專(zhuān)利名稱(chēng)：特異于胰腺胰島β細(xì)胞的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
特異于胰腺胰島β細(xì)胞的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用本申請(qǐng)為申請(qǐng)日為2003年11月18日、申請(qǐng)?zhí)枮?00380108886. 1、發(fā)明名稱(chēng)為“特
異于胰腺胰島β細(xì)胞的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及一種特異表達(dá)于胰腺胰島β細(xì)胞的被稱(chēng)為&1Τ-8的蛋白質(zhì)，涉及編碼上述的與胰島素成熟及外排相關(guān)的蛋白質(zhì)的多核苷酸，并涉及它的應(yīng)用，特別是在分選及研究β細(xì)胞和篩選治療糖尿病和高胰島素血癥的藥物上的應(yīng)用。糖尿病是最常見(jiàn)的疾病之一，它影響了工業(yè)化國(guó)家的5%人口并且其發(fā)生率在全球所有國(guó)家都在持續(xù)增加(預(yù)計(jì)，到2025年將有3億糖尿病患者，包括法國(guó)的240萬(wàn)患者)。 在各種形式的糖尿病中，I型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病影響著將近500，000到一百萬(wàn)美國(guó)人和150，000法國(guó)人，及0. 2到0. 4%人口。特征性的癥狀包括高水平的血糖和尿糖、 嚴(yán)重的利尿、強(qiáng)烈的饑餓感和乏渴感、以及體重減輕。非胰島素依賴性II型糖尿病(NIDD)也被稱(chēng)作為“肥胖性”糖尿病或晚期起病糖尿病，常發(fā)生于約50歲左右人群。通過(guò)飲食、服用口服藥物的方式治療，在疾病進(jìn)展多年后用胰島素治療。目前，有兩百萬(wàn)法國(guó)人正在接受抗糖尿病藥物和/或胰島素的治療。盡管通用胰島素注射及控制糖的攝入可以控制糖尿病，但是目前與該疾病相關(guān)的并發(fā)癥需要新的預(yù)防、治療和診斷糖尿病的方法。胰腺包括兩種在形態(tài)和生理上都有所不同的結(jié)構(gòu)-外分泌胰腺，它產(chǎn)生參與消化的酶(淀粉酶、脂肪酶等)以及碳酸氫鈉。-內(nèi)分泌胰腺，它產(chǎn)生參與控制血糖的激素(胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽)。內(nèi)分泌胰腺的細(xì)胞被組合成為以小島形式(朗格漢氏島或胰島)分散于胰腺中的微器官。每個(gè)胰島由4種細(xì)胞類(lèi)型所組成α細(xì)胞、β細(xì)胞、δ細(xì)胞和PP細(xì)胞。α細(xì)胞位于島的周邊并分泌胰高血糖素。β細(xì)胞位于島的中央且是唯一能應(yīng)答于葡萄糖并分泌胰島素的細(xì)胞。δ細(xì)胞位于島的周邊并分泌生長(zhǎng)抑素。PP細(xì)胞的功能還有爭(zhēng)議(合成胰多肽)。研究β細(xì)胞的細(xì)胞模型的缺乏以及適用于該細(xì)胞類(lèi)型的可靠和有效的細(xì)胞分選方法的缺乏都妨礙了對(duì)其功能的研究，并因此妨礙了治療I型和II型糖尿病的新方法的發(fā)展。在對(duì)糖尿病的治療中，除規(guī)律給予胰島素外，用于生理地控制高血糖并將糖尿病患者的高血糖正?；姆椒ㄖ皇腔謴?fù)細(xì)胞的體內(nèi)胰島素分泌。在這個(gè)方面，已經(jīng)提出了一些方法一獲得動(dòng)物的產(chǎn)胰島素細(xì)胞進(jìn)行異種移植；一體外將分離到的干細(xì)胞分化為分泌胰島素的細(xì)胞，再移植，以克服免疫的問(wèn)題及避免患者免疫抑制治療的需要。但是，通過(guò)分化干細(xì)胞廉價(jià)地生產(chǎn)大量產(chǎn)胰島素細(xì)胞要求特別適用于分型并純化所分化的細(xì)胞的新的生物分子工具；一胰島移植；近期許多研究的主題都是制備用于治療目的的胰島或β細(xì)胞。移植的第一步是從已經(jīng)被宣布為腦死亡的供體中取出胰腺。胰島的分離從用膠原酶溶液酶消化
3胰腺開(kāi)始。不是所有的移植都要求純化所消化的胰島。但是，現(xiàn)在絕大多數(shù)研究者都認(rèn)為純化胰島對(duì)于同種異體移植是必需的[2]。然后，通過(guò)門(mén)靜脈內(nèi)注射移植入有效量(最小 3000IEQ/kg)的胰島(IEQ:胰島等效量)。但是，分離胰島或β細(xì)胞需要用于選擇及鑒定β細(xì)胞的特殊及可靠的方法。以往的研究已經(jīng)嘗試發(fā)展用于標(biāo)記β細(xì)胞的方法。所提出的方法包括一用GFP (綠色熒光蛋白質(zhì))標(biāo)記，它可熒光標(biāo)記細(xì)胞。這種技術(shù)的主要缺點(diǎn)是需要將外源基因或轉(zhuǎn)基因引入到細(xì)胞內(nèi)，更甚者是需使用病毒載體(腺病毒)[1]；一基于β細(xì)胞的大量的自體熒光的技術(shù)[2]。但是，這個(gè)技術(shù)缺乏對(duì)細(xì)胞類(lèi)型的特異性。一將細(xì)胞與鋅特異性熒光素(Newport Green [3]或雙硫腙[3])孵育。這個(gè)技術(shù)基于β細(xì)胞內(nèi)大量的鋅含量。