專利名稱：一種魚類生長激素基因工程酵母菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類生長激素基因工程酵母菌及其構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，水產(chǎn)必需的蛋白飼料越來越缺乏。1980年全世界的水產(chǎn)業(yè)所需蛋白質(zhì)為2. 3億噸，1990年這個數(shù)字超過3. 2億噸，2000年這個數(shù)字已超過6億噸， 而到2006年這個數(shù)字達(dá)到13億噸左右。其中水產(chǎn)飼料的主要蛋白源是大米蛋白、棉粕、菜粕、酒糟等，因此，開發(fā)新型的蛋白飼料源，提高飼料利用率和降低飼料生產(chǎn)成本成為目前飼料資源研究焦點。酵母單細(xì)胞蛋白作為飼料具有明顯的優(yōu)勢，如酵母干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量高達(dá) 50% ；酵母菌中含有豐富的酶類；含有β-葡聚糖(57.0% )、甘露寡糖(6.6% )、糖蛋白 (22.0% )和幾丁質(zhì)等活性成分；既對水產(chǎn)動物具有促生長的作用，又可提高機體免疫，對水產(chǎn)動物而言，酵母飼料是一種理想的生物活性蛋白質(zhì)飼料。又因酵母生產(chǎn)速度快，周期短，易于遺傳操作等特點，它是外源基因的理想表達(dá)受體系統(tǒng)。生長激素(Growth hormone,GH)是包括魚類在內(nèi)的所有脊椎動物腦下垂體分泌的一種單鏈多肽激素，由于其具有促進(jìn)機體生長發(fā)育，加速蛋白合成以及脂類降解的生理功能(Donaldson et al.，1979)[1]，使得它在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有重大的作用，因而得到越來越廣泛的重視。人類已利用基因工程技術(shù)合成了哺乳類和魚類的重組GH(rGH)，并證明 GH能被魚類消化道完整吸收而進(jìn)入血液并保持促進(jìn)魚類生長的活性(Hertz Y，1991)[2]。肖東等，文(肖東，2000) ω研究表明外源生長激素在魚體內(nèi)M小時便會分解90%，4天內(nèi)全部消失，不會在魚體中累積。孫遜等(孫遜，1999)[4]，證實魚生長激素對哺乳動物的生長激素受體無任何活性。以上研究結(jié)果消除了人們對外源生長激素的殘留和安全等疑慮。但天然的豬、牛、羊、雞、魚的生長激素或利用基因工程菌產(chǎn)生人的生長激素對魚生長激素受體的結(jié)合活力要比魚本身生長激素低150倍。這一結(jié)果提示，將魚類生長激素基因重組轉(zhuǎn)入益生素酵母中可以作為飼料廣泛應(yīng)用于淡水魚類養(yǎng)殖中，這對開發(fā)新型蛋白質(zhì)魚飼料具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將重組青魚生長激素基因定向地整合到畢赤酵母中并使之高效表達(dá)的方法及其得到的基因工程酵母菌。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的。一種魚類生長激素基因工程酵母菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中登記的青魚GH基因序列(AF389238)設(shè)計引物。上游引物Pl :5，-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，；下游引物Ρ2 :5，-CTA CAG GGT GCA GTT GGA ΑΤ-3，。CN 102250913 A
說明書
2/13 頁(2)按照hvitrogen公司的Trizol試劑盒說明書提取青魚腦垂體總RNA，根據(jù) invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成青魚cDNA第一鏈RNA模板5 μ L(1 μ g/μ L)、 IyL oligo(dT)18 引物(0. 5 μ g/ μ L), DEPC 處理的 ddH20 補足 12 μ L，65 °C 水浴 5min ； 300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5XReaction Buffer 4μ L、40U/y L 尺妝86抑制劑1“1^、101111/^1^ dNTP Mix 2 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L (IU/μ L)，300rpm離心 30S，立即放在42°C水浴60min，70°C終止反應(yīng)5min。青魚生長激素基因cDNA片段克隆，反應(yīng)體系如下上述獲得的cDNA 2yL(lyg/ μ L)，10XPCR Buffer 2. 5μ L,25mmol MgCl2 L 5 μ L，IOmM/ μ L 引物 P1，P2 各 1 μ L, IOmM/ μ L dNTPl μ L, 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 1 μ L, ddH20 補足為 20 μ L ；PCR 反應(yīng)流程為94°C 預(yù)變性 3min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 40C IOmin ；經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見圖1，與預(yù)期結(jié)果一致。