專利名稱：與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記SIsv0046的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種分子標記，特別是涉及一種與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在谷子剛毛顏色基因定位或谷子遺傳育種中的用途。
背景技術：
我國是谷子(Setaria italica L. Beauv.)的原產(chǎn)國，是世界上谷子的集中種植國，谷子在我國的國民經(jīng)濟和社會生產(chǎn)中占有重要的地位。在耕地資源不斷減少、水資源日益短缺、平衡膳食熱逐漸升溫、畜牧業(yè)不斷發(fā)展的形勢下，谷子作為一種抗旱耐瘠作物，有著其他作物無法替代的意義和作用。因此，加速谷子的育種進程尤為重要。當前，有關谷子的研究手段和方法還很落后，如何應用先進科學的研究手段搞好谷子育種是一個嚴峻的問題。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新的思路和手段。開發(fā)具有我國特色的重要性狀基因的分子標記并進行輔助選擇育種研究，將對提高我國谷子育種水平起到促進作用。絕大多數(shù)品種的谷子都具有剛毛，其長短與品種有關。早在50年代，王伏雄曾系統(tǒng)觀察了谷子穗分化的過程，根據(jù)剛毛最初出現(xiàn)的原基與普通小穗的原基在三級枝梗上的排列和解剖鏡下無明顯的形態(tài)區(qū)別，認為剛毛是退化的小穗形成的。剛毛是早期發(fā)生退化的小穗的小穗柄。普通小穗、剛毛、剛毛小穗均系同源器官(鄭丕堯，趙明.“谷上谷”生育性狀的觀察I.穗分化進程與剛毛小穗的發(fā)育.作物學報，1989，15(1) :53-58)。谷子剛毛有幾種顏色，對控制谷子剛毛顏色的相關基因目前尚無人研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于PCR擴增與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記的引物對，以及由該引物對擴增獲得的分子標記。本發(fā)明的再一目的是提供上述分子標記在谷子剛毛顏色基因定位、檢測以及谷子輔助育種中的用途以及上述分子標記的檢測方法。本發(fā)明的目的還包括提供一種包括上述分子標記的載體，以及含有該載體的重組細胞；提供一種包括使用上述分子標記的谷子剛毛顏色基因的定位方法，和使用所述分子標記的谷子輔助育種方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記含有 Seq ID No. 1所示序列；優(yōu)選的所述分子標記具有kq ID No. 1所示序列。本發(fā)明還公開了一種擴增與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記的引物對，所述引物對的引物1含有kq ID No. 2所示序列，引物2含有kq ID No. 3所示序列；優(yōu)選的所述引物1具有ID No. 2所示序列，引物2具有kq ID No. 3所示序列；
Seq ID No. 2 :5，-CCTTCTGATTCCTCTCCTGT-3，；Seq ID No. 3 5' -AGTTCAGGCTCAAACTCAGT-3，。本發(fā)明還公開了一種與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記是由上述的引物對以剛毛為紅色的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增得到的。優(yōu)選的由上述引物對擴增得到的分子標記含有kq ID No. 1所示序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記(含有kq ID No. 1所示核苷酸序列的DNA片段)為谷子基因組中％(1 ID No. 1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的％(1 ID No. 1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選的，為谷子基因組ID No. 1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領域技術人員可以理解，只要擴增或者檢測剛毛紅色的谷子基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增得到含有 Seq ID No. 1所示的序列。kq ID No. 1的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當長度，并不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，OOObp, 小于1，500bp、小于1，200bp、小于1，OOObp、或者小于800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記(含有kq ID No. 1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的kq ID No. 1的5’端和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術語“可操作地” 在本發(fā)明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當?shù)刂糜贗D No. 1的一個位置上，以致該控制序列指導kq ID No. 1編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標記的表達載體或者克隆載體。獲得上述重組載體后，本領域技術人員可以理解，根據(jù)不同的需要，將重組載體轉化到合適的細胞中，得到含有該重組載體的重組細胞。因此，本發(fā)明還公開了一種含有所述重組載體的重組細胞。本發(fā)明還公開了本發(fā)明的分子標記的制備方法，包括下述步驟使用剛毛顏色為紅色的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物對進行PCR擴增，得到的654bp擴增產(chǎn)物即含有所述分子標記；優(yōu)選地，還包括將PCR擴增產(chǎn)物進行純化的步驟。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發(fā)明的分子標記。本發(fā)明還公開了所述分子標記的檢測方法，包括步驟根據(jù)上述分子標記的核苷酸序列設計引物，以被檢測谷子基因組DNA為模板進行擴增，并判斷擴增產(chǎn)物中是否存在該分子標記。優(yōu)選的，所述引物為上述分別含有IDID No. 3的引物對。例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(Seq ID No. 2和Seq ID No. 3)進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。