專利名稱：用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條、pcr引物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種用于醫(yī)學(xué)上用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，本發(fā)明還涉及一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，縮略詞為PCR)引物；本發(fā)明還涉及一種用于診斷非綜合征耳聾的試劑盒。
背景技術(shù)：
耳聾是一種最常見的人類感覺系統(tǒng)缺陷，因其病因復(fù)雜、發(fā)生率高和治療困難等原因而長(zhǎng)久地困擾著廣大患者及其周圍人群，極大地影響著相互交流和生活質(zhì)量。重度耳聾在新生兒中發(fā)生率高達(dá)l/80(Tl/1000，全世界將近有七千萬人罹患55分貝以上的聽力減退。造成耳聾有多方面的原因，遺傳因素是主要原因。耳聾可以由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起。也可由環(huán)境因素、或基因與環(huán)境兩者共同作用而致。耳聾可分綜合征型和非綜合征型，伴隨有其他組織器官的病變的耳聾屬于綜合征型聽力缺損 (syndromic hearing impairment, SHI)，不伴有其他癥狀的耳聾屬于非綜合征型聽力缺損 (nonyndromic hearing impairment，NSHI)。而70 %的遺傳性耳聾表現(xiàn)為非綜合征耳聾 (即除耳聾外不伴有其他癥狀和體征)。至2011年1月1日止，與非綜合征耳聾相關(guān)的25 個(gè)常染色體隱性基因、36個(gè)常染色體顯性基因、2個(gè)X連鎖基因已被克隆，而每個(gè)基因中又散在數(shù)目眾多的耳聾突變位點(diǎn)，因而具有較高的基因和位點(diǎn)遺傳異質(zhì)性。最近，在國(guó)內(nèi)開展的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，相當(dāng)一部分非綜合征耳聾僅由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變引起，如GJB2、SLC26A4，mtDNA 12s rRNA及GJB3等，這為我們大規(guī)模開展耳聾基因篩查及診斷提供了理論依據(jù)。目前，傳統(tǒng)基因診斷方法包括酶切，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)，直接測(cè)序等，這些方法或者不能定性，或者耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時(shí)對(duì)不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。而基因芯片法雖然能同時(shí)對(duì)不同基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，但它所需設(shè)備和耗材昂貴，不適用于在臨床大規(guī)模推廣，應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條、一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，以及一種用于診斷非綜合征耳聾的試劑盒；本發(fā)明具有高通量、高效率、價(jià)格低廉、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)和大規(guī)模人群篩查。本發(fā)明的一種用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條采用以下的技術(shù)方案
所述用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，其特征在于包括基底，以及固定在所述基底上的突變檢測(cè)探針，每一條所述突變檢測(cè)探針分別對(duì)應(yīng)包含一個(gè)非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，所述非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)為以下位點(diǎn)中的至少一個(gè)GJB2基因的CDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA^9-300 位點(diǎn)，GJB3 基因的 CDNA538 位點(diǎn)，mtDNA 12s rRNA 基因的cDNA1555、cDNA1494位點(diǎn)，SLC26A4基因的cDNA2168、IVS7-2位點(diǎn)；每一條所述突變檢測(cè)探針包含15-25個(gè)堿基的序列，在所述序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的非綜合征耳聾基因的突變堿基。優(yōu)選的，所述突變檢測(cè)探針為SEQ ID NO. Γ SEQ ID NO. 9中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。優(yōu)選的，所述基底上還固定有正常對(duì)照探針，其與所述突變檢測(cè)探針固定在所述基底的不同位置上。優(yōu)選的，所述正常對(duì)照探針為SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 18中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。優(yōu)選的，每一個(gè)所述正常對(duì)照探針都對(duì)應(yīng)包含一個(gè)所述非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，其中，SEQ ID NO. 10對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為CDNA35，SEQ ID NO. 11對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA176-191，SEQ ID NO. 12對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA235，SEQ ID NO. 13對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA^9-300位點(diǎn)，SEQ ID N0. 14對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA538，SEQ ID NO. 15對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA1494，SEQ ID N0. 16對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA1555， SEQ ID NO. 17對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA2168，SEQ ID N0. 18對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為 IVS7-2。優(yōu)選的，所述突變檢測(cè)探針和/或正常對(duì)照探針的3’或5’端帶有氨基標(biāo)記。本發(fā)明的一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物采用以下的技術(shù)方案 所述用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的基因突變位點(diǎn)，所
述PCR引物為以下5對(duì)中的至少一對(duì)SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 20 ；SEQ ID N0. 21和SEQ ID N0. 22 ； SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 ； SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 ； SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 ；其中 SEQ ID N0. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27是上游引物；SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28是下游引物。優(yōu)選的，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物分別包括如下位點(diǎn)引物SEQ ID N0. 19和SEQ ID N0. 20 擴(kuò)增 GJB2 基因的 cDNA35、cDNA176_191、cDNA235、cDNA299_300 位點(diǎn)，引物 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 擴(kuò)增 GJB3 基因的 cDNA538 位點(diǎn)，引物 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID NO. M 擴(kuò)增 mtDNA 12S rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位點(diǎn)，引物 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 擴(kuò)增 SL(^6A4 基因的 cDNA2168 位點(diǎn)，引物 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 擴(kuò)增 SL(^6A4 基因的IVS7-2位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述上游引物和/或下游引物的5’端帶有生物素或熒光標(biāo)記。本發(fā)明的一種用于診斷非綜合征耳聾的試劑盒采用以下的技術(shù)方案
