專利名稱：用于細(xì)胞培養(yǎng)的微尺度多流體流生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及培養(yǎng)細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。更具體地，涉及具有多內(nèi)部連通通道的多層微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置的多種實(shí)施方案，并涉及使用該種裝置為腎臟及其它細(xì)胞的可控培養(yǎng)的方法。發(fā)明背景 腎臟疾病在美國是嚴(yán)重的健康問題。大約九名成年美國人中的一名受慢性腎臟疾病(CKD)的折磨，約450000病人患有晚期腎臟疾病(ESRD)。目前標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理治療，諸如血液透析及血液濾過，為受損傷的器官提供幫助，但典型地不直接促進(jìn)疾病組織再生或復(fù)原。另一方面，現(xiàn)代腎臟組織工程以及再生策略試圖使用活腎臟特異性細(xì)胞和細(xì)胞生物材料結(jié)構(gòu)取代或修復(fù)腎臟組織。培養(yǎng)腎臟特定細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞大體上要求化學(xué)、生物、生理上的嚴(yán)格控制，以確保適宜的細(xì)胞增長和表型功能。通常，腎臟關(guān)聯(lián)細(xì)胞被培養(yǎng)于盤、碟和燒瓶中，并且細(xì)胞介質(zhì)以及其它液體被人工遞送到細(xì)胞內(nèi)，并置于靜態(tài)狀態(tài)。更多近期的細(xì)胞培養(yǎng)方法使用具有多室、管狀結(jié)構(gòu)或空心纖維的生物反應(yīng)器，來建立流體流，其促進(jìn)暴露細(xì)胞于可控水平切應(yīng)力或于多種化學(xué)環(huán)境下。然而，這些方法大體上不能，或僅僅在非常有限的程度內(nèi)，允許同步暴露細(xì)胞于多用戶制定的化學(xué)、生物和生物物理刺激下。進(jìn)而，典型地，它們不能模擬腎臟細(xì)胞在活體中經(jīng)歷的條件和流體結(jié)構(gòu)，諸如極端接近幾個(gè)細(xì)胞表型以及微尺度血管狀結(jié)構(gòu)。因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)歷的條件影響其功能，所以這些方法可能不能向該細(xì)胞類型引入所需功能，或引入不需要的功能。進(jìn)而，典型地，這些方法未考慮在生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)內(nèi)不同位置的多細(xì)胞類型的培養(yǎng)。為改善用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的腎臟關(guān)聯(lián)細(xì)胞培養(yǎng)，需要提供用于在可控培養(yǎng)條件下增長多細(xì)胞類型的系統(tǒng)和方法。發(fā)明概述本發(fā)明在多種實(shí)施方案中，提供用于在控制多種化學(xué)、生物、生物物理參數(shù)的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞的微流體多通道生物反應(yīng)器裝置，從而促進(jìn)例如活體條件的更好的模擬。這種生物反應(yīng)器全系統(tǒng)例如可以包括被可滲透或半滲透膜分開的兩個(gè)聚合物層。每一層限定一種或多種微通道，其在操作中被填滿諸如緩沖溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基、血液或尿的液體。通過例如在通道入口及出口之間施加壓力差，流體流被引入通道中。在一層中的通道可以通過膜與另一層的一個(gè)或多個(gè)通道“連通”。連通，正如此處所使用的術(shù)語，代表通道之間任何類型的相互作用，無論本質(zhì)上是化學(xué)的、物理的(例如熱學(xué)的、機(jī)械的、或流體力學(xué)的)或是生物的。例如，連通可包括流體連通，即，流體或其成分在通道之間的傳輸，或機(jī)械相互作用，諸如在一個(gè)通道給予另一通道的壓力。在相同層內(nèi)的通道也可以彼此相連通，這可通過膜以及在另一層的與二者均幾何重疊的通道完成。此處通道幾何重疊是指通道向平行于膜(或在某些層與膜不平坦的情形中，局部平行于膜的)的平面的投影重疊，盡管通道不占有相同的物理空間。在一層中的通道之間的連通程度相比于其它因素，主要取決于通道之間的距離和其交錯(cuò)部分的高度及寬度。因此，通過沿著通道長度(例如，沿著最長的尺寸或軸)改變所有這些參數(shù)或者參數(shù)的一個(gè)子集，連通的水平可以被控制為一個(gè)有關(guān)沿著通道位置的函數(shù)。反過來，通道之間連通的這種控制，通過流體注射和流速、進(jìn)出口壓力控制，協(xié)助控制沿通道的流體力學(xué)和化學(xué)參數(shù)。例如，如果不同組成的兩種流體在入口處被注射入相鄰的通道，由于通道之間的化學(xué)連通，即質(zhì)量傳遞，兩種流體可混合，并導(dǎo)致出口端的第三種混合組成。相似地，可在兩個(gè)通道的端口(入口和/或出口)施加不同的壓力，并且導(dǎo)致沿通道長度的流體力學(xué)參數(shù)曲線，該曲線由個(gè)別通道的幾何以及它們之間機(jī)械連通水平?jīng)Q定(至少部分)。如上所述的微流體裝置可有助于細(xì)胞培養(yǎng)。通道中可接種一種或被置于通道內(nèi)不同位置上的多種類型的細(xì)胞。