專利名稱：一種突變型jnk1序列及其質(zhì)粒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，是關(guān)于一種能被ATP類似物INM-PPl特異性抑制的突變型JNKl的序列及其質(zhì)粒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是促有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的主要成員之一。JNK信號通路可以被多種應(yīng)激(如細(xì)胞因子、紫外照射、熱休克、滲透壓等)所激活，進而參與到細(xì)胞增殖與分化、凋亡與生存等生理過程中。此外，JNK信號通路在免疫細(xì)胞(主要是T細(xì)胞)的分化過程中起到了重要的作用。JNK基因有3個亞型，即JNKl，JNK2和JNK3，可以經(jīng)過選擇性剪切形成10種剪接體。其中JNKl和JNK2在組織中廣泛表達，而JNK3僅在腦、心臟和睪丸中表達。JNK主要被上游的MAP激酶MKK4和MKK7所激活，被激活的JNK會磷酸化其底物 c-Jun，進而激活c-Jun從而增強其轉(zhuǎn)錄活性。越來越多的研究表明，JNK與許多疾病有著密切的關(guān)系，JNK信號通路功能可能與慢性炎癥、神經(jīng)退行性變、糖尿病和腫瘤等多種疾病有關(guān)。因此，JNK信號通路作為臨床相關(guān)疾病的治療靶點而受到人們的關(guān)注。隨著JNK信號通路研究的深入，人們開始關(guān)注其特異性抑制劑的開發(fā)。但是，許多的商業(yè)化的JNK信號通路特異性的抑制劑在特異性上一直存在一定的缺陷。例如，最被廣泛應(yīng)用的JNK信號通路抑制劑是SP600125，它是JNK1、2、3的ATP競爭性抑制劑。SP600125能夠特異性地抑制JNK而對另外兩個MAK激酶(ERK和p38)沒有影響，因此，它被廣泛應(yīng)用于JNK信號同路的研究中。但是不幸的是，人們漸漸發(fā)現(xiàn)，SP600125在抑制JNK的同時，會抑制許多其他的蛋白激酶，并且使得細(xì)胞被異常激活。此外，特異性抑制劑只能同時抑制JNK家族3種異構(gòu)體的活性，目前，還沒有抑制劑能夠選擇性地分別抑制JNK1、2和3。抑制劑的特異性不強也為進一步研究JNK功能、其底物的篩選以及JNK信號通路相關(guān)疾病藥物的開發(fā)帶來了許多技術(shù)難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種突變型的JNKl序列，其序列參見附件《突變型JNKl核酸及氨基酸序列》或光盤。所述的mutant-JNKl是在野生型的JNKl的序列基礎(chǔ)上將其第108位的甲硫氨酸(Met，ATG)突變?yōu)楦拾彼?Gly，GGG)，第168位的亮氨酸(Leu，CTT)突變?yōu)楸彼?Ala，GCG)，通過突變，可以放大JNKl的ATP結(jié)合位點，從而使其能夠被ATP類似物競爭性地結(jié)合其ATP結(jié)合位點，從而抑制其活性。本發(fā)明的另一目的在于提供mutant-JNKl的表達質(zhì)粒(以下簡稱mutant-JNKl)及其應(yīng)用。


圖I為突變型JNKl序列的突變位點
圖2為mutant-JNKl質(zhì)?？梢哉１磉_與MEFs細(xì)胞中圖3為mutant-JNKl質(zhì)粒具有野生型JNKl的活性圖4為INM-PPl可以抑制mutant-JNKl的活性但野生型的JNKl不受其影響圖5為INM-PPl在25分鐘時開始起抑制作用并且該抑制作用能持續(xù)36小時以上
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以下實例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。實施例I :突變型JNKl序列的突變及其質(zhì)粒的構(gòu)建先通過下列引物將野生型JNKl克隆出來，并使其帶上Bam HI和Xho I的酶切位
占-
^ \\\ 5， CCCGGATCCATGAGTGACAGTAAAAGCGAT 3，5’ CCCCTCGAGTTACTGCTGCATCTGTGCTGA 3’然后通過BamHI和XhoI雙酶切，再用T4連接酶將突變的JNKl連接到pcDNA 3. I載體上。最后通過下列引物，利用點突變試劑盒的說明書，進行兩個位點的突變M108G :5’GTGTACTTGGTAGGGGAACTAATGGAT 3’5’ ATCCATTAGTTCCCCTACCAAGTACAC 3’L168A :5’ACCCTCAAGATCGCGGACTTTGGCCTG 3’5， CAGGCCAAAGTCCGCGATCTTGAGGGT 3，完整mutant-JNKl序列請參照附件《突變型JNKl核酸及氨基酸序列》或光盤。實施例2 mutant-JNKl質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染MEFs (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系)接種在DMEM完全培養(yǎng)基(含10 %，100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素)中，于37°C，5% C02孵箱培養(yǎng)，每隔I 2天傳代I次，實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞。實驗分3組control組,野生型JNKl組，mutant-JNKl組。按ExGen 500操作說明進行，ExGen 500與質(zhì)粒的比例為I :4ii g。實施例3 ffestern Blot檢測轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染48小時后，各組細(xì)胞去除培養(yǎng)基上清，加入細(xì)胞裂解液后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞收集到I. 5ml的EP管中，4°C搖晃裂解20分鐘，然后12000rcf離心15分鐘，取上清為蛋白裂解液于_70°C凍存，備用。蛋白裂解液使用前，先用BCA法測蛋白濃度，讀取0D562值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度使每個樣品的上樣總蛋白量為100 yg。