(3)根據(jù)步驟(2)得到的青魚生長激素cDNA序列及表達(dá)載體pPIC 3.漲多克隆位點，設(shè)計一對含EcoR I和Not I的酶切位點的特異性引物，擴(kuò)增帶酶切位點的青魚生長激素基因，以便構(gòu)建表達(dá)載體PPIC3.漲-bcGH。引物序列如下pPIC3. 5K-GHF 5’ GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’，pPIC3. 5K-GHR 5’ TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’。其中，下劃線標(biāo)記的序列分別是EcoR I和Not I的酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。以步驟(2)合成的cDNA為模板，用引物pPIC3. 5K-GHF, pPIC3.阢-GHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系東盛生物科技公司提供的2XlmL規(guī)格的2XPCR TaqMix 12. 5 μ L, IOmM/μ L 引物 pPIC3. 5K-GHF 和 pPIC3. 5K-GHR 各 1 μ L，(1 μ g/ μ L) cDNA 2 μ L,添加 ddH20 至 25 μ L ；PCR 擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性 3min，94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 4°C IOmin ；(4)將步驟(3)得到的PCR產(chǎn)物回收純化后，用EcoR I和Not I雙酶切PCR產(chǎn)物， 經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3. 5K載體片段連接， 轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci (購自寶生物工程(大連)有限公司)，篩選陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒 pPIC3. 5K-bcGH ；(5)將重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-bcGH電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GSl 15菌株(購自寶生物工程(大連)有限公司)，獲得基因工程酵母菌。本發(fā)明利用甲基營養(yǎng)型畢氏酵母Pichia I^astoris這一理想的真核蛋白高水平表達(dá)系統(tǒng)，將青魚魚生長激素基因定向克隆到酵母整合型質(zhì)粒載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達(dá)， 獲得了高效表達(dá)的重組魚生長激素基因工程酵母菌。通過以大米蛋白為發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行生物發(fā)酵，制備菌肽活性蛋白飼料，而后將飼料直接飼養(yǎng)魚類或者與魚類飼料混合飼用。在降低飼料生產(chǎn)成本的同時，實現(xiàn)促生長和提高抗病的作用，從而增加魚類養(yǎng)殖效益。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；Lane M :DNA marker Lane 1-3 =RT-PCR 結(jié)果圖 2 為 pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I/Not I 酶切電泳1-6 :pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I 和 Not I 酶切 M :DNA marker圖3為重組酵母菌落PCR圖；1-4 重組酵母 PCR 結(jié)果 M :DNA marker圖4為pPIC 3. 5k_bcGH重組酵母菌的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE(12% )；1陰性對照，M :Marker，2-7誘導(dǎo)24小時取樣培養(yǎng)基PH分別為4. 5,5. 5,6. 0,6. 5， 7. 0圖5為pPIC 3. 5k-bcGH重組酵母菌的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE(12% )；1-6和7-12分別是誘導(dǎo)48小時和72小時取樣培養(yǎng)基PH分別為4. 5,5. 5,6. 0， 6. 5,7. 