專利名稱：使用重組酵母的乙醇的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用具有木糖代謝能力的重組酵母的乙醇的制造方法。
背景技術(shù)：
纖維素系生物質(zhì)，一般作為乙醇等有用的醇和/或有機酸的原料被有效利用。在利用了纖維素系生物質(zhì)的乙醇制造中，為了提高乙醇的產(chǎn)量，開發(fā)了能利用五碳糖木糖作為底物的酵母。例如，專利文獻I公開了染色體中插入有來自樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因、以及來自釀酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶基因的酵母。此外，非專利文獻I和2也記載了在含有乙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)賦予了木糖代謝能力的酵母時，木糖的發(fā)酵速度會降低。并且，非專利文獻3還記載了被賦予了木糖發(fā)酵能力的酵母和木糖發(fā)酵速度提高了的變異株。然而，針對具有木糖代謝能力的酵母提高木糖代謝能力這樣的技術(shù)還不為人們所知?，F(xiàn)有技術(shù)文獻`專利文獻專利文獻1:日本特開2009-195220號公報非專利文獻非專利文獻I:FEMS Yeast Research, vol.9，2009，358-364非專利文獻2:Enzyme and Microbial Technology33, 2003, 786-792
非專利文獻 3:Appl.Microbiol.Biotechnol.2009, 84:37-5
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題因此本發(fā)明鑒于上述實際情況，目的在于提供通過提高具有木糖代謝能力的酵母中的木糖代謝能力來提高乙醇生產(chǎn)性的技術(shù)。用于解決課題的方法為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過進行使具有木糖代謝能力的酵母與含乙酸的溶液接觸的處理，從而該酵母的木糖代謝能力飛躍性地提高，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明包括以下(I) (5)。(I) 一種乙醇的制造方法，具有以下工序:使具有木糖代謝能力的酵母與含乙酸的溶液接觸的工序，和然后用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)該酵母從而進行乙醇發(fā)酵工序。(2)根據(jù)(I)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是被導(dǎo)入了木糖代謝相關(guān)基因的重組酵母。(3)根據(jù)⑵所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代謝相關(guān)基因是木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因和木酮糖激酶基因。(4)根據(jù)(I)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，使上述酵母與含乙酸的溶液接觸時，在需氧條件下進行。(5)根據(jù)(I)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述含乙酸的溶液是在酵母用培養(yǎng)基中添加有乙酸的組成。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明所涉及的乙醇的制造方法，能夠提高具有木糖代謝能力的酵母中的木糖代謝能力，其結(jié)果是乙醇的生產(chǎn)性大幅提高。通過利用本發(fā)明所涉及的乙醇的制造方法，可以使用例如木質(zhì)系生物質(zhì)以低成本的方式生產(chǎn)乙醇。


圖1是顯示使用了 XYL1、XYL2、XKS1基因過表達.GRE3基因缺失用DNA片段的重組的示意圖。圖2是顯示發(fā)酵實驗后分析乙醇濃度的結(jié)果的特性圖。圖3是顯示發(fā)酵實驗后分析木糖濃度的結(jié)果的特性圖。