通道的相對(duì)位置和形狀、通道內(nèi)的細(xì)胞位置以及操作參數(shù)諸如流體組成以及施加于端口的壓力共同給出對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞的微環(huán)境以及對(duì)細(xì)胞的化學(xué)的、生物的、機(jī)械的和生物物理信號(hào)施放的控制的空前水平。以對(duì)這些參數(shù)的控制，生物反應(yīng)器可被用于影響細(xì)胞功能并協(xié)助生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)內(nèi)的不同位置多細(xì)胞類型培養(yǎng)。用戶可同時(shí)或按照特定計(jì)劃定時(shí)地實(shí)施任意參數(shù)組合，以按照所需的方式和/或?yàn)樘厥饽康母淖兗?xì)胞功能?？蓮亩欢ㄖ频募?xì)胞功能包括但不僅限于增殖促進(jìn)或抑制，干細(xì)胞多能性維持或細(xì)胞向特定表型的分化。細(xì)胞可以直接被設(shè)計(jì)。本發(fā)明的實(shí)施方案為培養(yǎng)和發(fā)育用于多種應(yīng)用的細(xì)胞群提供平臺(tái)。例如，可以為特定治療應(yīng)用定制細(xì)胞培養(yǎng)，例如，新再生療法或先前基于細(xì)胞療法的改進(jìn)。在一些實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器被設(shè)計(jì)用于模擬自然器官，并且被用于研究細(xì)胞發(fā)育及器官功能。生物反應(yīng)器裝置也可以是生物工程人造器官，或部分的先體。大體上，不同應(yīng)用可以利用本發(fā)明的不同方面和特征。一方面，本發(fā)明提供微流體生物反應(yīng)器裝置，其包括至少一個(gè)限定至少三個(gè)其中 的微通道的聚合物層。膜將第一和第二通道，與第三通道(以及，可選地，第四通道)，在幾何重疊部分分開，同時(shí)準(zhǔn)許在微通道的重疊部分之間的連通(例如，流體連通或機(jī)械連通)。第一和第二通道可通過第三通道互相連通。在特定實(shí)施方案中，裝置包括由膜分開的兩個(gè)聚合物層，一層限定第一和第二通道，而另一層限定第三通道。至少一個(gè)微通道的至少一個(gè)幾何參數(shù)在重疊部分中沿通道長度變化。沿微通道長度變化的幾何參數(shù)包括第一和第二通道之間的距離，和/或任意通道的寬度和/或深度。在某些實(shí)施方案中，聚合物層包括或本質(zhì)上由生物聚合物組成。膜，或其成分可以是半透性的，并且可以由多孔或半透性基體材料構(gòu)成。在特定的實(shí)施方案中，膜包括或本質(zhì)上由絨頭織物、微模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他硅氧烷聚合物、聚醚砜、電紡材料或徑跡蝕刻膜組成。如此處所用，無論在使用中或非，術(shù)語“生物反應(yīng)器裝置”指示上述微流體結(jié)構(gòu)。在為細(xì)胞培養(yǎng)配置的實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器裝置進(jìn)一步包括至少在一些微通道中的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以是腎臟細(xì)胞，并且微通道可以進(jìn)一步配置以一同模擬腎臟組織。細(xì)胞可以附著在膜或通道壁，和/或可懸浮于在通道中所含的流體中。細(xì)胞可以包含多種類型，在某些實(shí)施方案中，其沿通道長度變化。裝置在微通道中可進(jìn)一步包括流體，諸如細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖溶液、血液成分、全血、尿、透析液、水或?yàn)V液。在特定實(shí)施方案中，流體是或包括仿制體液的溶液。在通道內(nèi)的流體可能具有與之相關(guān)的流體力學(xué)參數(shù)(例如，壓力、流速、剪切率、粘度等)。流體力學(xué)參數(shù)值在任意兩個(gè)微通道之間可本質(zhì)地不同(例如，通過某一因素高于I. I、高于I. 5、高于2或高于10)。例如，它們可在第一或第二通道(可在第一層形成)與第三通道(可在第二層形成)之間不同，和/或在第一與第二通道之間和/或第三與第四通道之間不同。另外，流體內(nèi)成分的濃度或濃度梯度可在膜同側(cè)或異側(cè)上的任意兩通道之間不同。微通道的幾何參數(shù)可以沿通道長度逐漸變化。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)參數(shù)是基于在第一聚合物層中的，至少一個(gè)微通道的預(yù)先確定的流體力學(xué)曲線變化。流體力學(xué)曲線可以是例如聚合或分散傳輸曲線，或切應(yīng)力曲線。在某些實(shí)施方案中，幾何參數(shù)的變化促進(jìn)沿微通道長度的至少一個(gè)化學(xué)或機(jī)械刺激的變異。另一方面，本發(fā)明的多種實(shí)施方案涉及通過提供如上所述生物反應(yīng)器，引入細(xì)胞到至少一個(gè)微通道并培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。方法還包括引入流體到至少一個(gè)微通道。在某些實(shí)施方案中，該方法還涉及暴露細(xì)胞至機(jī)械的、化學(xué)的、和/或生物學(xué)刺激，可選地測量細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)(例如，細(xì)胞功能的變化)。