專利名稱：鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚膒cr引物對、試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥材鑒別領域，具體涉及鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對、試劑盒及方法。
背景技術：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis (Berkeley) Saccardo為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬(Hepialus)幼蟲上形成的蟲生子囊真菌，為麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草的子座及其寄主鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲蝙蝠蛾的幼蟲尸體的復合物，主要分布青藏高原，菌性屬于低溫型，生長在海拔3，800m的雪線以上，性甘平，補肺益腎，止血化痰，用于久咳虛喘，勞咳咯血，陽痿遺精，腰膝酸痛，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。由于冬蟲夏草具有特殊的藥理作用和治療功效，市場上出現(xiàn)了許多與冬蟲夏草形態(tài)相似的偽品，其中亞香棒蟲草(Cordyc印s hawkesii Gray)是最為常見的偽品。亞香棒蟲草又稱霍克斯蟲草，其寄主為鱗翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾屬(Napialus)幼蟲，分布于湖南、江西、湖北、安徽、浙江、福建、廣東等省山區(qū)及丘陵低海拔區(qū)域。亞香棒蟲草與冬蟲夏草在形態(tài)上相似，常被不法商販冒充冬蟲夏草出售。此外，北蟲草Cordyc印s militaris (Li) Link, 又稱蛹蟲草也是最為常見的偽品之一。北冬蟲夏草，為同屬真菌蛹蟲草寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體上的復合物，菌性屬中溫型，生長在低海拔的平原地域，主要分布在東北、華北、西北等省區(qū)，民間用于肺炎、腎虛、腰痛等疾病的治療。冬蟲夏草由于生長地理的特殊要求，以及嚴格的寄生性，造成其資源極其稀少，兼之采收的不易更使得野生冬蟲夏草顯得十分珍貴，價格昂貴。而偽蟲草在名稱、外形上與之相似，因而常作為冬蟲夏草的混淆品出現(xiàn)在藥材市場。因而在本領域需要有一種特異性的檢測鑒別冬蟲夏草的可靠方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種特異性的檢測鑒別冬蟲夏草的可靠方法。本發(fā)明為了解決上述技術問題所技術方案是提供一種鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對。該鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR(聚合酶鏈式反應)引物對的序列為上游引物(SEQID No. 1) :5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，；下游引物(SEQID No. 2) :5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。本發(fā)明還提供一種鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR試劑盒。該PCR試劑盒包括從提取的樣品DNA中PCR擴增待測樣品DNA片段的引物對，包括上述的引物對。當然，該PCR試劑盒還可包括一般的PCR擴增所需的各種標準試劑。優(yōu)選采用超保真試劑。本發(fā)明另外還提供了一種鑒別冬蟲夏草的方法。該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA;b、采用上述的引物對在PCR儀上進行PCR擴增；C、對擴增產物進行測序，并與SEQ ID No. 3所示的序列比對，其中的與SEQ IDNo. 6對應部分100%符 合者為真品，否則為偽品。100%符合者為真品，否則為偽品。其中，上述方法步驟b所述的PCR擴增的條件為
預變性98 °C, Imin 變性98 °C, IOsec 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec .
延伸72 °C, 5min其中，上述方法步驟b所述的PCR擴增的體系為PCR 擴增反應體積為 50 μ 1，其中 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. Ομ 1,7. 4μ 1 的 5MBetaine，上、下游引物(10ym/L)各 1· 0μ 1，DNA 模板 2· 0μ 1。為確保PCR擴增時序列的正確性，PCR試劑優(yōu)選采用超保真試劑2XPhusi0n Master Mix (產品編號F-532L，購自NEB公司)，5M Betaine (產品編號B 0300)購自 sigma公司ο本發(fā)明經過充分的前期試驗篩選和優(yōu)化，得到有效的PCR引物對。實驗表明，本發(fā)明引物對能夠有效地擴增冬蟲夏草及其常見贗品的目標片段，并且能夠準確地鑒別，使用該引物對進行鑒別的方法是特異性的檢測鑒別冬蟲夏草的可靠方法，具有很好的應用前
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圖1、本發(fā)明的引物設計示意圖，其中有下劃線的斜體部分為所設計的引物特異性結合的位置。只有下劃線的部分為主要用于比對的579個堿基的區(qū)域為可信區(qū)間。圖2、使用本發(fā)明引物對擴增的玉樹冬蟲夏草18S片段序列與亞香棒蟲草、北蟲草 18S序列片段比較結果，2-A和2-B的結果是連續(xù)的。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