具體實施例方式下面用附圖和實施例更詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明所涉及的乙醇的制造方法是利用具有木糖代謝能力的重組酵母由培養(yǎng)基中含有的木糖合成乙醇的方法，包括使該重組酵母與含乙酸的溶液接觸的處理工序。經(jīng)過該工序，重組酵母中的木糖 代謝能力大幅提聞，從而乙醇的生廣性大幅提聞。<重組酵母>本發(fā)明所涉及的乙醇的制造方法中所使用的重組酵母，至少在基因組中導(dǎo)入了木糖代謝相關(guān)基因。該重組酵母能將培養(yǎng)基中包含的木糖同化而生產(chǎn)乙醇。此外，培養(yǎng)基中包含的木糖可以是通過將以木糖作為構(gòu)成糖的木聚糖和/或半纖維素等糖化的工藝而得到的，也可以是培養(yǎng)基中含有的木聚糖和/或半纖維素等被糖化酶糖化而供給到培養(yǎng)基中的。后者的情況下，是指所謂同時糖化發(fā)酵的體系。木糖代謝相關(guān)基因是包含編碼將木糖轉(zhuǎn)換為木糖醇的木糖還原酶的木糖還原酶基因、編碼將木糖醇轉(zhuǎn)換為木酮糖的木糖醇脫氫酶的木糖醇脫氫酶基因、和編碼將木酮糖磷酸化而生成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因的含義。此外，通過木酮糖激酶而生成的木酮糖-5-磷酸進入戊糖磷酸途徑而被代謝。作為被導(dǎo)入酵母基因組的木糖代謝相關(guān)基因，不特別限定，可列舉來自樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因、來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的木酮糖激酶基因(參考 Eliasson A.et al., Appl.Environ.Microbiol, 66:3381-3386 及 Toivari MN et al.，Metab.Eng.3:236-249)。此外，作為木糖還原酶基因，可以利用來自熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、近平滑假絲酵母(Candida prapsilosis)的木糖還原酶基因。作為木糖醇脫氫酶基因,可以利用來自熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、近平滑假絲酵母(Candida prapsilosis)的木糖醇脫氫酶基因。作為木酮糖激酶基因，還可以利用來自樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因。此外，還可利用來自7卜>7。卜1J于7 7 夕一 (Streptomycesmurinus cluster)的木酮糖異構(gòu)酶基因等。此外，在本發(fā)明所涉及的乙醇的制造方法中使用的重組酵母中，除上述木糖代謝相關(guān)基因之外，還可導(dǎo)入與葡萄糖等的糖代謝相關(guān)的基因。作為一例，重組酵母優(yōu)選是通過導(dǎo)入β_葡萄糖苷酶基因而具有β_葡萄糖苷酶活性的酵母。這里β -葡萄糖苷酶活性是指催化糖的β -糖苷鍵的水解反應(yīng)的活性。即β -葡萄糖苷酶可將纖維二糖等纖維寡糖分解為葡萄糖。β-葡萄糖苷酶基因優(yōu)選作為細胞表面呈遞型基因被導(dǎo)入。這里，細胞表面呈遞型基因是指被改變成由該基因所編碼的蛋白質(zhì)以被展示在細胞的表層的方式表達那樣的基因。例如細胞表面呈遞型葡萄糖苷酶基因是融合有β_葡萄糖苷酶基因和細胞表層定位蛋白質(zhì)基因的基因。細胞表層定位蛋白質(zhì)是指被固定在酵母的細胞表層，存在于細胞表層的蛋白質(zhì)。例如作為凝集性蛋白質(zhì)的α-或a_凝集素、FLO蛋白質(zhì)等。通常細胞表層定位蛋白質(zhì)在N-末端側(cè)具有分泌信序列號并在C-末端側(cè)具有GPI錨附著識別信號。雖然在具有分泌信號方面與分泌性蛋白質(zhì)相同，但細胞表層定位蛋白質(zhì)在介由GPI錨被固定輸送到細胞膜上這方面與分泌性蛋白質(zhì)不同。細胞表層定位蛋白質(zhì)在通過細胞膜時GPI錨附著識別序列信號被選擇性地切斷，在新突出的C末端部分與GPI錨結(jié)合從而被固定在細胞膜上。之后GPI錨的根部被磷脂酰肌醇依賴性磷脂酶C(P1-PLC)切斷。接著，從細胞膜被切下的蛋白質(zhì)插入細胞壁并被固定在細胞表層，從而定位于細胞表層(例如，參照日本特開2006-174767號公報)。作為β -葡萄糖苷酶基因，不特別限定，可列舉例如來自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的 β -葡萄糖苷酶基因(Murai et al., Appl.Environ.Microbiol.64:4857-4861)。此外，作為β -葡萄糖苷酶基因，還可利用來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β -葡萄糖苷酶基因、來自卩遼纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)的β -葡萄糖苷酶基因和來自扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibligera)的β-葡萄糖苷酶基因等。<重組酵母的制作>通過將上述木糖代謝相關(guān)基因?qū)氤蔀樗拗鞯慕湍富蚪M中，從而可以制作能用于本發(fā)明的重組酵母。