細(xì)胞可以被種植于微通道中選定位置，并且在不同位置的細(xì)胞可被暴露于不同的刺激。此外，可以向微通道引入不同細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方案中，不同類型細(xì)胞被引入不同微通道，并且在某些實(shí)施方案中，不同類型細(xì)胞被種植于同一微通道的不同位置。另一方面，本發(fā)明提供模擬腎臟的方法。該方法包括提供具有上述特征的生物反應(yīng)器，其中參數(shù)依照模擬腎臟結(jié)構(gòu)的方式變換。該方法進(jìn)一步涉及引入腎臟細(xì)胞到至少一個(gè)微通道并且培養(yǎng)該細(xì)胞。在例如體外腎臟治療中，接下來可使用生物反應(yīng)器。在某些實(shí)施方案中，可將生物反應(yīng)器植入患者。通過以下描述、附圖和權(quán)利要求，此處披露的本發(fā)明的實(shí)施方案的這些和其它對(duì)象，以及優(yōu)勢和特征將逐漸明了。更進(jìn)一步，應(yīng)當(dāng)理解此處描述的多種實(shí)施方案的特征并不互相排斥并且可存在于多種組合和排列中。附圖簡述在圖示中，在所有不同附圖下相同引用字符大體上指示相同部分。另外，附圖并不一定成比例，通常重點(diǎn)被置于圖示本發(fā)明的主要原理。在以下描述中，將參照以下附圖描述本發(fā)明的多種實(shí)施方案，其中

圖1A-1C是依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置的圖解透視圖；圖2是在圖1A-1C中示出的裝置的橫截面的掃描電子顯微鏡圖片(SEM)；圖3A-3C是依照本發(fā)明的多種實(shí)施方案的通道的頂視圖，其間距、寬度以及深度分別沿通道長度變化；以及圖4A-4D是依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的裝置的側(cè)視圖，其具有在一層連通于在另一層的三個(gè)通道的通道，該圖示出連通水平分別在通道距離、寬度和深度上變化的效果。發(fā)明詳述 在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特征為兩個(gè)包含通道的、被膜分開的層，經(jīng)由所述膜，一層中的微通道可與另一層的微通道連通。包含通道的層典型地由聚合物構(gòu)成，但是本發(fā)明不僅限于這一方式。在某些實(shí)施方案中，層可由以下組成或包含陶瓷、金屬、玻璃或其他非聚合物材料。適當(dāng)?shù)牟豢山到饩酆衔锊牧习ň郾揭蚁?、PDMS、聚碳酸酯和聚氨酯。關(guān)于某些應(yīng)用，生物可降解或生物可相容材料，諸如聚甘油癸二酸酸、聚酯酰胺、聚辛二醇檸檬酸酯，聚二醇檸檬酸酯、絲纖蛋白或聚己酸內(nèi)酯的使用是有利的。此外，在某些實(shí)施方案中，可使用生物聚合物，諸如蛋白質(zhì)或凝膠。包含通道的層可具有從小于100微米到幾毫米的厚度。另一方面，膜僅有約I微米到約100微米厚。為允許通過膜的質(zhì)量傳遞，膜或至少其部分是可滲透的或可半滲透的(也就是說，依照分子和膜的物理或化學(xué)特性，選擇性可滲透一些但不是其它離子和分子)?？蓾B透性可以通過使用半多孔或多孔材料(諸如聚醚砜)獲得，其中通過孔發(fā)生質(zhì)量傳遞，或可滲透性基體材料(bulk-permeable-material)(諸如PDMS或絨頭織物狀材料)獲得。在某些實(shí)施方案中，膜是通過將聚合物旋轉(zhuǎn)電鍍到一個(gè)包含通道的層上創(chuàng)建的，該過程將產(chǎn)出柔性的、多孔聚合物網(wǎng)。 簡單示例性微流體裝置在圖1A-1C中示出。圖IA是裝置100的組裝圖，圖IB是裝置100的部件分解圖，其單獨(dú)示出兩個(gè)聚合物層102、104和膜106。在該示例中，底層104限定沿層104延伸的單通道108，并且在兩端通過端口 110可進(jìn)出。頂層102包括五個(gè)通道112，每一個(gè)具有比底層104中的通道108更小的直徑。這些通道112被鄰近放置，并且沿通道長度的較大部分與更寬的通道108側(cè)向重疊，但在通道112的末端分叉，以增加通過它們各自的端口 114進(jìn)出它們的便利。圖IC連同放大的視圖(在插圖中)提供已組裝裝置100的橫截面的透視圖，其示出膜106和稍分離放置的聚合物層102、104。如從插圖中可見的，在聚合物層102、104的每一個(gè)中限定的通道108、112，每個(gè)都具有面對(duì)膜106的開放側(cè)面。因此，在上層102中的通道112和在底層104中的寬通道108可以通過膜106相互作用。如圖IC所示，在許多實(shí)施方案中，通道108、112具有矩形的橫截面。然而通常，通道界面可以是任意多邊形或圓形狀。例如，通道橫截面可以是半圓的，具有由膜106構(gòu)成的直邊界。具有在圖1A-1C中示出的基本結(jié)構(gòu)的裝置100的橫截面的SEM圖片在圖2中示出。多孔層106具有約6μπι的厚度。五個(gè)在頂層102中的微通道112每一個(gè)約50 μ m寬，約50 μ m深。通常，典型實(shí)施方案具有從幾個(gè)微米到幾百個(gè)微米的通道深度，并且寬度從幾個(gè)微米到幾個(gè)毫米。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如在圖1A-1C和2中示出的那個(gè)一樣，在裝置100的運(yùn)行過程中，可包括細(xì)胞的流體被通過端口 110、114傳送到微通道108、112。因?yàn)槊恳煌ǖ蓝季哂胁煌娜肟诙撕统隹诙?