鋅是胰島素分泌顆粒的一種主要成分，另外它在控制胰島素的分泌上發(fā)揮著作用[5]。但是，這些技術(shù)有著許多缺點(diǎn)使用化學(xué)品、對(duì)β細(xì)胞的毒性危險(xiǎn)、缺乏對(duì)細(xì)胞類(lèi)型的特異性。另外，雙硫腙有著快速光降解的問(wèn)題W]；一通過(guò)用T細(xì)胞克隆(W0 91/17186)對(duì)β細(xì)胞所表達(dá)的抗原的識(shí)別來(lái)間接驗(yàn)證。 對(duì)該抗原的最初研究沒(méi)有提供肽序列特征的結(jié)果，也沒(méi)有提供對(duì)β細(xì)胞以及胰島和胰腺或生物體的其他細(xì)胞類(lèi)型的選擇性的結(jié)果。相同作者的更新研究顯示該抗原有著更廣泛的分布，因此該抗原是非特異于β細(xì)胞的抗原[7]。因此，缺乏針對(duì)胰腺胰島β細(xì)胞的特異及可靠的標(biāo)記物。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種這樣的標(biāo)記物。胰島蓄積了大量的鋅，因此為了在分泌囊泡中蓄積鋅就需要非常有效及非常特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8]。應(yīng)答于外界刺激例如葡萄糖濃度的增高，通過(guò)細(xì)胞外排作用將胰β細(xì)胞所生成并儲(chǔ)存的胰島素釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中。葡萄糖的增高引起ATP/ADP比的改變、鉀通道的關(guān)閉和鈣通道的開(kāi)放，這就引起細(xì)胞外排胰島素[9]。已知在有鋅時(shí)，胰島素與鋅分別地按4 1和6 2的胰島素鋅比例結(jié)合形成四聚體和六聚體。胰島素以由與按每個(gè)六聚體與2個(gè)鋅原子結(jié)合的六聚體所構(gòu)成的固態(tài)形式被儲(chǔ)存于分泌囊泡中。囊泡含有比形成胰島素-鋅六聚體所必需量的1到1. 5倍過(guò)量的鋅。在外排胰島素期間，富含胰島素的囊泡與β細(xì)胞的細(xì)胞膜融合并將胰島素及鋅釋放到循環(huán)中。所釋放的鋅作用于鉀通道的負(fù)反饋環(huán)，造成鉀通道的活化及細(xì)胞外排的終止。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已經(jīng)克隆并描述了 7種具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的同源蛋白質(zhì)， 稱(chēng)作為aiT-1、-2、-3、-4、-5、-6和-7。對(duì)這些蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析使得確定出一個(gè)由 6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富含組氨酸的細(xì)胞內(nèi)環(huán)所構(gòu)成的共同結(jié)構(gòu)單位成為可能。ZnT-I是一種定位于細(xì)胞膜上的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它保證鋅流到細(xì)胞外[11]。ZnT-2容許細(xì)胞耐受培養(yǎng)基中的過(guò)量的鋅，從而通過(guò)將鋅定位于酸性的細(xì)胞漿內(nèi)囊泡中獲得對(duì)鋅的耐受性，因此保證鋅在細(xì)胞內(nèi)遠(yuǎn)高出正常水平的蓄積[12]。已經(jīng)克隆出人的SiT-3和SiT-4，它們具有與aiT-2相似的功能。ZnT-3特異于某些組織，被強(qiáng)烈地表達(dá)于腦部、富含鋅的突觸囊泡膜、海馬的苔狀纖維以及睪丸中。ΖηΤ-4被遍在地表達(dá)，但是高水平的表達(dá)見(jiàn)于腦部和上皮細(xì)胞中。這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在哺乳動(dòng)物的上皮中是重要的，它參與控制母乳中的鋅含量。ΖηΤ-5 和ΖηΤ-6也是定位于高爾基體的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ΖηΤ-7是一種特異地定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的遍在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
先前研究提出了一種搜索參與胰腺β細(xì)胞的鋅代謝的基因的方法。這些研究沒(méi)有證實(shí)一種特異的蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]。本發(fā)明者已經(jīng)分離出一個(gè)1110個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸(SEQ ID NO. 1)，它代表相應(yīng)于在胰島中特異表達(dá)的，以及更特異地是在分泌胰島素的細(xì)胞或β細(xì)胞中特異表達(dá)mRNA 的 cDNA。本發(fā)明的多核苷酸編碼被稱(chēng)為&iT-8(SEQ ID NO. 2)的蛋白質(zhì)，這是一種369個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，所估計(jì)的分子量為40. 