專利名稱：無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物與細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用自絮凝菌在搖床中不借助載體介質(zhì)進(jìn)行無(wú)載體固定化培養(yǎng)、同時(shí)產(chǎn)生絮凝率較好的微生物絮凝劑的方法。
背景技術(shù)：
微生物絮凝劑是微生物的代謝產(chǎn)物，并不是微生物生存所必需的，而是它對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)。它是利用微生物技術(shù)，由細(xì)菌、真菌等微生物發(fā)酵獲得的，是一類具有絮凝效果的高效、無(wú)毒、無(wú)二次污染的水處理劑。相對(duì)于無(wú)機(jī)高分子和合成有機(jī)高分子絮凝劑，微生物絮凝劑具有使用方便、絮凝范圍廣、活性高、安全無(wú)毒、不污染環(huán)境的特點(diǎn)，對(duì)大腸桿菌、酵母、泥漿水、河水、粉煤灰水、活性碳粉水、膨脹污泥、紙漿廢水等均有極好的絮凝和脫色效果，可廣泛用于畜產(chǎn)廢水、膨化污泥、有色廢水的處理。因此微生物絮凝劑的研究是當(dāng)今世界絮凝劑方面研究的重要課題。通過(guò)構(gòu)建能產(chǎn)高效的復(fù)合菌群并對(duì)絮凝菌進(jìn)行固定化，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用海藻酸鈣包埋后的微生物絮凝菌能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較高的活性， 且固定化后的細(xì)胞對(duì)染料廢水具有較好的脫色效果。如果對(duì)固定化菌群不斷地重新培養(yǎng)復(fù)活，可達(dá)到連續(xù)生產(chǎn)微生物絮凝劑的目的。為提高絮凝劑的絮凝率，現(xiàn)在主要有兩種方法1、優(yōu)化復(fù)合型絮凝劑。發(fā)明專利“新型復(fù)合絮凝劑及其制備方法(CN03115197. 3)”指出，將30— 40份硫酸亞鐵鐵晶體和10— 40份的硫酸鋁混合均勻，邊攪拌邊加入98%硫酸10-15份，冷卻至常溫后慢慢加入 6-20份雙氧水，慢速攪拌后靜置，制得一種復(fù)合絮凝劑。該種絮凝劑對(duì)鹵制品廢水的脫色和化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand, COD)去除效果明顯，但是該絮凝劑不能長(zhǎng)期保存， 需要隨配隨用，不易保存；2、選育能夠產(chǎn)生高效絮凝劑的菌株。論文《一種高效微微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化》指出，經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)與純化，從活性污泥中挑選出一株具有絮凝活性的菌株MBF-33，該菌株所產(chǎn)的絮凝劑對(duì)高嶺土懸浮液體系有較好的絮凝作用。通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化后，對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率從81. 3%提高到95%。上述兩種方法制取絮凝劑均需分離菌體與絮凝劑，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)增加分離成本。固定化細(xì)胞培養(yǎng)是利用物理或化學(xué)手段將游離的細(xì)胞或酶與固態(tài)的不溶性載體相結(jié)合，使其保持活性并可反復(fù)使用的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)分批游離發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有細(xì)胞負(fù)荷高、生物催化高效、細(xì)胞可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與產(chǎn)物分離，有利于實(shí)現(xiàn)工藝過(guò)程的自動(dòng)化、連續(xù)化，降低生產(chǎn)成本。具體表現(xiàn)在(1)生物反應(yīng)器中可以獲得極高的菌體濃度，因而發(fā)酵速率可以大大提高，生物反應(yīng)器設(shè)備的生產(chǎn)強(qiáng)度得以強(qiáng)化；(2)產(chǎn)物分離純化過(guò)程中，菌體與發(fā)酵液的分離十分容易；(3)固定化培養(yǎng)出的菌體可以重復(fù)或長(zhǎng)期使用，這樣既能夠簡(jiǎn)化游離細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需要不斷培養(yǎng)菌體的操作步驟，又減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了生產(chǎn)率。
目前，已存在的固定化培養(yǎng)方法主要為微載體細(xì)胞培養(yǎng)法(專利《一種新型米根霉固定化發(fā)酵載體單元》)。這種培養(yǎng)方法是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用的微載體(支撐材料)，使細(xì)胞在微載體表面附著和生長(zhǎng)，并通過(guò)不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。但是，影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要包括三個(gè)方面(1)細(xì)胞群體大小、狀態(tài)和類型。(2)微載體表面狀態(tài)、吸附的分子類型。(3)培養(yǎng)基組成、溫度、pH以及代謝廢物。