作為能用作宿主的酵母，不特別限定，可列舉休哈塔假絲酵母(Candida Shehatae)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)等酵母，特別優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。此外，作為酵母，可以是為了實驗方面的方便性而使用的實驗株，也可以是為了使用方面的有用性而使用的工業(yè)株(實用株)。作為工業(yè)株，可列舉例如用于葡萄酒、清酒和/或燒酎制作的酵母株。此外，作為成為宿主的酵母，優(yōu)選使用具有雌雄同株性的酵母。根據(jù)日本特開2009-34036號公報所公開的方法，通過使用具有雌雄同株性的酵母，可以簡便地向基因組中導(dǎo)入多拷貝基因。具有雌雄同株性的酵母和雌雄同株的酵母為同義。作為具有雌雄同株性的酵母，不特別限定，可使用任何酵母株。作為具有雌雄同株性的酵母，可列舉釀酒酵母0C-2株(NBRC2260)，但不限于此。此外，作為具有雌雄同株性的酵母，可列舉醇酵母(臺研396號、NBRC0216)(出處:“ — >酵母O諸特性(醇酵母的諸特性)”酒研會報、No37、pl8-22(1998.8))、在巴西和沖繩分離出的乙醇生產(chǎn)酵母(出處:“ 5i沖縄T分離L.^ Saccharomyces cerevisiae野生株O遺伝學(xué)的性質(zhì)(在巴西和沖繩分離的釀酒酵母野生株的遺傳學(xué)性質(zhì))”日本農(nóng)藝化學(xué)會志、Vol.65、N0.4、p759-762(1991.4))和180 (出處:“ T J1-一>発酵力Q強P酵母Q ^ ^ —二 > 7 (醇發(fā)酵能力強的酵母的篩選)”日本釀造協(xié)會志、Vol.82,N0.6、p439-443(1987.6))等。另外，即使是顯示雌雄異株的表型的酵母，也可通過以可表達的方式導(dǎo)入HO基因而制成具有雌雄同株性的酵母來使用。因此，在本發(fā)明中，具有雌雄同株性的酵母是也包含以可表達的方式導(dǎo)入了 HO基因的酵母的含義。其中，釀酒酵母0C-2株是一直以來在葡萄酒釀酒的現(xiàn)場被利用的被確認了安全性的菌株，因而優(yōu)選。此外釀酒酵母0C-2株如后述實施例所述的那樣，是在高糖濃度的條件下啟動子活性優(yōu)異的菌株，因而優(yōu)選。特別是釀酒酵母0C-2株在高糖濃度條件下丙酮酸脫羧酶基因(PDCl)的啟動子活性優(yōu)異，因而優(yōu)選。另外，作為導(dǎo)入的基因的啟動子，不特別限定，可利用例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的啟動子、高滲透壓應(yīng)答7基因(H0R7)的啟動子等。其中，丙酮酸脫羧酶基因(PDCl)的啟動子高表達下游的目的基因的能力高，因而優(yōu)選。即，上述基因可以與調(diào)控表達的啟動子和/或其他表達調(diào)控區(qū)一起導(dǎo)入酵母的基因組中?；蛘?，上述基因也可以以被成為宿主的酵母的基因組中本來存在基因的啟動子和/或其他表達調(diào)控區(qū)進行表達調(diào)控的方式導(dǎo)入。作為導(dǎo)入上述基因的方法，可以應(yīng)用已知作為酵母的轉(zhuǎn)化方法現(xiàn)有公知的任何方法。具體來說，例如，可以以電穿孔法“Meth.Enzym., 194, pl82 (1990) ”、原生質(zhì)球法“Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75pl929 (1978)”、乙酸鋰法 “J.Bacteriology, 153，pl63 (1983) ”、Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75pl929(1978)> Methods in yeast genetics, 2000Edition:ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual 等記載的方法實施,但不限于此。<乙醇制造>使用以上所說明的重組酵母制造乙醇時，在使用含木糖的培養(yǎng)基進行乙醇發(fā)酵培養(yǎng)之前，進行使該重組酵母與含乙酸的溶液接觸的處理。這里，含乙酸的溶液可以是乙酸水溶液、含有乙酸成分的液體培養(yǎng)基的任一者。乙酸水溶液可以通過將乙酸溶于水而制得。另夕卜，含有乙酸成分的液體培養(yǎng)基可以通過向SD培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、YPAD培養(yǎng)基、YM培養(yǎng)基等酵母用培養(yǎng)基中添加乙酸來調(diào)制。這里，對含乙酸的溶液中包含的乙酸濃度不特別限定，例如為I 20g/l，優(yōu)選為2 10g/l，更優(yōu)選為3 5g/l。含乙酸的溶液中所含的乙酸濃度如果低于上述范圍，則可能無法顯著提高上述重組酵母中的木糖代謝能力。另外，含乙酸的溶液中所含的乙酸濃度如果高于上述范圍，則可能阻礙上述重組酵母的生長。另外，對使重組酵母與含乙酸的溶液接觸的處理，不特別限定?？闪信e例如I小時以上，優(yōu)選為3小時以上，更優(yōu)選為10小時以上。重組酵母與含乙酸的溶液的接觸時間如果短于上述范圍，則可能無法顯著提高上述重組酵母中的木糖代謝能力。進而，使重組酵母與含乙酸的溶液接觸的處理，可以在含乙酸的溶液中加入了重組酵母的狀態(tài)下攪拌，也可以震蕩。此外，重組酵母與含乙酸的溶液接觸時，溶液溫度例如為20 40°C，優(yōu)選為25 37°C，更優(yōu)選為28 35°C。