可以將得到的擴增產(chǎn)物進行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明還公開了所述的分子標記在谷子剛毛顏色基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子剛毛顏色基因定位的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的分子標記的步驟。本發(fā)明還公開了所述的分子標記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明還公開了一種谷子輔助育種方法，所述方法包括檢測本發(fā)明的分子標記或使用本發(fā)明中擴增分子標記的引物對的步驟。本發(fā)明的分子標記可用于今后的分子標記輔助育種中，本領域技術人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標記來篩選谷子是否含有控制剛毛顏色的基因 (例如，可以參考，DNA分子標記在小麥抗病育種中的用途，隴東學院學報(自然科學版)， 2006年4月第16卷第1期，P65-69)。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點。在本發(fā)明中，具體地，所述谷子可以為張谷1號、谷子A2不育系、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產(chǎn)生的F2代。其中，張谷1號、張雜谷3號或張雜谷3號自交產(chǎn)生的部分F2 代剛毛顏色為紅色；谷子A2不育系、張雜谷3號自交產(chǎn)生的部分F2代剛毛顏色為綠色。由于采用以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供了與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記將基因組 DNA序列與谷子剛毛顏色基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記與谷子剛毛顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為5. 2cM。本發(fā)明的分子標記及分子標記擴增引物可以簡便、快速、高通量地應用于谷子育種實踐和資源及品種鑒定。


圖1 分子標記引物(Seq ID No. 2和kq ID No. ；3)對F2代480個單株擴增的部分結果。其中泳道1-12為F2代中12株谷子剛毛顏色為紅色的單株的PCR擴增產(chǎn)物； 泳道13- 為F2代中12株剛毛顏色為綠色的單株的PCR擴增產(chǎn)物。泳道M為marker，其為 IOObp DNALadder ；其分子量包括、1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、 400bp、300bp、200bp 以及 IOObp0
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種引物對以及與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記 SIsv0046。利用本發(fā)明的引物對，以谷子基因組DNA為模板進行PCR，可以得到與谷子剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記在本發(fā)明中命名為分子標記SIsv0046。需要指出的是，本領域技術人員可以理解，除了通過上述PCR擴增獲得本發(fā)明的分子標記外，還可以通過化學合成獲得本發(fā)明的分子標記。本發(fā)明的引物對分別含有序列表kq ID No. 2和kq ID No. 3所示序列，Seq ID No. 2 5' -CCTTCTGATTCCTCTCCTGT-3，；Seq ID No. 3 5' -AGTTCAGGCTCAAACTCAGT-3，。本領域技術人員熟知，在上述kq ID No. 2和kq ID No. 3所示序列中，可在其5， 端或3’端分別增加1 10個堿基，所增加的堿基類型可根據(jù)谷子基因組DNA上與％(1 ID 似.2和％(1 ID No. 3相匹配區(qū)域的堿基類型并依據(jù)堿基配對原則來確定，由此得到的引物對與kq ID No. 2和kq ID No. 3的擴增產(chǎn)物基本相同(上游和下游引物之間的DNA序列相同)。因此，上述在kq ID No. 2和kqlD No. 3的5’端或3’端分別增加1 10個堿基并能擴增得到基本相同DNA片段的引物對，均包括在本發(fā)明的引物對中。在本發(fā)明具體的實施方式中，本發(fā)明的引物對優(yōu)選Skq IDID No. 3所示序列。本發(fā)明將父本剛毛為紅色和母本剛毛為綠色的純合子雜交，獲得Fl代(張雜谷3號)，再以Fl代自交產(chǎn)生F2代群體，共480個單株。優(yōu)選的采用SV分子標記開發(fā)方法，首先對父本進行de novo測序(60X contig N50 :22K, scaffold N50 :320K ；Total size :400Mb)，母本重測序(IOX)； 然后根據(jù)父母本測序數(shù)據(jù)，利用華大自主開發(fā)的SOAP軟件比較父母本之間的序列差異，分別在父本差異序列的5’端和3’端外側約50bp位置，隨機選取20bp左右的長度設計差異序列擴增的引物，根據(jù)不同的差異序列設計了 1105對引物。以父母本及Fl的DNA為模板進行擴增，從1105對引物中篩選出616對具有多態(tài)性和有效性的引物。采用開發(fā)出的616 對引物，對F2群體的480個個體進行PCR檢測，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Map Maker3. 0軟件進行遺傳圖譜繪制，得到本發(fā)明所述的與剛毛顏色基因緊密連鎖的分子標記，及其擴增引物。采用篩選出的引物對擴增的父本序列，即本發(fā)明中的分子標記SIsv0046。對F2個體進行性狀分析，并根據(jù)表型性狀數(shù)據(jù)和基因性狀數(shù)據(jù)將谷子剛毛顏色基因定位在遺傳圖譜上。下面通過具體實施例并結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例1 谷子F2代分離群體的構建父本抗拿捕凈，株型高，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠，花粉黃白色，抽穗期為晚期。父本為張谷1號種子。母本不抗拿捕凈，株型矮，旗葉短而寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃，花粉棕色，抽穗期為早期。母本為谷子A2不育系種子。F2群體構建父本和母本雜交得到Fl代(Fl剛毛顏色為紅色)，F(xiàn)l自交得到F2。 其中Fl是張雜谷3號種子。共得F2代單株480株，其中剛毛為紅色的有360株，綠色的有 120株。上述張谷1號種子、谷子A2不育系種子及張雜谷3號種子可參見中國專利申請《與谷子抗除草劑基因緊密連鎖的分子標記SIsv0372》，
發(fā)明者全志武, 夏秋菊, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司