8KDa，具有與ZnT家族蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)同源的一級(jí)結(jié)構(gòu)。編碼所述蛋白質(zhì)的基因被稱(chēng)為SiT-8。對(duì)完整的SiT-8蛋白質(zhì)的跨膜電位的研究顯示它具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(第74-95、 107-126,141-163,177-196,216-240和246-267位氨基酸)及定位于胞漿內(nèi)的N和C末端。這個(gè)研究也顯示該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有3個(gè)細(xì)胞外氨基酸環(huán)(第96-106、164-176和 241-245位氨基酸)。另外，ZnT-8蛋白質(zhì)在胰島素分泌囊泡及在細(xì)胞膜上的定位說(shuō)明它參與了鋅在含胰島素囊泡內(nèi)的蓄積，因此它在胰腺胰島β細(xì)胞內(nèi)的胰島素的成熟及外排上發(fā)揮著作用。ZnT-8蛋白質(zhì)及相應(yīng)的多核苷酸第一次被用作為胰腺胰島β細(xì)胞的特異的和可靠的標(biāo)記物；這種標(biāo)記物的用途具體的如下所述-細(xì)胞分選該標(biāo)記物使得肉眼可見(jiàn)地選擇性分選及檢測(cè)β細(xì)胞成為可能，它不需要化學(xué)地或生物地修飾所述的細(xì)胞，特異地是用針對(duì)所述蛋白質(zhì)的抗體。-體外研究模型該標(biāo)記物可被用于體外研究⑴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SiT-8)在模型細(xì)胞系(例如INS-I小鼠胰島素瘤細(xì)胞系)中的過(guò)表達(dá)及對(duì)應(yīng)答于葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響；(ii)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激條件或者低或高鋅濃度所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)的敏感性； 以及(iii)應(yīng)答于各種外源性刺激(生長(zhǎng)因子、胰腺提取物)，干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的過(guò)程。-篩選藥物該標(biāo)記物也代表一種用于篩選能介導(dǎo)aiT-8基因表達(dá)和/或aiT-8 蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的有用的藥理學(xué)靶點(diǎn)，該物質(zhì)有可能被用于糖尿病和高胰島素血癥的治療。-糖尿病的診斷多核苷酸也可被便利地用于在高危家族中早期診斷糖尿病，具體地是它使得檢測(cè)aiT-8基因中的可見(jiàn)突變以及減少或甚至減免通常所進(jìn)行的檢查成為可能。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是作為胰腺胰島β細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的至少一種分離的多核苷酸或相應(yīng)蛋白質(zhì)的用途，這些多核苷酸選自-包括或具有以下序列之一的多核苷酸(a)序列SEQID NO. 1 ； (b)序列SEQ ID NO. 1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，優(yōu)選的是20個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選的是25到30個(gè)核苷酸的片段；(c) 一種在最佳比對(duì)后，與(a)或(b)中所定義的序列之一具有至少80%相同性百分比的序列；以及⑷一種與(a)、(b)或(c)中所定義的序列之一互補(bǔ)的有義或反義序列；以及-由上述(a)、(b)、(c)或(d)中所定義的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)，包括或具有以下序列之一 (e)序列SEQ ID NO. 2 ； (f)序列SEQ ID N0. 2的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；(g) —種在最佳比對(duì)后，與(e)或(f)中所定義的序列之一具有至少60%相同性百分比或至少65%相似性的序列，優(yōu)選具有80%相同性或至少90%相似性，或甚至更優(yōu)選具有 90%相同性或至少95%相似性。本發(fā)明包含SiT-8蛋白質(zhì)以及如上述所定義的相應(yīng)的多核苷酸的用途?？梢詮囊葝u細(xì)胞或細(xì)胞的DNA文庫(kù)中，特異地從胰腺細(xì)胞的DNA文庫(kù)中，極特異地從人胰腺細(xì)胞的DNA文庫(kù)中分離到如上定義的多核苷酸。優(yōu)選地，所用的細(xì)胞是胰島細(xì)胞。