所述用于診斷非綜合征耳聾的試劑盒，包含上述的用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，以及含有上述用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物的PCR反應(yīng)液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是本發(fā)明是基于PCR-膜條雜交技術(shù)的基因檢測(cè)方法，由于固定在基底上的突變檢測(cè)探針的大致中間位置包含有非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，通過PCR加膜條雜交技術(shù)能直接對(duì)待檢者的基因型進(jìn)行確診，對(duì)正常、突變雜合子、突變純合子等很容易判斷，具有高通量、高效率、價(jià)格低廉、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例的未檢出非綜合征耳聾基因突變樣品結(jié)果示例，其基因型為N/N ；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例的非綜合征耳聾基因突變雜合子樣品結(jié)果示例，其基因型為 35M/N ；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例的非綜合征耳聾基因突變純合子樣品結(jié)果示例，其基因型為 35M/35M ；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例的非綜合征耳聾基因雙重突變雜合子樣品結(jié)果示例，其基因型為;35M/235M。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)照附圖和結(jié)合優(yōu)選具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。1、雜交膜條的制備
1. 1、9條突變檢測(cè)探針和9條正常對(duì)照探針的制備
按照表1和表2中的序列合成18條探針，突變檢測(cè)探針和/或正常對(duì)照探針的3’或 5’端帶氨基標(biāo)記，合成的方法為現(xiàn)有的常規(guī)的DNA合成法。表1
權(quán)利要求
1.一種用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，其特征在于包括基底，以及固定在所述基底上的突變檢測(cè)探針，每一條所述突變檢測(cè)探針分別對(duì)應(yīng)包含一個(gè)非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，所述非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)為以下位點(diǎn)中的至少一個(gè)GJB2基因的 cDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA299-300 位點(diǎn)，GJB3 基因的 cDNA538 位點(diǎn)，mtDNA 12s rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位點(diǎn)，SL(^6A4 基因的 cDNA2168、IVS7-2 位點(diǎn)；每一條所述突變檢測(cè)探針包含15-25個(gè)堿基的序列，在所述序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的非綜合征耳聾基因的突變堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交膜條，其特征在于所述突變檢測(cè)探針為SEQID NO. Γ SEQ ID NO. 9中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雜交膜條，其特征在于所述基底上還固定有正常對(duì)照探針，其與所述突變檢測(cè)探針固定在所述基底的不同位置上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雜交膜條，其特征在于所述正常對(duì)照探針為SEQID NO. 1(Γ SEQ ID NO. 18中的至少一個(gè)序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交膜條，其特征在于每一個(gè)所述正常對(duì)照探針都對(duì)應(yīng)包含一個(gè)所述非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，其中，SEQ ID NO. 10對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為 cDNA35, SEQ ID NO. 11對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA176_191，SEQ ID NO. 12對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA235，SEQ ID NO. 13對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA^9_300位點(diǎn)，SEQ ID NO. 14 對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA538，SEQ ID NO. 15對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA1494，SEQ ID NO. 16對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA1555，SEQ ID NO. 17對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為cDNA2168， SEQ ID NO. 18對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為IVS7-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交膜條，其特征在于所述突變檢測(cè)探針和/或正常對(duì)照探針的3’或5’端帶有氨基標(biāo)記。
7.一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，其特征在于所述PCR引物擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的基因突變位點(diǎn)，所述PCR引物為以下5對(duì)中的至少一對(duì)SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20 ； SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 ； SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 ； SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26 ；SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28 ；其中 SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27是上游引物；SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28 是下游引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的PCR引物，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物分別包括如下位點(diǎn) 引物 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20 擴(kuò)增 GJB2 基因的 cDNA35、cDNA176_191、cDNA235、 cDNA299-300 位點(diǎn)，引物 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 擴(kuò)增 GJB3 基因的 cDNA538 位點(diǎn)， 引物 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24 擴(kuò)增 mtDNA 12S rRNA 基因的 cDNA1555、cDNA1494 位點(diǎn)，引物 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26 擴(kuò)增 SLC26A4 基因的 cDNA2168 位點(diǎn)，引物 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28 擴(kuò)增 SLC26A4 基因的 IVS7-2 位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的PCR引物，其特征在于所述上游引物和/或下游引物的5’端帶有生物素或熒光標(biāo)記。
10.一種用于診斷非綜合征耳聾的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，以及含有權(quán)利要求7所述的用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的 PCR引物的PCR反應(yīng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于診斷非綜合征耳聾的雜交膜條，包括基底，以及固定在基底上的突變檢測(cè)探針，每一條突變檢測(cè)探針分別對(duì)應(yīng)包含一個(gè)非綜合征耳聾的基因突變位點(diǎn)，基因突變位點(diǎn)為以下的至少一個(gè)GJB2基因的cDNA35、cDNA176-191、cDNA235、cDNA299-300位點(diǎn)，GJB3基因的cDNA538位點(diǎn)，mtDNA12srRNA基因的cDNA1555、cDNA1494位點(diǎn)，SLC26A4基因的cDNA2168、IVS7-2位點(diǎn)；每一條突變檢測(cè)探針包含15-25個(gè)堿基的序列，在序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的非綜合征耳聾基因的突變堿基。本發(fā)明具有準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102220434SQ20111014046
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者危梅娟 申請(qǐng)人:危梅娟