樣品加蛋白上樣緩沖液100°C煮5 IOmin后，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后，80V恒壓轉(zhuǎn)印80min到0. 45 ii m的PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，把含有樣品的PVDF膜用TBS配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2小時。然后按說明書使用量加入I : 1000稀釋兔抗鼠X-press單克隆抗體，4°C孵育一抗過夜；TBS洗3次，每次10分鐘；加入I : 1000稀釋的HRP-羊抗兔二抗，37°C反應(yīng)2小時。TBS洗3次，每次10分鐘。最后用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影并保存圖像。結(jié)果表明，mutant-JNKl質(zhì)粒能夠很好地表達與MEFs細(xì)胞系(圖2)。實施例4 :激酶活性實驗檢測mutant-JNKl的生物學(xué)活性按實例2的方法將mutant-JNKl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MEFs細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染至36小時用只I %血清的培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞12小時，然后用TNF- a刺激15分鐘，再按實例3的步驟收集細(xì)胞裂解液。將30 ill 50%的Protein A beads、300 裂解緩沖液、30 y g細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑以及相應(yīng)抗體混合，在雜交爐上搖晃過夜；快速離心30秒，用裂解緩沖液洗兩次，棄上清；快速離心30秒，用Hepes緩沖液洗兩次,棄上清；最后快速離心30秒后，將上清棄干凈；加入激酶反應(yīng)體系30 ill :5 ill 6 X JNK緩沖液、5 ii I ATP混合物(通常是0. 3u I 1禮的正常六1 加上0.5111(￥-32 )六1 (1011(^/111)，最后用水補足5111)、11^的GST-c-Jun混合，用水補足30 U I ；30度孵育I小時；加10 yl的4X SDS上樣緩沖液，100度孵育5分鐘，離心后將40 Ul樣品加到13%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳；電泳結(jié)束后將膠烘干后用磷板曝光，掃描后存下圖像。結(jié)果表明，mutant-JNKl質(zhì)粒在正常情況下具有野生型JNKl的活性，在TNF-a的刺激下能被激活，從而活化其底物(圖3)。實施例5 INM-PPl可以抑制mutant-JNKl的激酶活性但野生型JNKl不受影響按照實例4的步驟轉(zhuǎn)染并饑餓處理細(xì)胞，在TNF- a處理前用INM-PPl預(yù)處理細(xì)胞I小時，然后用TNF-a刺激。然后按照實例4的步驟檢測激酶活性。結(jié)果表明INM-PPl可以很好地抑制mutant-JNKl的激酶活性，但是野生型JNKl并不受INM-PPl的影響(圖4)。 實施例6 INM-PPl從25分鐘時開始抑制mutant-JNKl的激酶活性并且該抑制作用能持續(xù)36小時以上按照實例4的步驟轉(zhuǎn)染并饑餓處理細(xì)胞，在TNF- a處理前用INM-PPl按不同時間點預(yù)處理細(xì)胞，然后按照實例4的步驟檢測激酶活性。結(jié)果表明INM-PPl從25分鐘時開始便可以抑制mutant-JNKl的激酶活性并且該抑制作用能持續(xù)36小時以上(圖5)。
權(quán)利要求
1.利用突變技術(shù)改造的JNK序列，其特征為通過對其第108位的甲硫氨酸(Met)和第168位的亮氨酸(Leu)的突變，擴大其ATP結(jié)合位點，從而使其能夠被ATP類似物抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的突變序列，構(gòu)建的突變型JNK質(zhì)粒，其特征為利用該質(zhì)粒載體在MEFs中表達突變型的JNK，該JNK擁有野生型JNK的激酶活性且在INM-PPl存在的情況下，其激酶活性能被特異性抑制。
3.將突變型JNK質(zhì)粒表達于所有細(xì)胞的方法，其特征在于方法是基于權(quán)利要求書I和/或權(quán)利要求書2所述的。
4.利用突變型JNK質(zhì)粒進行篩選JNK底物、JNK特異性抑制劑以及JNK通路相關(guān)藥物的方法，其特征在于方法是基于權(quán)利要求書I和/或權(quán)利要求書2所述的。
5.利用突變型JNK質(zhì)粒進行細(xì)胞周期中JNK功能的研究方法，其特征在于方法是基于權(quán)利要求書I和/或權(quán)利要求書2所述的。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種突變型JNK1序列及其質(zhì)粒的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明通過化學(xué)基因策略，對JNK1基因第108位的甲硫氨酸(Met)和第168位的亮氨酸(Leu)進行突變，分別用甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)代替。突變后的JNK1的ATP結(jié)合位點被放大，從而能夠結(jié)合ATP類似物。該質(zhì)粒在正常情況下，具有野生型JNK1的生物學(xué)功能，但是在ATP類似物1NM-PP1存在的情況下，1NM-PP1可以通過競爭性地結(jié)合ATP結(jié)合位點而抑制JNK1的激酶活性。該質(zhì)?？梢栽贘NK1的底物、JNK1的特異性抑制劑以及JNK通路相關(guān)疾病候選藥物的篩選中發(fā)揮重要作用。同時也能為在細(xì)胞周期中精確研究JNK1的功能提供有力的工具。
文檔編號C12N9/12GK102676466SQ201110064319
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者侯亞義, 謝浩, 趙光鋒 申請人:南京大學(xué)