清型；以及至少一種裝置，其能夠?qū)⑺鼋M合物皮內(nèi)施用給對象。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其進一步包括至少一種免疫原性劑。
21.權(quán)利要求19的試劑盒，其進一步包括至少一種Toll受體配體(一種或多種)。
全文摘要
本發(fā)明的實施方式報道了用于給對象接種針對登革病毒的疫苗的組合物和方法。在一些實施方式中，疫苗組合物可通過皮內(nèi)引入施用。在某些實施方式中，在對象中皮內(nèi)引入針對登革病毒的疫苗可包括初始接種后一次或多次皮內(nèi)加強。其它實施方式包括皮內(nèi)注射針對登革病毒的疫苗組合物，其中所述組合物提供針對DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的兩種或更多種的保護。
文檔編號C12Q1/70GK102449172SQ201080024148
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者C·D·帕提度斯, D·T·斯汀奇科姆, J·E·奧索瑞羅, J·N·布瑞沃 申請人:伊維拉根公司