特別地，使重組酵母與含乙酸的溶液接觸的處理，優(yōu)選使用含有乙酸的液體培養(yǎng)基作為含乙酸的溶液，在需氧條件下進行。這種情況下，在重組酵母通過與含乙酸的溶液接觸而木糖代謝能力提高的同時，可以通過增殖而確保適于乙醇發(fā)酵的菌體量。使重組酵母與含乙酸的溶液接觸后，從含乙酸的溶液中回收該重組酵母，用含木糖的培養(yǎng)基進行乙醇發(fā)酵。從含乙酸的溶液中回收重組酵母時，不特別限定，可應(yīng)用例如離心分離法、過濾等方法。從含乙酸的溶液中回收重組酵母時，優(yōu)選盡量去除含乙酸的溶液。這是為了防止由于含乙酸的溶液混入乙醇發(fā)酵中使用的含木糖的培養(yǎng)基中而造成的重組酵母的生長抑制、利用重組酵母的乙醇生產(chǎn)抑制。換句話說，在重組酵母的生長抑制、以及利用重組酵母的乙醇生產(chǎn)抑制十分微小，從乙醇生產(chǎn)性的觀點出發(fā)可以允許的情況下，即使規(guī)定量的含乙酸的溶液混入含木糖的培養(yǎng)基中也沒關(guān)系。此外，在從含乙酸的溶液中回收該重組酵母之后，為了除去含乙酸的溶液，可以對重組酵母進行洗凈處理。進行乙醇發(fā)酵的含木糖的培養(yǎng)基，作為碳源至少含有木糖即可，也可以是含有葡萄糖等其他碳源的培養(yǎng)基。此外，用于乙醇發(fā)酵的培養(yǎng)基也可使用添加了將纖維素系生物質(zhì)進行糖化處理后的糖化液的培養(yǎng)基。這種情況下，糖化液中包含來自纖維素系生物質(zhì)中所含的半纖維素的木糖。另一方面，作為用于乙醇發(fā)酵的培養(yǎng)基，也可以使用包含纖維素系生物質(zhì)的培養(yǎng)基。這種情況下，利用上述重組酵母進行的乙醇發(fā)酵成為所謂同時糖化發(fā)酵處理。這里，同時糖化發(fā)酵處理是指將糖化纖維素系生物質(zhì)的工序和乙醇發(fā)酵工序不區(qū)分地同時實施的處理。此外，在同時糖化發(fā)酵處理之前，可以對纖維素系生物質(zhì)實施現(xiàn)有公知的前處理。作為前處理，不特別限定，可列舉例如利用微生物分解木質(zhì)素的處理、和/或纖維素系生物質(zhì)的粉碎處理等。
·
在使用任一培養(yǎng)基的情況下，該重組酵母都能夠同化培養(yǎng)基中含有的木糖而生成乙醇。此外，作為糖化方法沒有特別限制，可列舉利用纖維素酶和/或半纖維素酶等纖維素酶制劑的酶法等。纖維素酶制劑含有與纖維素鏈和半纖維素鏈的分解相關(guān)的酶，顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性、內(nèi)切木聚糖酶活性、纖維二糖水解酶活性、葡萄糖苷酶活性和木糖苷酶活性等多種活性。作為纖維素酶制劑，沒有特別限制，可列舉例如由里氏木霉(Trichodermareesei)、解纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)等所生產(chǎn)的纖維素酶。作為纖維素酶制劑，也可以使用市售品。在同時糖化發(fā)酵處理中，向含有纖維素系生物質(zhì)(可以是前處理后)的培養(yǎng)基中加入纖維素酶制劑和上述重組微生物，在規(guī)定的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)該重組酵母。作為培養(yǎng)溫度沒有特別限制，考慮乙醇發(fā)酵的效率可以為25 45°C，優(yōu)選為30 40°C。此外培養(yǎng)液的PH值優(yōu)選為4 6。此外，培養(yǎng)時也可以進行攪拌和/或震蕩。在本發(fā)明所涉及的利用重組酵母的乙醇的制造方法中，在乙醇發(fā)酵之后從培養(yǎng)基中回收乙醇。對乙醇的回收方法沒有特別限制，可采用現(xiàn)有公知的任意方法。例如，在上述乙醇發(fā)酵結(jié)束后，通過固液分離操作將含有乙醇的液層、與含有重組酵母和固體成分的固層分離。然后將液層中含有的乙醇用蒸餾法進行分離、純化，從而可以回收純度高的乙醇。此外，乙醇的純化度可以根據(jù)乙醇的使用目的而適宜調(diào)整。實施例以下使用實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限制于以下實施例。[實施例1]本實施例中為了制作木糖同化酵母，將二倍體酵母0C2-T株(Saitoh，S.