，可以為每一通道單?dú)控制流體類型和流動(dòng)狀態(tài)。從而，在一個(gè)通道的流體力學(xué)參數(shù)可不同于另一通道的流體力學(xué)參數(shù)，無論另一通道是否在相同或不同層。流體力學(xué)參數(shù)包括，例如，壓力、流速、剪切率、切應(yīng)力、層流性和粘性。其他可在通道108與112之間不同的參數(shù)包括溫度、導(dǎo)熱系數(shù)、導(dǎo)電性、密度和流體的化學(xué)組成。更進(jìn)一步，可使用在多通道108、112的平行流、對(duì)流、流過多孔層106的流的任意組合和靜態(tài)狀態(tài)?？蔀榫唧w應(yīng)用選擇參數(shù)。例如，為模擬亨勒袢，即腎臟中水和鹽被從廢物流中重吸收并且形成濃縮尿的部分，將建立在兩個(gè)一端流體相連的鄰近通道之間的對(duì)流。為模擬腎小球，其中發(fā)生血液過濾，血液可以在一個(gè)通道中流過，而透析液可以在相鄰?fù)ǖ懒鬟^。像例如使用此處描述的裝置進(jìn)行血液過濾的過程的模擬，利用通道108、112的能力來通過質(zhì)量交換、壓力平衡或其它相互連通。在膜106兩側(cè)的通道之間，以及經(jīng)由膜106的另一側(cè)的通道的在相同層上的通道之間的連通程度，取決于多種幾何參數(shù)，包括通道的接近度以及它們橫截面的尺寸，以及膜106的特性(例如材料、厚度、孔大小等)。更進(jìn)一步，連通可能被多種流體成分的濃度和濃度梯度影響。盡管在圖1A-1C和圖2中示出的通道108、112的幾何形狀不隨通道108、112的長度變化，這并非一定如此。相反，微流體生物反應(yīng)器的多種實(shí)施方案可以(根據(jù)沿通道長度位置)使用這些參數(shù)的一個(gè)或多個(gè)變種來控制通道之間的連通，并從而控制在通道之內(nèi)的狀態(tài)。圖3A-3C圖示，在俯瞰視角的，具有五個(gè)微通道301的裝置層300，其幾何屬性在點(diǎn)302沿通道301按階梯狀方式改變。在圖3A中，兩個(gè)最靠外側(cè)的通道301到里面通道301的距離突變。在圖3B中，兩個(gè)最靠外側(cè)的通道301變得更寬并且相鄰兩個(gè)內(nèi)側(cè)通道301變得更窄，而中心通道301不改變其橫截面。最終，在圖3C中，通道301的深度在點(diǎn)302處改變。、該幾何形狀可在不止一處位置變化。更進(jìn)一步，它可以逐步改變。例如，兩個(gè)直通道之間的距離可以沿通道長度線性增加。因此，在這種情形下，通道不再平行，相關(guān)幾何參數(shù)的變化(在該例子中，距離)可以依照長度或任何一個(gè)通道的軸、通道之間的對(duì)稱軸或通常任意兩個(gè)通道都將具有投影成分(也就是說，不是垂直于任意通道的)的幾何軸來限定。短語“沿通道的長度”的意思是環(huán)繞所有這些可能的坐標(biāo)軸。為確保分叉的通道之間通過在膜的另一側(cè)上的層中的另一通道的、最短可能路徑的連通，其他通道將典型地相應(yīng)改變寬度(例如，如果在其它層內(nèi)部連通通道線性分叉，將在層中有梯形投影)?？蛇x地，提供連通方式的更寬的通道可具有等于至少在裝置相關(guān)部分中較窄通道之間最大距離的寬度。(注意到在圖1A-1C中五個(gè)微通道112在鄰近端口 114的分歧，不同于如上所述的幾何參數(shù)的變化，在其中越過其中五個(gè)通道112平行的區(qū)域，它們不與在底層104的更寬的通道108重疊。)在圖4A-4D中示出了通道幾何形狀在通道之間的相互作用中的影響，尤其是在跨膜的、經(jīng)過另一層的側(cè)向重疊的通道連通的相同層的通道之間的相互作用中的影響。初始配置400包括三個(gè)大約等距的、具有大約相同的橫截面的窄通道402以及與在底層的兩個(gè)外側(cè)通道402齊平的上層的更寬的通道404，在圖4A中示出。由于微流體裝置的特征，特別是在通道中的層流優(yōu)勢，所以在通道內(nèi)的流體流間的溶液混合絕大多數(shù)通過擴(kuò)散來控制。因?yàn)閿U(kuò)散取決于路徑長度，改變通道幾何形狀以改變?cè)谕ǖ乐g以及通道之內(nèi)擴(kuò)散的路徑長度，提供控制可溶解成分沿通道長度遞送到多個(gè)區(qū)域的方式。另外，擴(kuò)散取決于橫截面面積，所以改變通道寬度或長度可以影響穿過膜的擴(kuò)散的總量。在圖4A-4D的橫截面中，經(jīng)過膜405的擴(kuò)散總量是通過垂直箭頭寬度來表示的，并且穿過在上層的通道404的寬度的擴(kuò)散路徑長度是由水平箭頭指示的。降低在底層通道之間的距離減少了到頂通道的擴(kuò)散路徑長度，導(dǎo)致底層兩通道擴(kuò)散的增加。因此，在圖4B示出的配置410中，兩個(gè)鄰近放置的通道412、414之間的擴(kuò)散傳輸大于兩個(gè)更遠(yuǎn)放置的通道414、416之間的擴(kuò)散傳輸。在圖4C示出的配置420中，由于與膜405增大的接觸面積，為在底層的更寬通道422增大了穿過膜405的擴(kuò)散。因此，在更寬的通道422與較窄的通道424,426之間的擴(kuò)散相似地增大。在圖4D中示出的配置430中，中心通道432的變更的通道深度影響通道432內(nèi)的擴(kuò)散路徑長度，其通過對(duì)給定擴(kuò)散量增大總通道容量來改變連通程度。在其中幾何參數(shù)沿通道長度變化的實(shí)施方案中，流體成分(血液成分、營養(yǎng)、或藥物制劑)的基于擴(kuò)散的遞送可以通過通道幾何形狀為通道的不同區(qū)域作調(diào)整。這對(duì)于腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)尤其有用，因?yàn)榧?xì)胞沿例如腎小管經(jīng)受依賴于其在小管通路內(nèi)位置的變化的化學(xué)物質(zhì)影響。