通過(guò)在的總DNA上所進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，通過(guò)在胰腺胰島β細(xì)胞的總 RNA上所進(jìn)行的RT-PCR，或通過(guò)化學(xué)合成也可以得到如上定義的多核苷酸。為了本發(fā)明的目的，采用了以下的定義。名詞“多核苷酸”的意思是修飾或未修飾核苷酸的一個(gè)精確系列，可能包括非天然核苷酸。因此，這個(gè)名詞覆蓋了任何編碼aiT-8蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的一個(gè)片段的序列(基因組DNA、mRNA、cDNA)，也覆蓋了對(duì)應(yīng)的有義或反義寡核苷酸以及對(duì)應(yīng)的小干擾 RNA(siRNA)?！霸谧罴驯葘?duì)后與參照序列具有某一相同性百分比的核酸或蛋白質(zhì)”用于表示與參照序列比較具有某些改變的核酸或蛋白質(zhì)，例如具體為缺失、截?cái)?、延伸、嵌合融合? 或取代，具體的是點(diǎn)取代，以及在最佳比對(duì)后表現(xiàn)為與參照核苷酸或氨基酸序列具有至少 80%相同性的核苷酸序列或至少65%相同性的氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)。兩個(gè)序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)之間的“相同性百分比”用于表示在最佳比對(duì)后所得到的兩個(gè)所對(duì)比的序列之間的同一的核苷酸或氨基酸殘基的百分比，這個(gè)百分比是純粹統(tǒng)計(jì)上的百分比，以及兩個(gè)序列之間的差異是隨機(jī)分布的且分布于序列的全長(zhǎng)內(nèi)。名詞“最優(yōu)比對(duì)”或“最佳比對(duì)”用于表示通過(guò)下文所述的比對(duì)所確定的相同性百分比是最高的。按慣例進(jìn)行兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的比較在將這些序列最佳比對(duì)之后比較這些序列，通過(guò)片段或通過(guò)“比較窗”進(jìn)行比較以辨別并比較序列的局部區(qū)域的相似性。具體地用以下算法的其中一種可以進(jìn)行比較序列的最佳比對(duì)Smith 和Waterman(1981)的局部同源性算法、Neddleman和^msch(1970)的局部同源性算法、 Pearson和Lipman(1988)的相同性搜索方法、使用這些算法的計(jì)算機(jī)程序(威斯康辛遺傳軟件包(遺傳計(jì)算機(jī)組，575 Science Dr.，Madison，WI)或因特網(wǎng)服務(wù)器中的GAP、 BESTFIT,BLAST P,BLASTN,BLASTX, TBLASTX,FASTA 和 TFASTA，特別是那些國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)、EMBL (http //www. embl. org)禾口 Ensenmbl 項(xiàng)目 (http://www. ensembl. org)的月艮務(wù)器)。為了得到最佳比對(duì)，優(yōu)選地用BLOSUM 62矩陣使用BLAST程序。也可以將PAM或 PAM250矩陣作為一種用于核苷酸序列的相同性矩陣。為了得到“特異性雜交”，優(yōu)選地使用高嚴(yán)格性的雜交條件，即所選定的溫度條件
和離子強(qiáng)度條件使得它們?nèi)菰S進(jìn)行所要求的互補(bǔ)的多核苷酸之間的特異的及選擇性的雜 、-父。經(jīng)舉例說(shuō)明的方法，為了定義上述的多核苷酸的目的，在雜交步驟中的高嚴(yán)格性的條件優(yōu)選地是如下的條件分兩步進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交(1)在42°C含有切 SSC(lxSSC相應(yīng)于0. 15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉溶液)、50%甲酰胺、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、10x Denhardt、5%硫酸右旋糖酐和鮭精DNA的磷酸緩沖液中預(yù)雜交3個(gè)小時(shí)；( 在一個(gè)依賴于探針長(zhǎng)度的溫度下雜交20個(gè)小時(shí)(即，對(duì)于比100個(gè)核苷酸更長(zhǎng)的探針的溫度為42°C )，緊接著是在20°C 2xSSC+2% SDS中洗滌20分鐘兩次，在20°C 0. Ix SSC+0. 1% SDS中洗滌1次。對(duì)于比100個(gè)核苷酸更長(zhǎng)的探針，則在60°C 0. Ix SSC+0. 1% SDS中進(jìn)行末次洗滌60分鐘。對(duì)于更長(zhǎng)或更短的探針，本領(lǐng)域人員可以調(diào)整上述的針對(duì)所定義長(zhǎng)度的探針的高嚴(yán)格性的雜交條件。“合適的技術(shù)或方法”在此用于指的是本領(lǐng)域人員所常用的及許多著作所闡述的熟知技術(shù)或方法，例如在名為分子克隆的著作(Laboratory Manual (Sambrook J, Russell Dff. (2000)Cold Spring Harbor Laboratory Press) [13])中所闡述的。