0 M :Marker圖6為純化bcGH的SDS-PAGE結(jié)果；1 7 純化的bcGH，M 蛋白marker，8 未純化蛋白圖7為蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8為發(fā)酵時間對重組bcGH酵母表達(dá)量影響；1、未誘導(dǎo)；2、蛋白質(zhì)Marker ；3 7、誘導(dǎo)時間分別為:96h、72h、48h、24h、12h圖9為發(fā)酵溫度對重組bcGH酵母表達(dá)量影響；1、蛋白質(zhì)Marker ；2 6、發(fā)酵溫度分別為32°C、30°C、28°C、26°C、24°C;7、未誘導(dǎo)圖10為種子液接種量對重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、未誘導(dǎo)；2 6、接種量分別為2%,3%,4%,5%,6% ；7、蛋白質(zhì)Marker圖11為大米蛋白濃度對重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、蛋白質(zhì)Marker ;2 6、大米蛋白濃度分別為7%、6%、5%、4%、3% ；7、未誘導(dǎo)圖12為甲醇濃度對重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、蛋白質(zhì) Marker ；2 6、甲醇濃度分別為2. 5%,2%U. 5%U%>0. 5% ；7、未誘
導(dǎo)圖13為pH值對重組bcGH酵母誘導(dǎo)表達(dá)影響；1、蛋白質(zhì) Marker ；2 6、pH 值分別為8. 0,7. 5,7. 0,6. 5,6. 0 ；7、未誘導(dǎo)
具體實施例方式以下結(jié)合實施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例11、生長激素基因工程酵母菌的構(gòu)建根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中登記的青魚GH基因序列(AF389238)設(shè)計引物。上游引物 Pl :5，-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，。下游引物 P2 :5，-CTA CAG GGT GCA GTT GGAAT-3，。參照invitrogen公司的Trizol試劑盒說明書，提取青魚腦垂體總RNA。根據(jù) invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成青魚cDNA第一鏈RNA模板5 μ L(1 μ g/μ L)、 IyL oligo(dT)18 引物(0. 5 μ g/ μ L), DEPC 處理的 ddH20 補足 12 μ L，65 °C 水浴 5min ； 300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5XReaction Buffer 4μ L、40U/y L RNase 抑制劑 1 μ LUOmM/μ L dNTP Mix 2 μ L、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L(1U/μ L)，300rpm 離心 30S， 立即放在42°C水浴60min，7(TC終止反應(yīng)5min。再準(zhǔn)備青魚生長激素基因cDNA片段克隆，反應(yīng)體系如下上一步獲得的 cDNA 2 μ L(1 μ g/μ L), 10XPCR Buffer 2. 5μ L,25mmol MgCl2 1.5口1^，101111/^1^引物？1，？2各1口1^，101111/^1^ dNTP 1 μ L，5U/μ L 的 Taq DNA 聚合酶1 μ L，ddH20補足為20 μ L ；PCR反應(yīng)流程為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸Imin, 30個循環(huán)，72°C延伸IOmin, 4°C IOmin ；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，
與預(yù)期結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，與pEASY-Tl cloning vector (購自寶生物工程(大連)有限公司)連接。反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物1μ 1，pEASY-Tl cloning vector 1 μ 1，室溫反應(yīng)5min，再置于冰上終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑取白色克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR驗證，將驗證過的陽性克隆質(zhì)粒送交上海生工測序分析。測序所得結(jié)果與 GeneBank上傳的基因序列一致(馮浩，2002)[5]說明成功地克隆出了青魚生長激素基因。根據(jù)前面得到的青魚生長激素cDNA序列和表達(dá)載體pPIC 3. 5K(購自寶生物工程 (大連)有限公司)多克隆位點，運用Seqencer軟件設(shè)計一對特異引物pPIC3. 5K-GHF :5， -GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’，pPIC3. 5K-GHR :5’ -TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATG ATGATGCAGGGTGCAGTTGGA AT-3’。