因此，通道的幾何形狀的改變提供在微流體裝置內(nèi)培育腎臟細(xì)胞，以使它們經(jīng)受相同于那些在活體中經(jīng)受的環(huán)境的獨(dú)特方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的微流體裝置可以使用多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)生產(chǎn)，包括復(fù)制造型、傳統(tǒng)加工、噴射造型或固體自由形態(tài)制造。為了通過復(fù)制造型方法產(chǎn)出個(gè)體聚合物層，關(guān)于每一層制造具有所需結(jié)構(gòu)的反向浮雕特征的主模具。制造主模具的廣泛使用的方法包括軟平板印刷、濕蝕刻、等離子蝕刻及電鍍。通過例如軟平板印刷生產(chǎn)主模具涉及限定主模具對(duì)應(yīng)于最后一層的缺口的褶皺的光掩模為透明區(qū)域，而其它為不透明片。掩模的版面設(shè)計(jì)可以在電腦繪圖中被設(shè)計(jì)并隨 后被例如諸如Tanner L-Edit的軟件包轉(zhuǎn)換成計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(Computer-Aided Design)(CAD)版面設(shè)計(jì)圖，其適合于隨后由電子束平印術(shù)或相似技術(shù)在掩模上的物理書寫。作為另一準(zhǔn)備步驟，基質(zhì)晶片，例如硅制的，可被使用合適的諸如SU-8的光刻膠的粘性溶液旋轉(zhuǎn)涂敷。典型地，晶片被快速地涂覆，以每分鐘1200到4800轉(zhuǎn)，以從幾十秒到分鐘范圍的時(shí)間長度，以產(chǎn)生同一厚度的光刻膠層，其厚度為幾十或甚至幾百微米。隨后，光掩?？杀恢糜诰?，而在掩模透明區(qū)域的光刻膠可以通過UV光線暴露被化學(xué)方式穩(wěn)定。在非曝光區(qū)域的光刻膠可隨后被通過暴露于化學(xué)顯影劑中而除去，而剩余的光刻膠可以在高溫下變硬以形成耐用反向浮雕。在蝕刻步驟中，可以使用化學(xué)制劑去除未被光刻膠保護(hù)的區(qū)域的基質(zhì)最上層，在晶片中產(chǎn)生反向浮雕的通道樣式，其現(xiàn)在構(gòu)成主模具。不再需要的光刻膠可以隨后被從基質(zhì)中除去。接著，液體聚合物可被澆鑄于主模具中，固化并剝?nèi)?，產(chǎn)生裝置的包含通道的層的復(fù)制模具(例如，層102或104)。從一層的通道分離另一層的通道的膜可以通過涂覆適宜的材料到晶片上、固化，如果適用，并剝?nèi)碇圃?。另一種制造方法涉及用帶有所需多孔性、厚度和其他所需屬性的膜靜電紡絲?？蛇x地，可使用市場上可買到的膜(例如，購自Sterlitech,Kent,Washington的痕跡蝕刻聚碳酸酯膜)或在原地制造的膜。聚合物層和膜可以隨后被組裝、對(duì)齊、等離子粘合或其它暫時(shí)或永久地彼此附著。上述技術(shù)提供更廣泛的用途以產(chǎn)生所需寬度、深度、流程及配置的通道。例如，通道可被設(shè)計(jì)為沿曲線路徑行進(jìn)，分叉為多個(gè)通道，或形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。因此，裝置可以被調(diào)整以模擬生物器官和組織，諸如微脈管系統(tǒng)或腎單位部分的重要特征。在某些實(shí)施方案中，通道是被基于所需流體力學(xué)曲線設(shè)計(jì)的，這些曲線諸如由依照在通道內(nèi)的位置的對(duì)流性或擴(kuò)散性傳輸特性或其它流體力學(xué)參數(shù)而限定?？蛇x地或可附加地，通道設(shè)計(jì)可以基于在將被注射入裝置的流體中特定成分的所需濃度曲線來設(shè)計(jì)。計(jì)算模塊可以被使用作從所給流體力學(xué)或濃度曲線計(jì)算可產(chǎn)生這種曲線的通道的幾何形狀和配置?？蛇x曲線以模擬特別的生物器官，或以之優(yōu)化生物相關(guān)參數(shù)。例如，通過使通道適宜地淺，可以使清理通道小分子的程序被優(yōu)化?？蛇x擇地，通道或隔室內(nèi)的機(jī)械的、化學(xué)的或生物的微環(huán)境可以被優(yōu)化以引入適于增加細(xì)胞生存力的條件。
可以在依照本發(fā)明的微流體生物反應(yīng)器裝置中施加多種修改和更多的特征。在某些實(shí)施方案中，層都包括多通道。例如，一層可以包括兩個(gè)較寬的通道，其中任意一個(gè)都側(cè)向地重合并且在另一層上的四個(gè)較窄通道中的兩個(gè)之間建立連通。在另一個(gè)示例型配置中，每一層可包含側(cè)向重疊于另一層的多通道的通道。在特定實(shí)施方案中，在一層內(nèi)的通道不僅通過膜另一側(cè)的通道連通，還直接通過有孔側(cè)壁或多孔或在那一層分離通道的滲透性材料連通。進(jìn)一步，裝置可包括多于兩個(gè)層，其被流體地連接多層端口的頭元件所整合。所以，可產(chǎn)生三維網(wǎng)絡(luò)。通道本身可以具有特征如光滑的壁、光滑的分支點(diǎn)、擴(kuò)大的壁和/或近乎完美的圓或半圓橫截面。在某些實(shí)施方案中，另一方面，可以從單聚合物層或塊中產(chǎn)出結(jié)構(gòu)和功能類似于上述那些的生物反應(yīng)器。通道可以多種高度被引進(jìn)于塊中，例如以使兩個(gè)通道的中心軸位于一個(gè)平面中，并且第三通道的中心軸位于另一個(gè)平行的平面。在特定部分，在兩個(gè)平面中的通道之間的材料可以被部分蝕刻除去或移走，以使膜狀結(jié)構(gòu)在通道之間形成?？蛇x地，具有等于兩個(gè)所需通道深度的垂直尺寸的一個(gè)或多個(gè)通道可形成于塊中，并且可插入膜以分離通道成為垂直堆疊式的通道。