在最佳比對(duì)后，c)中所定義的多核苷酸與a)或b)中所定義的序列之一具有至少 80%的相同性百分比，優(yōu)選具有90%，更優(yōu)選具有95%，甚至更優(yōu)選具有98%。c)中所定義的多核苷酸包括序列SEQ ID NO. 1的變體的多核苷酸，即相應(yīng)于等位基因變體的所有多核苷酸，即相應(yīng)于序列SEQ ID NO. 1的單一變異的多核苷酸。這些天然的變異序列相應(yīng)于哺乳動(dòng)物特別是人所具有的多態(tài)性，以及特別地相應(yīng)于能導(dǎo)致病變出現(xiàn)的多態(tài)性，例如胰島內(nèi)的細(xì)胞死亡和糖尿病。“變異多核苷酸”也用于表示任何其mRNA將序列SEQ ID NO. 1的多核苷酸作為其互補(bǔ)DNA的基因組序列的剪切位點(diǎn)的突變或變異所形成的RNA或cDNA。當(dāng)排列兩個(gè)序列使得能得到兩者之間的最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，根據(jù)同一氨基酸殘基或保守取代而不同的氨基酸殘基的百分比評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)與參照蛋白質(zhì)的相似性。為了本發(fā)明的目的，名詞“保守取代”用于表示用一種具有相似化學(xué)特性(大小、電荷或極性)的氨基酸對(duì)另一種氨基酸的取代，這種取代通常不改變蛋白質(zhì)的功能特性。當(dāng)一種蛋白質(zhì)序列可以包括最多到每100個(gè)參照序列的氨基酸的100-X個(gè)非保守改變時(shí)，在本發(fā)明中該蛋白質(zhì)被定義為有著與參照序列具有至少相似性的氨基酸序列。 為了本發(fā)明的目的，名詞“非保守改變”包括對(duì)參照序列中的氨基酸的刪除、非保守取代、或連續(xù)的或分散的插入。(g)中所定義的蛋白質(zhì)包括為序列SEQ ID N0. 2的變體的蛋白質(zhì)，即由上述所定義的變異多核苷酸所編碼的變異蛋白質(zhì)，具體的是其氨基酸序列相對(duì)于序列SEQ ID N0. 2具有至少一個(gè)突變的蛋白質(zhì)，這些突變具體的是至少一個(gè)氨基酸殘基的截?cái)唷⑷笔?、取代? 或添力口。優(yōu)選地，變異蛋白質(zhì)具有與糖尿病或高胰島素血癥相關(guān)的突變。根據(jù)本發(fā)明的用途的一個(gè)有利的實(shí)施方案，如(C)中所定義的所述分離的多核苷酸是序列SEQ ID NO. 1的一種變體，它包括一個(gè)造成序列SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變的突變。根據(jù)本發(fā)明的用途的另一個(gè)有利的實(shí)施方案，如(b)或(d)中所定義的所述分離的多核苷酸選自SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4的引物對(duì)以及SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6 的引物對(duì)。根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個(gè)有利的實(shí)施方案，通過(guò)利用上面所定義的引物對(duì)的擴(kuò)增可獲得所述分離的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個(gè)有利的實(shí)施方案，(d)中所定義的所述多核苷酸是小干擾RNA(siRNA)，通過(guò)其與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用可引起mRNA降解。根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個(gè)有利的實(shí)施方案，如(g)中所定義的所述蛋白質(zhì)是SEQ ID NO. 2的變體，它具有與糖尿病或高胰島素血癥相關(guān)的突變。根據(jù)本發(fā)明的用途的仍另一個(gè)有利的實(shí)施方案，(f)中所定義的所述片段具有一個(gè)選自 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 的序列。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一個(gè)如上面所定義的多核苷酸，除了 -NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為 No. AX526723、No. AX526725 和 No. AX526727 的序列中所包括的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；-在基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為BM565129、BM310003、BM875526、BG655918、 BQ417284、BQ267316、BU072134、BQ267526、BQ270198、BU581447、BU070173、BQ631692 和 BU949895的EST，以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為AX5^723、AX526725和AX526727的序列。