另外，傳統(tǒng)的載體固定化細(xì)胞技術(shù)還存在以下問(wèn)題1、生理方面載體材料有時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生比較大的生理毒性，影響目標(biāo)代謝物的生物合成；2、生態(tài)方面載體材料使細(xì)胞和小細(xì)胞群體相互分隔，這樣容易形成不利于細(xì)胞之間彼此協(xié)調(diào)的環(huán)境，影響代謝產(chǎn)物的生物合成；3、工藝方面載體固定化細(xì)胞的大規(guī)模制備過(guò)程復(fù)雜，容易引起雜菌感染；4、工程方面一方面載體固定化細(xì)胞的傳質(zhì)性能較差，外部營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和內(nèi)部代謝產(chǎn)物濃度梯度較大，使其整體活性較低，另一方面生物反應(yīng)器中流體流動(dòng)的沖刷和代謝過(guò)程內(nèi)部所產(chǎn)氣體的脹裂還會(huì)造成載體固體化細(xì)胞的破裂，影響其連續(xù)使用的壽命；5、經(jīng)濟(jì)方面 載體材料的使用和不斷消耗帶來(lái)了附加成本。所以載體固定化細(xì)胞技術(shù)尚未出現(xiàn)真正大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的實(shí)例。基于以上問(wèn)題，人們提出了無(wú)載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。無(wú)載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有非常突出的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)為1、方法非常簡(jiǎn)單，可以在生物反應(yīng)器中逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，降低細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的附加成本；2、自絮凝細(xì)胞顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，傳質(zhì)阻力很小，而且顆粒內(nèi)部表面不斷自我更新，顆粒整體活性非常好；3、在一定的生理、生態(tài)、物理、化學(xué)和流體力學(xué)條件下，小顆粒的絮凝和大顆粒的解離可以呈動(dòng)態(tài)平衡，故不存在載體固定化細(xì)胞的強(qiáng)度問(wèn)題，如發(fā)明專利“米根霉無(wú)載體固定化細(xì)胞培養(yǎng)方法(CN. 101157894A)”，但是該方法必須使用化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的甲基硅油作為添加劑，以達(dá)到菌體形態(tài)均一規(guī)則的目的，這就增加了工業(yè)無(wú)載體固定化培養(yǎng)的附加成本。綜上所述，無(wú)載體固定化技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、 不消耗輔助材料、生物反應(yīng)器中菌體濃度高、發(fā)酵強(qiáng)度大、連續(xù)使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，展示了良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。不足的地方是需要使用細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物生物合成所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以外的化學(xué)物質(zhì)。(引自論文《無(wú)載體固定化細(xì)胞的研究進(jìn)展》)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)成本低、培養(yǎng)時(shí)間短、菌體與代謝產(chǎn)物分離方法簡(jiǎn)單的無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，本方法在不需添加額外添加劑的情況下，就可實(shí)現(xiàn)高效率微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的規(guī)模生產(chǎn)，而且培養(yǎng)所得的菌絲球與微生物絮凝劑均可產(chǎn)生絮凝作用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，特征是在培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基體積 0. 1%-1%的自絮凝菌孢子懸浮液，其中每毫升懸浮液中含自絮凝菌孢子IO6個(gè)，放入搖床中培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)條件:150-180轉(zhuǎn)/min,溫度20-30°C，pH 3. 5—10. 5，培養(yǎng)24-120小時(shí)后，將由自絮凝菌生成的菌絲球與發(fā)酵液靜置分離，固體部分是菌絲球，液體部分是微生物絮凝劑；所述培養(yǎng)基為C:N=5 :1-30:1，硝酸鈉1-10 g/L，磷酸氫二鉀0. 1-2 g/L，硫酸鎂 (MgSO4 ·7Η20) :0. 1-0. 5 g/L，硫酸亞鐵0. 01 g/L,蔗糖是碳源；氯化鉀0. 1-60 g/L 和氯化鈉0. 03—30g/L中的一種或兩種。所述培養(yǎng)基中含有氯化鉀為30-50 g/L或含有氯化鈉10—25g/L。所述的自絮凝菌為曲霉中的米曲霉、土曲霉、醬油曲霉中的一種或多種混合物。