為了準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)的裝置，通道壁的化學(xué)特性可能會(huì)被適宜的溶液沖洗以做可選擇的改變，所述溶液諸如牛血清白蛋白(BSA)或者一種表面功能化溶液。取決于其應(yīng)用，通常發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的蛋白質(zhì)，例如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白或彈性蛋白，通過表面功能化的方法可附著到通道壁。微裝置之后可能會(huì)通過調(diào)節(jié)管口以擬合進(jìn)口和出口，注入含有細(xì)胞的流體，和/或連接裝置到其他的儀器而被納入一個(gè)實(shí)驗(yàn)性的設(shè)置中。細(xì)胞可以漂流在包含于通道或者流經(jīng)通道的流體中。另外或附加地，細(xì)胞可粘著在通道壁和/或膜上。在那些擁有足夠孔徑的膜中，細(xì)胞可以獨(dú)自占據(jù)孔，從而形成多孔細(xì)胞培養(yǎng)層。因此，細(xì)胞可能會(huì)被暴露在來自于膜兩側(cè)的流體刺激。在多種實(shí)施方案中，多種類型的細(xì)胞在生物反應(yīng)器中被培養(yǎng)。不同類型的細(xì)胞可在同一位置被共同培養(yǎng)，注入不同的通道，或者植入同一通道的不同的位置。通常，細(xì)胞與壁和膜的粘著力取決于表面化學(xué)，具體來說就是取決于一些特定的，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于某些類型的細(xì)胞但并不是所有細(xì)胞是特異的結(jié)合位點(diǎn)。因而，靶定具有不同類型細(xì)胞的通道中的不同位置可以通過沿著通道長度改變表面化學(xué)性質(zhì)，例如，通過微修飾表面粘著分子，或者在通道壁創(chuàng)建一個(gè)納米地形結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。其他的影響特定類型細(xì)胞在那里被培養(yǎng)的因素包括細(xì)胞類型被引入通道的順序和在植入細(xì)胞時(shí)裝置的方位(可通過利用重力來在某些特定位置放入細(xì)胞)。細(xì)胞的培養(yǎng)可被暴露在多用戶定制的化學(xué)、物理、生物和/或生物物理的刺激下。例如，通道的構(gòu)造配置可同時(shí)允許法向壓力和切應(yīng)力的刺激。剪切力可通過控制沿通道的流速來調(diào)節(jié)，而通道內(nèi)部的壓力可通過外部提供的壓力設(shè)定?？梢钥刂贫嗫讓觾蓚?cè)任一側(cè)的多通道壓力。由于可能會(huì)被在膜的任一側(cè)使用多通道，因此，跨膜壓力(在某些實(shí)施方案中為跨多孔細(xì)胞層)的壓力可以被在多個(gè)位置獨(dú)立控制?？缂?xì)胞層的壓力控制在模擬活體內(nèi)細(xì)胞，例如腎臟中發(fā)現(xiàn)的多種細(xì)胞執(zhí)行傳輸功能條件中具有極其重要的作用?？煽氐纳飬?shù)包括包圍特定細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞的類型和密度。在多孔層中的細(xì)胞可與在一側(cè)與一組細(xì)胞種類交互作用，而在另一側(cè)與另外一組細(xì)胞種類交互作用。在一些實(shí)施方案中，微規(guī)模的通道寬度限制著某一區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量，因此限制了細(xì)胞與細(xì)胞的交互作用。更進(jìn)一步，微規(guī)模的通道深度可影響處在多孔層上的細(xì)胞與處在與該層相對(duì)的通道壁的細(xì)胞的連通水平。統(tǒng)而言之，這些效果為用戶通過通道局部幾何特性控制細(xì)胞與細(xì)胞交互作用提供了一種方法。更進(jìn)一步，如前所述，沿通道長度改變通道的接近度，寬度，深度有利于控制沿通道長度的化學(xué)環(huán)境，這通常被用來近似于在活體中，例如，沿腎小管長度細(xì)胞所經(jīng)歷的化學(xué)環(huán)境變化。由于沿腎小管細(xì)胞類型和功能的改變，提供改變了的化學(xué)環(huán)境可支持在生物反應(yīng)器中培育時(shí)這些細(xì)胞的功能。細(xì)胞不僅能交互作用，而且能與通道中的流體交互作用。例如，細(xì)胞增殖能夠回應(yīng)特殊藥劑，流體中營養(yǎng)物質(zhì)的改變，緩沖溶液的pH值的改變等等，而做出相應(yīng)改變。細(xì)胞還可以吸收或分泌特定的化合物，從而改變流體組成。在一種實(shí)施方案中，全血可流經(jīng)膜一側(cè)的通道，而滲析液流經(jīng)膜另一側(cè)的通道，模擬在腎臟中的對(duì)流并引導(dǎo)細(xì)胞沿著通道過濾血液?？梢杂枚喾N方式觀測和/或測量不同刺激對(duì)細(xì)胞的效果。光學(xué)顯微鏡可以用來探測細(xì)胞尺寸或形狀的任何改變。流體在出口處被分流并分析特定的組成成分以確定特定化合物的吸收或分泌，以此獲取細(xì)胞代謝和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的信息。