等、J.Ferment.Bioeng.1996年、81卷、98-103頁)的GRE3基因進行單拷貝缺失，導(dǎo)入XYL1、XYL2及XKSl基因。XYL1、XYL2、XKS1某閔i寸表汰.GRE3某閔缺失用DNA片段的制成以酵母BY4742株(Open Biosystems)的基因組DNA為模板，用PCR擴增包含GRE3基因及其5’上游和3’下游非翻譯區(qū)的DNA片段。PCR用的引物分別使用TB2358(5’ -TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3’:序列號 I)和 TB2359(5’ -AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3’:序列號 2)。此外，用于酵母BY4742株的DNA序列擴增的PCR引物的設(shè)計參考了 Saccharomyces GenomeDatabase (酵母基因組數(shù)據(jù)庫)的DNA序列數(shù)據(jù)。以質(zhì)粒pUC19為模板，用PCR擴增包含在PUC19的多克隆位點切斷那樣的pUC19全長的直鏈DNA片段。PCR用的引物分別使用TB2373(5’-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3’:序列號 3)和 TB2374 (5，-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3’:序列號 4)。將上述兩種 DNA 片段使用 In-Fusion AdvantagePCR Cloning Kit(夕力 7 八 4 才)進行克隆化，命名為 pUC19_5U_GRE3-GRE3_3U_GRE3。以pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3為模板，用PCR擴增包含GRE3基因的5’上游及3’下游非翻譯區(qū)和pUC1 9的區(qū)域的DNA片段，以酵母BY4742株的基因組DNA為模板，用PCR擴增包含TEFl啟動子區(qū)的DNA片段、XKSl基因、包含HIS3終止子區(qū)的DNA片段。PCR用引物分別使用 TB3018(5’ -AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3’:序列號 5)與 TB3017 (5，-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3’:序列號 6)、TB2210 (5，-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3’:序列號 7)與 TB2269 (5，-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3’:序列號 8)、TB2345 (5，-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3’:序列號 9)與 TB2346(5’ -CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3’:10 序列號)、TB1401(5’ -TGCGGCCGGCCGCAGC-3’:序列號 11)和 TB2683(5’ -GCGCCTCGTTCAGAATGA-3’:序列號12)。將上述四種DNA片段使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit進行克隆化，命名為 pUC19-5U_GRE3-P_TEFl-XKSl-T_HIS3-3U_GRE3。以 pUC19-5U_GRE3-P_TEFl-XKSl-T_HIS3-3U_GRE3 為模板，用 PCR擴增包含在 HIS3終止子區(qū)與GRE3基因的3’下游非翻譯區(qū)之間切斷那樣的質(zhì)粒全長的直鏈DNA片段，以酵母BY4742株的基因組DNA為模板，用PCR擴增包含TDH2啟動子區(qū)的DNA片段、包含ILV3終止子區(qū)的DNA片段，以樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的基因組DNA為模板，用PCR擴增 XYLl 基因。