本發(fā)明是以蔗糖作為碳源，硝酸鈉為氮源，利用自絮凝菌能形成菌絲球的特點(diǎn)，通過(guò)控制培養(yǎng)基中的鹽分，使自絮凝菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到絲狀菌產(chǎn)微生物絮凝劑目的，通過(guò)本方法制備的微生物絮凝劑有如下優(yōu)點(diǎn)①成本低，用無(wú)機(jī)氮源替代價(jià)高的有機(jī)氮源，②微生物絮凝劑與菌體的分離僅需靜置而無(wú)需目前常用的離心分離的方法。③生產(chǎn)條件粗放， 能產(chǎn)生微生物絮凝劑的pH、C:N適應(yīng)范圍較大，在pH:3. 5 10. 5、C:N=5:1 30:1的范圍內(nèi)皆能產(chǎn)生微生物絮凝劑，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。④絮凝活性高，發(fā)酵產(chǎn)生的微生物絮凝劑，在高嶺土絮凝實(shí)驗(yàn)中絮凝效率在95%左右，染料廢水實(shí)驗(yàn)中的脫色率在擬％左右，可以用于處理多種印染廢水。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
在500ml的錐形瓶中加入蔗糖30g/L，硝酸鈉lg/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂 (MgS04 ‘ 7H20) 0. lg/L，硫酸亞鐵 0. 01g/L，氯化鉀60g/L，氯化鈉 30g/L 的 300ml 查氏完全培養(yǎng)基，并加入接種量為3ml的米曲霉懸浮液，每毫升懸浮液中含自絮凝菌孢子IO6 個(gè)，放入搖床中培養(yǎng)發(fā)酵，搖床控制在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速150r/min，pH為5，培養(yǎng)Mh，將由自絮凝菌生成的菌絲球與發(fā)酵液靜置分離，固體部分是菌絲球，液體部分是微生物絮凝劑。實(shí)施例2:
在500ml的錐形瓶中加入蔗糖20g/L，硝酸鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂 (MgS04 ·7Η20) :0. 5g/L，硫酸亞鐵0. 01g/L，氯化鉀:50g/L的300ml發(fā)酵培養(yǎng)基，并加入接種量為6ml的醬油曲霉懸浮液，每毫升懸浮液中含自絮凝菌孢子IO6個(gè)，搖床控制在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速180r/min，在不同pH值下培養(yǎng)36h ，將由自絮凝菌生成的菌絲球與發(fā)酵液靜置分離，固體部分是菌絲球，液體部分是微生物絮凝劑。醬油曲霉發(fā)酵制備微生物絮凝劑對(duì)高嶺土、染料廢水絮凝效率的測(cè)定。結(jié)果如表 1
表1 不同PH值條件下發(fā)酵培養(yǎng)微生物絮凝的絮凝性能比較
權(quán)利要求
1.一種無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，特征是在培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基體積0. 1%-1%的自絮凝菌孢子懸浮液，其中每毫升懸浮液中含自絮凝菌孢子IO6個(gè)，放入搖床中培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)條件:150-180轉(zhuǎn)/min,溫度20-30°C，pH 3. 5—10. 5，培養(yǎng)24-120小時(shí)后，將由自絮凝菌生成的菌絲球與發(fā)酵液靜置分離，固體部分是菌絲球，液體部分是微生物絮凝劑；所述培養(yǎng)基為C:N=5 :1-30:1，硝酸鈉1-100 g/L，磷酸氫二鉀0. 1-2 g/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) :0. 1-0. 5 g/L，硫酸亞鐵0. 01 g/L,蔗糖是碳源；氯化鉀0. 1-60 g/ L和氯化鈉0. 03—30g/L中的一種或兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中含有氯化鉀為30-50 g/L和含有氯化鈉10—25g/L中的一種或兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，其特征在于所述的自絮凝菌為曲霉中的米曲霉、土曲霉、醬油曲霉中的一種或多種混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)載體固定化培養(yǎng)微生物絮凝劑的方法，特征是培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基體積0.1%-1%的自絮凝菌孢子懸浮液，其中每毫升懸浮液中含自絮凝菌孢子106個(gè)，放入搖床中培養(yǎng)發(fā)酵，培養(yǎng)條件150-180轉(zhuǎn)/min,溫度20-30℃，pH3.5-10.5，培養(yǎng)24-120小時(shí)后，靜置，使由自絮凝菌生成的菌絲球與發(fā)酵液分離，固體部分是菌絲球，液體部分就是微生物絮凝劑。本發(fā)明是以蔗糖作為碳源，硝酸鈉為氮源，利用自絮凝菌能形成菌絲球的特點(diǎn)，通過(guò)提高培養(yǎng)基中的鹽濃度，使自絮凝菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到自絮凝菌產(chǎn)微生物絮凝劑的目的，通過(guò)本方法制備的微生物絮凝劑具有成本低、生產(chǎn)條件粗放、絮凝活性高的優(yōu)點(diǎn)，可以用于處理多種印染廢水。
文檔編號(hào)C12P1/02GK102174582SQ201110053509
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者周松, 曾建忠, 林俊岳, 胡萃, 賀根和, 陳紅梅, 黃翔峰 申請(qǐng)人:井岡山大學(xué)