流體、粒子和分子種類通過膜的速率測量，跨膜壓力的測量，或跨膜電阻的測量可被用于評(píng)價(jià)細(xì)胞阻絕膜孔的好壞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將欣賞，此處描述的微流體生物反應(yīng)器提供了一個(gè)多重研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的平臺(tái)，尤其是，當(dāng)這種反應(yīng)器被聯(lián)系到腎相關(guān)細(xì)胞或干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)。通過調(diào)控多種參數(shù)將有助于在某一特定環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞以引出所需的細(xì)胞功能。例如，可以為了特定治療應(yīng)用而培養(yǎng)干細(xì)胞，同時(shí)保持著向特定表型的潛能或分化。生物反應(yīng)器裝置還改進(jìn)了在體外，在非常接近于體內(nèi)的條件下研究細(xì)胞功能的能力。由于能夠很好地控制生物反應(yīng)器中的環(huán)境參數(shù)，因此，觀察細(xì)胞針對(duì)于給定條件組的已知輸入成為可能。在特定實(shí)施方案下，充滿著腎細(xì)胞的生物反應(yīng)器，模擬了腎臟組成部分的重要功能。因此，腎治療藥品能夠在良好控制下的平臺(tái)研發(fā)。藥物有效性與毒性能夠，通過評(píng)價(jià)生物反應(yīng)器中的腎臟相關(guān)細(xì)胞的生存能力以及接受藥品作用后細(xì)胞的健康狀態(tài)，在體外安全地檢測。對(duì)于多參數(shù)的高水平控制，相比于傳統(tǒng)藥物檢測方法，能夠減少試驗(yàn)的不確定性，提高精確度。生物反應(yīng)器裝置的特定實(shí)施方案可以被用在終末期腎臟疾病的治療中。生物反應(yīng)器和貼壁細(xì)胞可配置從而使裝置發(fā)揮腎臟的某些功能，從而成為在體外在腎臟替代療法中，輔助腎臟的裝置。裝置還能被用作組織工程的支架。具體的，通過提供一個(gè)可控的模仿腎臟的結(jié)構(gòu)，并允許附著細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，該生物反應(yīng)器能夠被用作產(chǎn)生腎臟特定組織結(jié)構(gòu)的支架。這個(gè)組織結(jié)構(gòu)可以被植入到病人的體內(nèi)以取代病變的腎臟組織。通過描述本發(fā)明的一些特定實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很明顯地意識(shí)到，與本 發(fā)明的核心理念與應(yīng)用范圍不背離，可使用納入此處揭示的概念的其他實(shí)施方案。因此，本文描述的特定實(shí)施方案，在各方面上，僅作為說明而不具有限制性。
權(quán)利要求
1.微流體生物反應(yīng)器裝置，包括 至少一個(gè)聚合物層，在其中限定第一微通道、第二微通道和第三微通道；和在其間的幾何重疊部分處將第一微通道和第二微通道與第三微通道分離的膜，該膜允許所述微通道的重疊部分之間的連通， 其中至少一個(gè)微通道的至少一個(gè)幾何參數(shù)在重疊部分內(nèi)沿著微通道的長度變化。
2.權(quán)利要求I的裝置，其中第一微通道與第二微通道通過第三微通道相連通。
3.權(quán)利要求I的裝置，其中至少一個(gè)聚合物層包括由該膜分離的兩個(gè)聚合物層。
4.權(quán)利要求I的裝置，其中至少一個(gè)聚合物層包括生物聚合物或基本上由生物聚合物組成。
5.權(quán)利要求I的裝置，其中微通道之間的連通包括流體連通或機(jī)械連通中至少一種。
6.權(quán)利要求I的裝置，其中至少一個(gè)幾何參數(shù)是第一微通道與第二微通道之間的距離。
7.權(quán)利要求I的裝置，其中至少一個(gè)幾何參數(shù)是所述微通道之一的深度。
8.權(quán)利要求I的裝置，其中至少一個(gè)幾何參數(shù)是所述微通道之一的寬度。
9.權(quán)利要求I的裝置，其中至少所述膜的至少部分是半滲透性的。
10.權(quán)利要求9的裝置，其中所述膜的半滲透部分是下列至少一種多孔的或基體半滲透性的。
11.權(quán)利要求I的裝置，其中所述膜包括下列中的至少一種絨頭織物，電紡材料，微模制的聚二甲基硅氧烷，聚醚砜，或徑跡蝕刻膜。
12.權(quán)利要求I的裝置，進(jìn)一步包括在至少一個(gè)微通道中的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的裝置，其中所述細(xì)胞包括腎臟細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的裝置，其中配置微通道以便共同模擬腎臟組織。
15.權(quán)利要求12的裝置，其中至少一些細(xì)胞附著于所述膜。
16.權(quán)利要求12的裝置，其中至少一些細(xì)胞附著于微通道的壁。
17.權(quán)利要求12的裝置，其中至少一些細(xì)胞懸浮于微通道中所含的流體內(nèi)。
18.權(quán)利要求12的裝置，其中所述細(xì)胞包括多種細(xì)胞類型。
19.權(quán)利要求18的裝置，其中細(xì)胞類型沿著微通道長度變化。
20.權(quán)利要求I的裝置，進(jìn)一步包括在微通道中的流體。
21.權(quán)利要求20的裝置，其中流體包括下列中的至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖溶液、血液成分、全血、尿、透析液、水或?yàn)V液。