以合成的 cDNA 為模板，用引物 pPIC3. 5K-GHF, pPIC3. 5K-GHR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 體系東盛生物科技公司提供的2XlmL規(guī)格的2XPCR TaqMix 12. 5 μ L，IOmM/μ L引物 pPIC3. 5K-GHF 和 pPIC3. 5K-GHR 各 1 μ L，(1 μ g/ μ L) cDNA 2 μ L，添加 ddH20 至 25 μ L ；PCR 擴(kuò)增程序941預(yù)變性；31^11，941變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 Imin, 30 個循環(huán)，72°C 延伸10min，4°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，用EcoR I和Not I雙酶切PCR 產(chǎn)物，經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3. 5K載體片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，菌落PCR，EcoR I和Not I雙酶切鑒定， 鑒定為陽性的克隆進(jìn)一步測序分析。將獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為PPIC3.漲-bcGH，結(jié)果見圖 2 (Lane 1-6 :pPIC3. 5K_bcGH 的 EcoR I 和 Not I 酶切 Lane M :DNA marker)酵母感受態(tài)的制備參考文獻(xiàn)(Frederick MA，1995) 。于液氮中取出Gsll5酵母感受態(tài)，將其立即置于冰上至剛?cè)?，加線性化的PPIC3. 5K-bcGH重組載體(5 10 μ g)與 (isll5酵母(購自寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. Icm電轉(zhuǎn)杯中；在冰上放置5min ；按電壓600V，電阻400 Ω，電容25 μ F的條件進(jìn)行電擊；立即加入ImL 預(yù)冷的IM山梨醇至杯中，立即涂于MD平板上QOO μ L每平板)；30°C倒置培養(yǎng)3 4d，至克隆(His+轉(zhuǎn)化子)產(chǎn)生。把MD平板上的pPIC3. 5K-bcGH畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行YPD平板 (G418的濃度分別為1. 0,2. 0和3. 0mg/ml)梯度篩選多拷貝，30°C培養(yǎng)3 4d。把生長良好的高抗性轉(zhuǎn)化子O. 0mg/ml以上)通過PCR法篩選陽性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果見圖3 (Lane 1 4 重組酵母 PCR 結(jié)果 Lane M :DNA marker)挑取陽性酵母單菌落，接種至BMGY培養(yǎng)基中，30°C，300r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)到 2 6，離心收菌，并重懸于BMMY培養(yǎng)基(pH為6. 0)，30°C，300r/min,培養(yǎng)4天，每24h補加終濃度為(ν/ν)的甲醇誘導(dǎo)。收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果見圖4(Lane 1陰性對照，LaneM :Marker，Lane 2 7誘導(dǎo)M小時取樣，培養(yǎng)基pH分別為4. 5，5. 5，6. 0，6. 5， 7. 0.)和圖 5 (Lanel 6 誘導(dǎo) 48 小時取樣，Lane M =Marker)。誘導(dǎo)后，離心收集菌體，根據(jù)QIAGEN的操作手冊裂解和消化菌體，用Ni Sepharose High Performance純化蛋白。洗脫的樣品裝入截留分子量為3kD的透析袋后，放入IL0. 9% NaCl溶液中，4°C透析。透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)定量。以鼠抗青魚生長激素為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗，顯色底物為3’ 3’ 5’ 5’ -四甲基聯(lián)苯胺[TMB]。 分別用免疫前的小鼠血清和PBST作陰性對照和空白對照。重組酵母工程菌(isll5在pH6. 5 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)7 后，菌液經(jīng)液氮、玻璃珠的裂解，Ni-NTA Magnetic Agarose Bead 吸附帶6x組氨酸標(biāo)簽的重組青魚生長激素多肽。經(jīng)過親和吸附后，只留下經(jīng)誘導(dǎo)的菌株表達(dá)的青魚生長激素的融合蛋白，詳細(xì)見圖6。純化產(chǎn)物分別稀釋2000倍、4000倍、8000倍、 16000倍、32000倍、64000倍，一抗分別稀釋1000倍、2000倍、4000倍、8000倍，同時做陰性對照和空白對照，ELISA檢測蛋白免疫原性。結(jié)果見表1。表1 :bcGH 的 Elisa 分析