本發(fā)明的片段可以被特異地作為用于檢測(cè)/擴(kuò)增相應(yīng)于其他生物體的本發(fā)明的多核苷酸的多核苷酸(RNA或基因組DNA)的探針或引物。優(yōu)選地，可以使用的本發(fā)明的引物對(duì)是那些相應(yīng)于序列SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4以及序列SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6所定義的引物對(duì)。本發(fā)明的一個(gè)主題也是可以通過(guò)利用如上面所定義的引物進(jìn)行擴(kuò)增而得到的多
核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)有利的實(shí)施方案，它是一種相應(yīng)于如上面所定義的多核苷酸的小干擾RNA，在長(zhǎng)度上少于30個(gè)核苷酸，優(yōu)選的長(zhǎng)度為20和23個(gè)核苷酸之間， 通過(guò)其與所述多核苷酸的相應(yīng)的mRNA相互作用可引起它們降解。通過(guò)本領(lǐng)域人員所熟知的任何方法可以得到這些siRNA，例如通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)載體的表達(dá)。發(fā)明包括相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的有義寡核苷酸，通過(guò)其與在調(diào)控本發(fā)明的所述多核苷酸的表達(dá)中所涉及的蛋白質(zhì)的相互作用將誘導(dǎo)該表達(dá)的抑制或活化。為了得到可檢測(cè)的和/或可定量的信號(hào)，利用本領(lǐng)域人員所熟知的方法可以用放射性或非放射性化合物直接或間接地標(biāo)記本發(fā)明的探針和引物。用放射性元素或用非放射性分子實(shí)現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的引物或探針的標(biāo)記。在所用的放射性同位素中，所提及的包括邛、3節(jié)、353、咕或1251。非放射性構(gòu)件選自例如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或異羥基洋地黃毒甙元的配體、半抗原、染料和例如放射性發(fā)光物、化學(xué)發(fā)光物、生物發(fā)光物、熒光劑或磷光劑的發(fā)光物。因此，在使用引物或探針的方法特別是PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù) (U. S. N0. 4, 683, 202)中可以將本發(fā)明的多核苷酸用作為引物和/或探針。其他用于擴(kuò)增靶核酸的技術(shù)可以被用作為對(duì)PCR的一種替換方法。目前存在用于這種擴(kuò)增的大量方法， 例如SDA(鏈取代擴(kuò)增)技術(shù)、TAS(基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系)技術(shù)、3SR(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增) 技術(shù)、NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù)、TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)技術(shù)、LCR(連接酶鏈反應(yīng))技術(shù)、PCR(修補(bǔ)鏈反應(yīng))技術(shù)、CPR (循環(huán)探針?lè)磻?yīng))技術(shù)、和Q-β-復(fù)制酶擴(kuò)增技術(shù)。 也提到了 PCR-SSCP，這使得檢測(cè)點(diǎn)突變成為可能。當(dāng)然本領(lǐng)域人員非常知道這些技術(shù)。作為探針或作為引物，本發(fā)明的各種多核苷酸使得或確定生物學(xué)樣品中的所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜或這種轉(zhuǎn)錄譜的任何可能的改變，或證實(shí)所對(duì)應(yīng)的基因、該基因的等位基因變體或所述基因內(nèi)的至少一個(gè)外顯子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變(插入、缺失或取代)所造成的該基因的任何可能的功能性改變(造成所述基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性的根本改變)成為可能。這些突變具體地包括在相應(yīng)于定位于對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性至關(guān)重要的區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基的密碼子的缺失、插入或非保守取代。