22.權(quán)利要求20的裝置，其中流體包括模擬體液的溶液。
23.權(quán)利要求20的裝置，其中在第一微通道和第二微通道中至少一個(gè)內(nèi)的流體力學(xué)參數(shù)值本質(zhì)上不同于在第三微通道中的流體力學(xué)參數(shù)值。
24.權(quán)利要求23的裝置，其中所述流體力學(xué)參數(shù)是壓力、流速、剪切率或粘性中的一個(gè)。
25.權(quán)利要求20的裝置，其中在第一微通道中的流體力學(xué)參數(shù)值本質(zhì)上不同于在第二微通道中的流體力學(xué)參數(shù)值。
26.權(quán)利要求20的裝置，進(jìn)一步包括在所述膜的與第三微通道同側(cè)上的第四微通道，該第四微通道中的流體力學(xué)參數(shù)值本質(zhì)上不同于第三微通道中的流體力學(xué)參數(shù)值。
27.權(quán)利要求20的裝置，其中在第一微通道和第二微通道中的至少一個(gè)的流體中的成分的濃度本質(zhì)上不同于在第三微通道中的流體中的該成分濃度。
28.權(quán)利要求20的裝置，其中在第一微通道和第二微通道中的至少一個(gè)的流體中的成分的濃度梯度本質(zhì)上不同于在第三微通道中的流體中的該成分的濃度梯度。
29.權(quán)利要求I的裝置，其中所述至少一個(gè)幾何參數(shù)沿微通道長度逐漸變化。
30.權(quán)利要求I的裝置，其中在第一微通道和第二微通道的至少一個(gè)中，所述至少一個(gè)幾何參數(shù)基于預(yù)先確定的流體力學(xué)曲線變化。
31.權(quán)利要求30的裝置，其中流體力學(xué)曲線包括對(duì)流傳輸曲線、擴(kuò)散傳輸曲線或切應(yīng)力曲線中的至少一個(gè)。
32.權(quán)利要求I的裝置，其中沿著一個(gè)微通道的長度的至少一個(gè)幾何參數(shù)的變化協(xié)助沿著那個(gè)微通道的化學(xué)刺激或機(jī)械刺激中的至少之一的變化。
33.培養(yǎng)細(xì)胞的方法，該方法包括 (a)提供生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器包括(i)至少一個(gè)聚合物層，其中限定第一微通道、第二微通道和第三微通道，和(ii)在其間的幾何重疊部分處將第一微通道和第二微通道與第三微通道分離的膜，該膜允許所述微通道的重疊部分之間的連通，其中至少一個(gè)微通道的至少一個(gè)幾何參數(shù)在重疊部分內(nèi)沿著微通道的長度變化； (b)向至少一個(gè)微通道中引入細(xì)胞；和 (C)培養(yǎng)細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將流體引入到至少一個(gè)微通道內(nèi)。
35.權(quán)利要求33的方法，其中步驟(c)包括將所述細(xì)胞暴露到機(jī)械刺激、化學(xué)刺激或生物刺激中的至少一種。
36.權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括測量細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述響應(yīng)包括細(xì)胞功能的變化。
38.權(quán)利要求33的方法，其中步驟(b)包括將細(xì)胞種植在至少一個(gè)微通道內(nèi)的選定位置。
39.權(quán)利要求38的方法，其中步驟(c)包括將種植于第一選定位置的細(xì)胞暴露于第一刺激并且將種植于第二選定位置的細(xì)胞暴露于第二刺激。
40.權(quán)利要求33的方法，其中步驟(b)包括將不同類型細(xì)胞引入到所述至少一個(gè)微通道內(nèi)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(b)包括將不同類型細(xì)胞引入到不同微通道內(nèi)。
42.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(b)包括將不同類型細(xì)胞種植到至少一個(gè)微通道內(nèi)的不同選定位置。
43.模擬腎臟的方法，該方法包括 (a)提供生物反應(yīng)器，其包括(i)至少一個(gè)聚合物層，其中限定第一微通道、第二微通道和第三微通道，和(ii)在其間的幾何重疊部分處將第一微通道和第二微通道與第三微通道分離的膜，該膜允許所述微通道的重疊部分之間的連通，其中至少一個(gè)微通道的至少一個(gè)幾何參數(shù)在重疊部分內(nèi)沿著微通道的長度變化，以便模擬腎臟結(jié)構(gòu)； (b)向至少一個(gè)微通道內(nèi)引入細(xì)胞；和 (C)培養(yǎng)細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括將該生物反應(yīng)器植入到患者內(nèi)。
45.權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括在腎臟治療中在體外使用該生物反應(yīng)器。
全文摘要
微流體生物反應(yīng)器裝置可以具有特征在于通過膜分開的兩個(gè)聚合物層中限定的相互交通的微通道。與一個(gè)層中的微通道相關(guān)的幾何參數(shù)沿這些通道長度可以變化。
文檔編號(hào)C12M3/06GK102666834SQ201080052259
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月5日
發(fā)明者J·L·查爾斯特, J·T·伯恩斯泰恩 申請(qǐng)人:查爾斯斯塔克德雷珀實(shí)驗(yàn)室公司