對本發(fā)明進行具體說明。實施例一檢測PCR引物的設計與合成及對樣品進行檢驗1、設計PCR擴增引物根據(jù)GenBank上公開登錄的冬蟲夏草18s核糖體基因序列信息進行引物的設計 (設計引物的部分參見圖1)。序列信息為GenBank :HM135169(共 1741bp)，(Cordyceps sinensis, 18S ribosomal RNA, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/HM135169)。在446-466 設計上游引物，命名為CC18s_F。序列為5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，(SEQ ID No. 1)；在1179-1198 設計下游引物，命名為CC18s_R。序列為5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT3，(SEQ ID No. 2)。擴增的目標序列為SEQ ID No. 3所示(446-1198)。優(yōu)選中間的共計579個堿基的區(qū)域為可信區(qū)間(參見圖1中下劃線部分)2、提取蟲草DNA冬蟲夏草為本公司購自 青海玉樹；亞香棒蟲草購自浙江；北蟲草購自遼寧；由中科院西北高原生物研究所中藥鑒定室鑒定。提取蟲草DNA所用試劑為“柱式真菌DNAout基因提取試劑盒”(產品編號 70901-50)購自北京天恩澤基因科技有限公司，按照說明書進行提??；準確稱取干燥樣品lOOmg，液氮研磨成粉后轉移到1. 5mL離心管中，加入ImL溶液 A充分混勻，65°C保溫30分鐘；12，OOOrpm離心3分鐘；轉移上清到新離心管中，加入等體積的溶液B，混勻，冰浴5分鐘；室溫12，OOOrpm離心3分鐘，轉移上清到新的離心管中；力口入0. 2mL氯仿，振蕩30秒混勻；室溫12，OOOrpm離心3分鐘，轉移上清到新離心管中；加入 1. 5倍體積的溶液C，混勻，將混合液轉移到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘；12，OOOrpm離心1分鐘；加入0. 7mL洗柱液，室溫離心1分鐘；加入0. 3mL洗柱液重復一次；空甩1分鐘去除殘留液體；將離心柱放置在一新的1. 5mL離心管中，加入30uL通用洗脫液。室溫放置 5分鐘后離心1分鐘，即獲得DNA溶液，-20°C保存。3、PCR擴增目標序列為確保擴增的正確性，PCR試劑采用超保真試劑2XPhusi0n Master Mix (產品編號F-532L，試劑購自 NEB 公司)，5M Betaine (B 0300)購自 sigma 公司。PCR反應體系如下表1 PCR反應體系
組分.體積(μ )"ddH^O^
2χ Phusion MMix25.0
5M Betaine7.4
SEQ ID No. 1 (ΙΟμηι/L)1.0
SEQ ID No. 2 (ΙΟμηι/L)1.0
_DNA2.0
Total Volume (總體積)50PCR反應條件如下
預變性98 °C,Imin 變性98 °C，IOsec ^ 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec -
延伸72 °C,5min
PCR反應結束后，取各PCR反應產物3 μ 1加1 μ 1加樣緩沖液(6XLoading Buffer)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電壓100V，電泳時間30-40min。紫外光下觀察電泳結果，可使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。擴增產物電泳后凝膠回收試劑盒回收純化，進行測序(英駿生物有限公司)。測序結果，玉樹冬蟲夏草(SEQ ID No. 4)，亞香棒蟲草(SEQ ID No. 5)，北蟲草(SEQ ID No. 6)
4、測序結果分析 待擴增的冬蟲夏草標準目標序列長度為753個堿基。測序時，以上游引物和下游引物作為測序反應的引物進行測序，由于進行的是PCR產物直接測序，最初的50-70個堿基可能出現(xiàn)的錯讀現(xiàn)象。因此，需要剔除首、尾各70個堿基序列，然后進行對比。我們選擇中間的共計579個堿基的區(qū)域為可信區(qū)間(圖1中下劃線部分)，進行比較。應用DNAMAN序列比對軟件，將玉樹冬蟲夏草、亞香棒蟲草、北蟲草的測序結果與 GenBank登錄的冬蟲夏草(HM135169)的18S序列進行比對，結果顯示，玉樹冬蟲夏草與冬蟲夏草相應序列的相似度均為100% ；亞香棒蟲草與冬蟲夏草18S序列的相似度為91. 39%, 北蟲草的相似度為91. 74%。具體比對結果參照圖2。本發(fā)明PCR擴增引物對可以有效地鑒別冬蟲夏草及其混淆品北蟲草和亞香棒蟲草。可以以適量的PCR擴增引物對，添加進行PCR的必要試劑，制備成PCR試劑盒，用于快速的冬蟲夏草PCR擴增鑒別。
權利要求
1.鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對，其特征在于所述引物對的序列為 上游引物5’ CAATAAATACCGATACAGGGC 3’ ；下游引物5’ TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。
2.鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，其特征在于包括權利要求1所述的引物對。
3.鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA；b、采用權利要求1所述的引物對在PCR儀上進行PCR擴增；C、對擴增產物進行測序，并與SEQ ID No. 3所示的序列比對，其中的與SEQ ID No. 6對應部分100%符合者為真品，否則為偽品。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于 步驟b所述的PCR擴增的條件為預變性98 °C, Imin變性98 °C, IOsec退火60°C，20sec 30 cycles延伸72°C，30sec .延伸72 °C，5min 。
5.根據(jù)權利要求3或所述的方法，其特征在于； 步驟b所述的PCR擴增的體系為每 50μ IPCR 擴增反應體積中包含 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. 0 μ 1, 7. 4 μ 1 的 5MBetaine, 10 μ m/L 的上、下游引物各 1. 0 μ 1，DNA 模板 2. 0 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥材鑒別領域，具體涉及冬蟲夏草真?zhèn)蔚蔫b別。本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種特異性的檢測鑒別冬蟲夏草的可靠方法。本發(fā)明為了解決上述技術問題所技術方案是提供一種鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對、試劑盒及方法。引物對的序列為上游引物5’CAATAAATACCGATACAGGGC 3’；下游引物5’TGTC TGGACCTGGTGAGTTT 3’。本發(fā)明引物對能夠有效地擴增冬蟲夏草及其常見贗品的目標片段，并且能夠準確地鑒別，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102226217SQ201110147608
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權日2011年6月2日
發(fā)明者張雪峰, 徐麗 申請人:張雪峰