PCR 用引物分別使用 TB9020(5’-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3’:序列號 13)與TB2457(5，-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3，:序列號 14)、TB2844 (5，-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3’:序列號 15)與 TB2595(5’ -TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3’:序列號 16)、TB2314(5’ -AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’:序列號 17)與TB2455(5’ -GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3’:序列號 18)、TB2456 (5，-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’:19 序列號)與 TB3019 (5 ’-AITTTACTGGCTGGAAITTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’:20序列號)。此外，用于XYLl基因序列擴增的PCR引物設(shè)計參考了在GeneBank中登錄的樹干畢赤酵母XYLl基因(登錄號XM_001385144)。將上述四種 DNA 片段使用 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit 進行克隆化，命名為 pUC19_5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE30以 pUC19-5U_GRE3-P_TEFl-XKSl-T_HIS3-P_TDH2-XYLl-T_ILV3-3U_GRE3 為模板，用PCR擴增包含在ILV3終止子區(qū)與GRE3基因的3’下游非翻譯區(qū)之間切斷那樣的質(zhì)粒全長的直鏈DNA片段，以酵母BY4742株的基因組DNA為模板，用PCR擴增含有I3DCl啟動子區(qū)的DNA片段和含有ILV6終止子區(qū)的DNA片段，以樹干畢赤酵母的基因組DNA作為模板，用PCR擴增 XYL2 基因。PCR用引物分別使用 TB2375 (5，-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3’:序列號 21)與 TB3021 (5’-AITTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’:序列號 22)、TB2010 (5’-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3，:序列號 23)與 TB2261 (5 ’-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3’:序列號 24)、TB3022(5’ -TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3’:序列號 25)與 TB2347 (5’-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3，:序列號 26)、TB2351 (5 ’-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3’:序列號 27)與 TB2352(5’ -GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3’:序列號28)。此外，用于XYL2基因序列擴增的PCR引物設(shè)計參考了在GeneBank中登錄的樹干畢赤酵母XYL2基因(登錄號AF127801或X55392)。將上述四種DNA片段使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit進行克隆化，命名為 pUC19-5U_GRE3-P_TEFl-XKSl-T_HIS3_P_TDH2-XYL1-T_ILV3-1LV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3。以 pUC19-5U_GRE3-P_TEF卜XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYU-T_ILV3-1LV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3為模板，用PCR擴增GRE3基因的從5’上游非翻譯區(qū)至3’下游非翻譯區(qū)的DNA片段。將本片段(圖1)用于制成XYL1、XYL2、XKSl基因過表達.GRE3基因
缺失株。XYL1、XYL2、XKS1某閔i寸表汰.GRE3某閔異缺失株的制作

