專利名稱：一株米根霉菌株及其誘變篩選方法和發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株米根霉菌株及其誘變篩選方法和發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法，具體涉及同步糖化發(fā)酵淀粉質(zhì)原料的富馬酸生產(chǎn)菌，以及獲得該菌株誘變篩選方法和利用該菌株以淀粉質(zhì)為原料生產(chǎn)富馬酸的方法。
背景技術(shù)：
富馬酸(Fumaric acid)作為一種重要的有機(jī)基本化工原料和大宗化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于涂料、樹(shù)脂、醫(yī)藥、增塑劑、食品添加劑等領(lǐng)域，具有重要的市場(chǎng)價(jià)值。同時(shí)，以富馬酸為原料可以進(jìn)一步合成多種高價(jià)值衍生物，如富馬酸二甲酯(DMF)、富馬酸亞鐵等。另外， 富馬酸作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物，還可以通過(guò)酶催化轉(zhuǎn)化、酯化、加氫等工藝生產(chǎn) L-天冬氨酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、1，4-丁二醇、Y-丁內(nèi)酯和四氫呋喃等四碳化合物。目前工業(yè)上生產(chǎn)富馬酸主要采用化學(xué)法，在催化劑的存在下，將苯或丁烯氧化生成順丁烯二酸或順丁烯二酸酐，再經(jīng)異構(gòu)化而得富馬酸，其所面臨的主要難題是化石資源的短缺、生產(chǎn)成本的提高以及對(duì)環(huán)境的污染。20世紀(jì)70年代石油危機(jī)的出現(xiàn)，使得人們加大了對(duì)微生物發(fā)酵法制備富馬酸的研究力度，人們用來(lái)發(fā)酵制備富馬酸的微生物有霉菌、 酵母及細(xì)菌。其中根霉菌具有養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)以及生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，又是重點(diǎn)研究的對(duì)象，如米根霉、少根根霉以及黑根霉等。而其中米根霉(脅辦印狀仗尺泌)作為富馬酸生產(chǎn)的最佳菌株之一，廣泛受到關(guān)注。但目前發(fā)酵法生產(chǎn)富馬酸并未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，其主要原因是原料費(fèi)占富馬酸生產(chǎn)的很大一部分，降低原材料成本成為生物法制備富馬酸的唯一出路(Gangl IC, Weigang WA, Keller FA. Appl Microbiol Biotechnol, 1990，24-25 (1) 663-667)，而傳統(tǒng)的工藝?yán)昧畠r(jià)的淀粉質(zhì)原料來(lái)生產(chǎn)富馬酸的產(chǎn)量都很低(Moresi M, Parente E, Petruccioli M, Federici F J. Chem Tech Biotechnol, 1992， 54(3):283-290; Carta FS, Soccol CR, Ramos LP, Fontana JD. BioresourTechnol, 1999，68 (1) : 2318)，因此針對(duì)底物譜的擴(kuò)寬來(lái)改良菌株成為首要工作。研究表明，2-D-脫氧葡萄糖(2-DG)作為葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，是菌體進(jìn)行水解酶(糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶，葡糖苷酶)合成的分解代謝阻遏物，因而常用來(lái)篩選抗分解代謝阻遏的糖化酶高的突變株((^hosh A, Chatterjee B, Das A Biotechnol Lett, 1991, 13(7)515-520； Sarangbin S, Kirimura K, Usami S, Appl Microbiol Biotechnol, 1993(2-3), 40:206-210; Chandra Μ, Kalra A, Sangwan NS, Gaurav SS, Darokar PM, Sangwan SR. Bioresour Technol, 2009，100 ) : 1659-1662)。 如果能提高米根霉自身的糖化酶活力，在不需對(duì)淀粉質(zhì)原料進(jìn)行糖化預(yù)處理的情況下，就能同步糖化發(fā)酵淀粉質(zhì)原料來(lái)生產(chǎn)富馬酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能同步糖化發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)富馬酸的米根霉。提供該米根霉菌株的誘變篩選方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該米根霉發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法。本發(fā)明目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一、一株米根霉菌株，其分類命名為脅辦印狀oryzae ME-F13，保藏日期為2010年 12月16日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC NO =M 2010351 ；所述的脅辦印肪oryzae ME-F13能以淀粉質(zhì)原料為碳源，采用同步糖化工藝發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸。二、本發(fā)明所述的脅辦印狀oryzae ME-F13的誘變篩選方法，其特征在于包括以下步驟
1)將米根霉出發(fā)菌株脅辦印狀oryzaeME-F12 (ME-UN-8)進(jìn)行離子注入物理誘變，得到突變株；
2)將上述步驟1)獲得的突變株菌液涂布于含有2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)，得到耐受2-D-脫氧葡萄糖的米根霉；