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種用于確定生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的轉(zhuǎn)錄譜或所述的轉(zhuǎn)錄譜的改變的方法，包括第一步，從生物學(xué)樣品中得到總 RNA,第二步，在適合于RNA和探針之間雜交的條件下，將所述RNA與包括本發(fā)明的多核苷酸的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。根據(jù)所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第二步可以是一個(gè)利用上面所述的一對(duì)引物所實(shí)施的逆轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)增的步驟，以及第三步可以是用任何合適的方式顯示所形成的擴(kuò)增的核酸的步驟。用于確定基因的轉(zhuǎn)錄譜的所述的方法也包括一個(gè)由通過(guò)與預(yù)先選定的對(duì)照樣品比較評(píng)價(jià)基因的轉(zhuǎn)錄水平，以及任選地研究其與可檢測(cè)的表型例如前胰島素轉(zhuǎn)化為成熟胰島素的量、細(xì)胞的胰島素含量、應(yīng)答于葡萄糖的刺激所分泌的胰島素的量、細(xì)胞內(nèi)或囊泡內(nèi)的鋅濃度、或細(xì)胞表面上所表達(dá)的蛋白質(zhì)(基因產(chǎn)物)的量的相關(guān)性所構(gòu)成的步驟。例如所述的對(duì)照樣品可以包括一個(gè)在相同的條件下可應(yīng)用所述的用于確定基因的轉(zhuǎn)錄譜的方法的具有相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的正?；蚋淖儽磉_(dá)的生物學(xué)樣品。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種用于確定生物學(xué)樣品中的相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因或所述基因的等位基因變體或該基因的功能性改變的方法，包括第一步，用任何合適的方式從生物學(xué)樣品中得到DNA，第二步，在適合于DNA和探針之間的特異性雜交的條件下將所述DNA與包括本發(fā)明的多核苷酸的標(biāo)記探針相接觸，以及第三步，用任何合適的方式顯示所形成的雜合體。根據(jù)所述方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案，第二步可以是用如上所述的一對(duì)引物實(shí)施的一個(gè)擴(kuò)增步驟，以及第三步可以是一個(gè)用任何合適的方式顯示所形成的擴(kuò)增的核酸的步驟。本發(fā)明可以任選地包括第四步，分離并測(cè)序所證實(shí)的核酸。后一方法也可以使得分離相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因的等位基因成為可能， 它們與可檢測(cè)的表型例如餐后血糖的變化、是否存在胰島素的分泌、應(yīng)答于葡萄糖刺激的循環(huán)葡萄糖的水平或所分泌的胰島素的量相關(guān)，以及通常與I型或II型糖尿病類(lèi)型的病理或與鋅代謝異常相關(guān)。在胰島素釋放期間所分泌的鋅作用于鉀通道，該通道通過(guò)鈣通道引起這種外排作用。因此，這是一種反饋環(huán)[14]。本發(fā)明的多肽涉及于鋅在含有胰島素的囊泡中的蓄積，以及在外排期間它也被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞膜上。因此蛋白質(zhì)的突變體可以改變囊泡中所含有的鋅的量或鋅在細(xì)胞周邊的濃聚，并因此改變了鉀通道的開(kāi)放狀態(tài)，依賴于突變體的作用造成了胰島素分泌的減少或增加(I型糖尿病或高胰島素血癥)。在這個(gè)特殊的方法中，生物學(xué)樣品將是來(lái)源于表達(dá)所述的可檢測(cè)表型的個(gè)體的樣品。這些方法，特別是那些基于尋找基因內(nèi)的突變的方法可以容許預(yù)先證實(shí)對(duì)糖尿病的易感性，或診斷糖尿病或任何與糖尿病相關(guān)的病變，或?qū)固悄虿≈委煹姆肿踊騽┝康膫€(gè)體適應(yīng)性。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種進(jìn)行上述方法的試劑盒，包括a)至少一種本發(fā)明的探針或引物對(duì)；b)進(jìn)行所述的探針和/或所述的引物與所測(cè)試的生物學(xué)樣品的核酸之間的雜交反應(yīng)所需的試劑；