使用XYL1、XYL2、XKSl基因過表達.GRE3基因缺失用DNA片段，將0C2-T株用Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(ZYM0RESEARCH)按照試劑盒附帶的方案進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，接種在以木糖為單獨碳源的平板中，在30°C下培養(yǎng)7天，獲得轉(zhuǎn)化體。由轉(zhuǎn)化體制備基因組DNA，通過PCR法，使用作為插入DNA片段的外側(cè)和載體內(nèi)側(cè)的引物的TB2356(5’-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3’:序列號 29)和 TB592 (5，-GAAAITTAGTATGCTGTGCTTGGG-3’:序列號30)，確認了在染色體正常地單拷貝插入。發(fā)酵試齡將獲得的轉(zhuǎn)化體接種于YH)培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)或者YPD乙酸培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、乙酸I 5g/L，用氨水調(diào)整至pH值5)，在30°C進行24小時的震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離(2000g、3分鐘)回收菌體。向50ml容量的燒瓶中各自加入50ml的木糖培養(yǎng)基(木糖60g/L、酵母提取物IOg/L)、葡萄糖/木糖培養(yǎng)基(葡萄糖90g/L、木糖60g/L、酵母提取物10g/L)或者葡萄糖培養(yǎng)基(葡萄糖90g/L、酵母提取物10g/L)，按菌體濃度為菌體干重0.3g/l的比例接菌，在80轉(zhuǎn)/分鐘(震幅35mm)、34°C條件下進行48小時發(fā)酵，使用HPLC(LC_10A ;島津制作所)測定乙醇和木糖的濃度。測定條件為，柱使用AmineXHPX-87H(BIO-RAD)，檢測器使用示差折射率檢測器RID-10A(島津制作所)，在流動相為0.0lN的H2S04、流量為0.6ml/分鐘、溫度為30°C的條件下進行分析。乙醇的濃度分析結(jié)果示于圖2。如圖2所示，發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，在木糖培養(yǎng)基中，與無乙酸處理區(qū)相比，在培養(yǎng)液中添加了 3g/L以上的乙酸的處理區(qū)，乙醇生產(chǎn)速度提
高。另一方面，在葡萄糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)中，乙醇生產(chǎn)速度無差異。木糖濃度的分析結(jié)果示于圖3。如圖3所示，使用木糖培養(yǎng)基/葡萄糖培養(yǎng)基的情況下，雖然木糖的消耗速度在添加3g/L以上的乙酸的處理區(qū)著提高，但葡萄糖的消耗量則與對照沒有差異。
以上的結(jié)果表明，通過在乙醇發(fā)酵工序之前使具有木糖代謝能力的重組酵母與含乙酸的溶液(本實施例中為含乙酸的液體培養(yǎng)基)接觸，該重組酵母中的木糖代謝能力大幅提高。此外，即使使具有木糖代謝能力的重組酵母與含乙酸的溶液接觸，該重組酵母所具有的葡萄糖代謝能力也沒有較大的改善。由此明確了，在使具有木糖代謝能力的重組酵母與含乙酸的溶液接觸的情況下，在該重組酵母中的碳源同化能力中，可以特異性地改善木糖代謝能力。
權(quán)利要求
1.一種乙醇的制造方法，具有以下工序:使具有木糖代謝能力的酵母與含乙酸的溶液接觸的工序，和然后用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)該酵母從而進行乙醇發(fā)酵工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是被導(dǎo)入了木糖代謝相關(guān)基因的重組酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代謝相關(guān)基因是木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因和木酮糖激酶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，使上述酵母與含乙酸的溶液接觸時，在需氧條件下進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述含乙酸的溶液是在酵母用培養(yǎng)基中添加有乙酸的 組成。
全文摘要
提高具有木糖代謝能力的酵母中的木糖代謝能力。具有以下工序?qū)⒕哂心咎谴x能力的酵母浸漬在含乙酸的溶液中的工序，和然后用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)該酵母從而進行乙醇發(fā)酵的工序。
文檔編號C12N1/15GK103180451SQ20108006974
公開日2013年6月26日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者大西徹, 富永詠美子, 保谷典子 申請人:豐田自動車株式會社