3)對(duì)步驟2)所得的耐受2-D-脫氧葡萄糖的菌株的抗性穩(wěn)定性進(jìn)行考察，挑取單菌落以可溶性淀粉為碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最終選定其中一株糖化酶活力及富馬酸的產(chǎn)量比原始菌株增加最多的菌株，命名為oryzae ME-F13。其中，步驟1)所述的離子注入物理誘變方法，其中離子注入條件是采用15KeV N+ 注入誘變，注量為50X1013 300X 1013/Cm2，靶室真空度為10_3 Pa。其中，步驟2)所述的方法中含2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基中2-D-脫氧葡萄糖的濃度為0.2 0.6 g/L。其中，步驟3)所述的方法中含2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基中碳源為甘油，其濃度為30 g/L，其他營(yíng)養(yǎng)成分組成尿素為2 g/L, KH2PO4為0.6 g/L, MgSO4 · 7H20為 0. 5 g/L, ZnSO4 為 0· 11 g/L, FeSO4 · 7H20 為 0. 088 g/L，瓊脂為 20 g /L0三、利用本發(fā)明所述的脅辦印狀oryzae ME-F13同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法.M Rhirnms oryzae ME-F13孢子懸浮液接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中利用菌株自產(chǎn)的糖化酶同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸；其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源是淀粉質(zhì)原料液化液。具體地，將經(jīng)斜面培養(yǎng)6 7天的Tfeii^OT1S oryzae ME-F13用無(wú)菌水洗下孢子， 制成孢子懸浮液，接種于種子培養(yǎng)基中，在30 40°C、pH 2. 0 2. 7條件下培養(yǎng)28 32 h，再將種子按照5% 10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 40°C條件下培養(yǎng)60 85 h ；其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基是由淀粉質(zhì)原料液化液與無(wú)機(jī)鹽成分混合后，分別在 115 121°C條件下滅菌15 20 min，冷卻后混合得到，發(fā)酵培養(yǎng)基中另外添加CaCO3作為中和劑。其中，淀粉質(zhì)原料液化液的制備方法是淀粉質(zhì)原料與水以8-12%的比例混合成糊狀后，加熱到70 0C，再加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800 1000 U/g干淀粉質(zhì)原料，保溫 10 min后繼續(xù)加熱到90°C，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100°C煮沸5 10 min，然后趁熱經(jīng)過(guò)兩層紗布過(guò)濾，濾液冷卻后加水調(diào)整糖度，制成淀粉質(zhì)原料液化液。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明以富馬酸生產(chǎn)菌米根霉脅辦印狀oryzae ME-F12 (ME_UN_8)為出發(fā)菌株，采用上述方法篩選得到的能同步糖化發(fā)酵淀粉質(zhì)原料的富馬酸生產(chǎn)菌突變株oryzae ME-F13，該突變株自身的糖化酶活力得到很大提高，大約是原始菌株的2. 5倍，利用該突變菌株以淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)富馬酸時(shí)，采用不需另外添加商品糖化酶的同步糖化發(fā)酵工藝。以淀粉質(zhì)原料液化液為底物，利用菌株自身產(chǎn)生的糖化酶同步糖化發(fā)酵，此工藝不僅具有同步糖化工藝的優(yōu)點(diǎn)，如減輕了高濃度底物的抑制作用、節(jié)省發(fā)酵時(shí)間和設(shè)備投資，而且解決了同步糖化中糖化酶活力和發(fā)酵條件(溫度，PH)相沖突的問(wèn)題，具備優(yōu)異的工業(yè)化生產(chǎn)前
旦
ο


圖1為篩選菌株富馬酸產(chǎn)量對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式一般性說(shuō)明
本發(fā)明所述的淀粉質(zhì)原料液化液的制備方法淀粉質(zhì)原料與水以8-12%的比例混合成糊狀后，加熱到70°C，加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800 U/g干淀粉質(zhì)原料，保溫10 min后繼續(xù)加熱到90°C，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100°C煮沸5 10 min,然后趁熱經(jīng)過(guò)兩層紗布過(guò)濾，濾液冷卻后加水調(diào)整糖度，制成淀粉質(zhì)原料液化液。溴甲酚綠固體培養(yǎng)基溴甲酚綠0.2 g/L，脫膽酸鈉1.0 g/L，可溶性淀粉80 g/L， 尿素 1 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 0. 11 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 088 g/ L，瓊脂 20 g/L。2-D-脫氧葡萄糖-甘油選擇性固體培養(yǎng)基2-D_脫氧葡萄糖0.2 g/L，甘油30 g/ L，尿素 2 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 0. 11 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 088 g/L，瓊脂 20 g /L02-D-脫氧葡萄糖-葡萄糖選擇性固體培養(yǎng)基組成2-D_脫氧葡萄糖0. 6 g/L，葡萄糖 30 g/L，尿素 2 g/L, KH2PO4 0.6 g/L，MgSO4 · 7H20 0.5 g/L，ZnSO4 0. 