權(quán)利要求
1.一種魚類生長激素基因工程酵母菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中登記的青魚GH基因序列AF389238設(shè)計引物， 上游引物 Pl :5，-ATG GCT AGA GCA TTA GTG CT-3，；下游引物 P2 :5，-CTA CAG GGT GCA GTT GGA AT-3，；(2)提取青魚腦垂體總RNA，按RT-PCR進(jìn)行cDNA合成cDNA第一鏈合成1μ g/ μ L的 RNA 模板 5 μ L、0. 5 μ g/ μ L oligo (dT) 18 弓丨物 1 μ L、DEPC 處理的 ddH20 補足 12 μ L, 65°C水浴 5min ；300rpm 離心 30S，立即放在冰上 lmin，再依次加入 5 X Reaction Buffer4 μ L、40U/ μ L RNase 抑制劑 1 μ L、10mM dNTP Mix 2 μ L、IU/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L，300rpm 離心 30S，立即放在42°C水浴60min，70°C終止反應(yīng)5min ；再準(zhǔn)備 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下lyg/yL cDNA IyL, 10XPCR Buffer 2. 5 μ L, 25mmolMgCl2 1· 5 μ L，IOmM/μ L 弓 |物 P1，P2 各 1 μ L，IOmmol dNTP 1 μ L，5u/μ L 的 Taq DNA 聚合酶1 μ L，ddH20補足為20 μ L ；PCR反應(yīng)流程為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C 退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C延伸IOmin, 4°C IOmin ； (3)根據(jù)步驟(2)得到的青魚生長激素cDNA序列和表達(dá)載體pPIC33K的多克隆位點，設(shè)計一對含EcoR I和Not I 的酶切位點的特異引物，pPIC3. 5K-GHF :5’ -GTCGAATTCACCATGGCTAGAGCATTAGTG-3’， pPIC3. 5K-GHR :5’ -TATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGTGCAGTTGGAAT-3’ ； PCR 體系:2XPCR TaqMix 12. 5 μ L，IOmM/μ LpPIC3. 5K-GHF 和 pPIC3. 5K-GHR 各 1 μ L， 1 μ g/ μ L 的 cDNA 2 μ L,添力口 ddH20 M 25 μ L ；PCR擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 4°C IOmin ；(4)將步驟(3)得到的PCR產(chǎn)物回收純化后，用EcoRI和Not I雙酶切PCR產(chǎn)物，經(jīng)酚氯仿抽提后，與同樣進(jìn)行雙酶切并且經(jīng)堿性磷酸酶處理的PPIC3. 5K載體片段連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-bcGH ；(5)將重組質(zhì)粒pPIC3.5K-bcGH電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GS115菌株，獲得基因工程酵母菌。
2.一種魚類生長激素基因工程酵母菌，其特征在于，是由權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建而成的基因工程酵母菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類生長激素基因工程酵母菌及其構(gòu)建方法。通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出青魚生長激素成熟肽cDNA編碼區(qū)，將青魚生長激素cDNA定向插入含強啟動子AOXI的表達(dá)載體pPIC3.5k，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC3.5K-bcGH。電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入組氨酸缺陷型酵母GS115菌株，獲得基因工程菌。該菌株可以通過以大米蛋白為發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行生物發(fā)酵，制備菌肽活性蛋白飼料，而后直接使用或者將其與常用魚類飼料混合使用，在降低飼料生產(chǎn)成本的同時，實現(xiàn)促生長和提高抗病的作用，從而增加魚類養(yǎng)殖效益。
文檔編號C12N1/19GK102250913SQ201110143399
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者劉臻, 張建社, 謝帝芝, 魯雙慶 申請人:長沙學(xué)院