11 g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0.088 g/L，瓊脂 20 g /L0種子培養(yǎng)基1組成可溶性淀粉30 g/L,尿素2 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, ZnSO4 0. 11 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 088 g/L, pH2. 5 2. 7。種子培養(yǎng)基2組成全玉米粉、脫胚玉米粉或木薯粉30 g/L, pH2. 5 2. 7。發(fā)酵培養(yǎng)基1 組成可溶性淀粉80 g/L，尿素 0. 1 g/L, KH2PO4 0. 6 g/L, MgSO4 ·7Η20 0. 5 g/L, ZnSO4 0. 11 g/L, FeSO4 · 7H20 0. 088 g/L, CaCO3 40 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基2組成全玉米粉、脫胚玉米粉或木薯粉80 120 g/L, CaCO3 40 _60g/ L0富馬酸的HPCL的測(cè)定方法富馬酸是采用DIONEX summit P680高效液相色譜儀測(cè)定。色譜柱為Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)，柱溫65°C紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相為 5 mmol/L H2SO4,流速為 0. 8 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μ L。實(shí)施例1 離子注入誘變處理米根霉
取培養(yǎng)5 6天孢子顏色多而且黑的米根霉Tfeii^OT1S oryzae ME-F12 (CCTCC NO: M 207023)斜面(斜面培養(yǎng)基即為PDA固體培養(yǎng)基)一支，用無(wú)菌水洗脫孢子，接于已經(jīng)滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35°C及200 rpm充分振蕩30 min，使孢子均勻分散，用滅過(guò)菌的脫脂棉、兩層紗布或兩層檫鏡紙過(guò)濾，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)， 調(diào)整孢子濃度為IO7個(gè)/mL，作為待處理菌液，取0. 1 mL待處理菌液，均勻涂布于無(wú)菌條件下室溫風(fēng)干。然后將這些孢子培養(yǎng)皿放入離子注入機(jī)內(nèi)，靶室抽真空至10_3 Pa,選用15 KeV (50\1013 300\1017(^12劑量，靶室真空度為10_3 1 對(duì)這些孢子進(jìn)行處理。然后取出培養(yǎng)皿，以1 mL無(wú)菌水洗脫，調(diào)整孢子濃度為IO6備用。實(shí)施例2 菌種篩選
初篩取100 μ L經(jīng)過(guò)離子注入誘變后所得孢子懸浮液涂布于2-D脫氧葡萄糖-甘油選擇性固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)2 3 d。挑取在2-D-脫氧葡萄糖-甘油選擇性固體培養(yǎng)基中存活的單菌落，用打孔器將其移入溴甲酚綠固體培養(yǎng)基進(jìn)行第二次初篩。米根霉生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的富馬酸可以使菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基出現(xiàn)黃色的變色圈，通過(guò)測(cè)量變色圈直徑與菌落直徑，計(jì)算兩者比值，選取比值較大的菌株轉(zhuǎn)接到2-D-脫氧葡萄糖-葡萄糖選擇性固體培養(yǎng)基，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代，都能生長(zhǎng)且產(chǎn)孢的的菌株，轉(zhuǎn)接至PDA斜面上保藏，進(jìn)行復(fù)篩。搖瓶復(fù)篩經(jīng)過(guò)第一輪的初篩，得到14株抗2-D-脫氧葡萄糖的突變株，將其按實(shí)例1方式制成孢子懸浮液，以m的接種量接種于種子培養(yǎng)基1，置于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上，35°C培養(yǎng)30 h后，將所得的種子以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基2，置于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上，35°C培養(yǎng)60 85h，測(cè)其最終富馬酸的產(chǎn)量，其結(jié)果如圖1所示，其中5株同步糖化發(fā)酵可溶性淀粉的富馬酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株高出10%以上，分別為DG-3，DG-6，DG-8， DG-12, DG-14。實(shí)施例3 突變株與原始菌株的發(fā)酵性能的比較
將經(jīng)斜面培養(yǎng)6 7天的產(chǎn)酸量最高的突變株DG-3用無(wú)菌水洗下孢子，制成孢子懸浮液，接種于種子培養(yǎng)基1中，在35°C、200 rpm、pH 2. 5條件下培養(yǎng)30h，再將種子按照10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C、200 rpm條件下培養(yǎng)85 h，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)其糖化酶和富馬酸的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，其平均結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明在相同的發(fā)酵條件下， Rhizopus oryzae ME-F12 (ME-U
N-8)經(jīng)誘變處理和篩選后，得到的一株突變株DG-3的糖化酶活力比原始菌株增加了 156%，富馬酸的產(chǎn)量高達(dá)39. 80 g/L，比原始菌株增加了觀％。
表權(quán)利要求
1.一株米根霉菌株，其分類命名為oryzae ME-F13，保藏日期為2010年 12月16日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC NO =M 2010351。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脅辦印狀oryzaeME-F13的誘變篩選方法，其特征在于包括以下步驟1)將米根霉出發(fā)菌株oryzaeME-F12進(jìn)行離子注入物理誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株菌液涂布于含有2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)，得到耐受2-D-脫氧葡萄糖的米根霉；3)對(duì)步驟2)所得的耐受2-D-脫氧葡萄糖的菌株的抗性穩(wěn)定性進(jìn)行考察，挑取單菌落以可溶性淀粉為碳源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最終選定其中一株糖化酶活力及富馬酸的產(chǎn)量比原始菌株增加最多的菌株，命名為oryzae ME-F13。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Rhizopusoryzae ME-F13的誘變篩選方法，其特征在于步驟1)所述的離子注入誘變方法中離子注入條件是采用15KeV N+注入誘變，注量為 50X1013 300X 1013/cm2，靶室真空度為 IO"3 Pa。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TSii^wAsoryzae ME-F13的誘變篩選方法，其特征在于步驟2)所述的方法中含2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基中2-D-脫氧葡萄糖的濃度為0. 2 0. 6 g/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TSii^WAsoryzae ME-F13的誘變篩選方法，其特征在于步驟2)所述的方法中含2-D-脫氧葡萄糖的選擇性固體培養(yǎng)基中碳源為甘油，其濃度為30 g/ L，其他營(yíng)養(yǎng)成分組成尿素為 2 g/L，KH2PO4 為 0. 6 g/L，MgSO4 · 7H20 為 0. 5 g/L，ZnSO4 為 0. 11 g/L, FeSO4 · 7H20 為 0. 088 g/L，瓊脂為 20 g /L0
6.利用權(quán)利要求1所述的oryzaeME-F13同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法，其特征在于將脅辦印狀oryzae ME-F13孢子懸浮液接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中利用菌株自產(chǎn)的糖化酶同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸；其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源是淀粉質(zhì)原料液化液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于具體的方法是將經(jīng)斜面培養(yǎng)6 7天的 Rhizopus oryzae ME-F13用無(wú)菌水洗下孢子，制成孢子懸浮液，接種于種子培養(yǎng)基中，在 30 40°C、pH 2. 5 2. 7條件下培養(yǎng)28 32 h，再將按照5% 10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 40°C下培養(yǎng)60 85 h ；其中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基是由淀粉質(zhì)原料液化液與無(wú)機(jī)鹽成分混合后，分別在115 121°C條件下滅菌15 20 min，冷卻后混合得到，發(fā)酵培養(yǎng)基中另外添加CaCO3作為中和劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的淀粉質(zhì)原料液化液的制備方法是淀粉質(zhì)原料與水以8-12%的比例混合成糊狀后，加熱到70°C，加入耐高溫淀粉酶，加酶量為800 1000 U/g干淀粉質(zhì)原料，保溫10 min后繼續(xù)加熱到90°C，碘檢不變色后繼續(xù)加熱到100°C煮沸5 10 min，然后趁熱經(jīng)過(guò)兩層紗布過(guò)濾，濾液冷卻后加水調(diào)整糖度，制成淀粉質(zhì)原料液化液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的淀粉質(zhì)原料為可溶性淀粉、玉米粉、脫胚玉米粉或木薯粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株米根霉菌株及其誘變篩選方法和發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的方法。該菌株分類命名為米根(Rhizopusoryzae)ME-F13，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M2010351。得到該菌株的方法是采用離子注入物理誘變處理出發(fā)菌株ME-F12，然后將處理后的菌液涂布含2-D-脫氧葡萄糖(2-DG)的選擇固體平板上培養(yǎng)，挑取抗2-DG的單菌落同步糖化淀粉質(zhì)原料發(fā)酵制備富馬酸。采用此方法篩選到的菌株糖化酶活力得到了提高，在對(duì)淀粉質(zhì)原料不需要進(jìn)行糖化處理的情況下，能直接利用其發(fā)酵，降低生產(chǎn)成本，具有工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N13/00GK102174419SQ20111007228
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者徐晴, 李霜, 鄧月芳, 高敏, 黃和 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)