c)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑；d)檢測(cè)和/或測(cè)定所述的探針和生物學(xué)樣品的核酸所形成的雜合體、或所形成的擴(kuò)增的核酸所需的試劑。這樣的試劑盒也可以包括用于確保所得到的結(jié)果的質(zhì)量的陽(yáng)性或陰性對(duì)照。它們也可以包括制備生物學(xué)樣品的核酸所需的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)主題是一個(gè)DNA芯片，包括至少一個(gè)本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的仍另一個(gè)主題是如上面所定義的多核苷酸用于制備DNA芯片的用途。本領(lǐng)域人員根據(jù)所選自的支持物能選自用于生產(chǎn)這樣一種芯片的合適的制備技術(shù)，例如通過(guò)將寡核苷酸沉淀到玻璃或尼龍支持物上，或經(jīng)化學(xué)或電化學(xué)地植入寡核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸在體外可被用作為研究以下方面的工具a)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SiT-8)在模型細(xì)胞系(例如INS-1胰島素瘤細(xì)胞系)中的過(guò)表達(dá)以及對(duì)應(yīng)答于葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響；b)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激條件或者低或高鋅濃度條件所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)的敏感性；c)干細(xì)胞應(yīng)答于各種外來(lái)刺激(生長(zhǎng)因子、胰腺提取物)分化為胰島素分泌細(xì)胞的過(guò)程。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。為了本發(fā)明的目的，名詞“蛋白質(zhì)”用于表示一個(gè)精確的修飾或非修飾氨基酸系列，可能包括非天然氨基酸。或從β細(xì)胞，或通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)重組DNA技術(shù)，具體地是利用包括含有如上所定義的多核苷酸的插入物的表達(dá)載體的重組DNA技術(shù)都能得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及如上所定義的多核苷酸用于生產(chǎn)如上所定義的ΖηΤ-8蛋白質(zhì)的用途。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，可以通過(guò)多種已知的肽合成途徑的任何一種途徑得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如使用固相的技術(shù)或使用部分固相的技術(shù)、通過(guò)片段濃縮或通過(guò)溶液中的傳統(tǒng)合成方法。對(duì)于這種情況，可以改變蛋白質(zhì)的序列以改進(jìn)它的可溶性，特別是在水溶劑中的可溶性。本領(lǐng)域人員已知這些改變，例如疏水性區(qū)域的缺失或用親水性氨基酸取代疏水性氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是一種包括或具有序列SEQ ID NO. 2的蛋白質(zhì)(相應(yīng)于 ΖηΤ-8基因所編碼的蛋白質(zhì))。本發(fā)明的一個(gè)主題也是如上所定義的蛋白質(zhì)的一個(gè)片段，其特征在于其選自由序列 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所組成的組。本發(fā)明的另一個(gè)主題是一種蛋白質(zhì)芯片，它包括如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。本發(fā)明的仍另一個(gè)主題是如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于制備蛋白質(zhì)芯片的用途。與DNA芯片一樣，本領(lǐng)域人員根據(jù)所選定的支持物能選擇用于制備這樣的芯片的合適的制備技術(shù)。如上所定義的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或蛋白質(zhì)芯片可被用于檢測(cè)在個(gè)體血清中所存在的針對(duì)所述蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明也涉及如上所定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段用于免疫化學(xué)和免疫酶學(xué)方法測(cè)試的用途，以及用于搜索針對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的自身抗體的用途。本發(fā)明的一個(gè)主題也是克隆和/或表達(dá)被插入本發(fā)明的多核苷酸的載體。這樣的載體可以包括表達(dá)及任選地分泌宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)所需的元件。所述的載體優(yōu)選地包括一個(gè)啟動(dòng)子、翻譯起始和終止信號(hào)、以及用于轉(zhuǎn)錄的合適的調(diào)控區(qū)。它們被穩(wěn)定地保留于細(xì)胞內(nèi)應(yīng)當(dāng)是可能的，并且它們可以任選地包括編碼特異于分泌所翻譯蛋白質(zhì)的特殊信號(hào)，例如強(qiáng)的遍在的啟動(dòng)子，或一種選擇性地存在于特殊細(xì)胞和/或組織類(lèi)型例如胰腺的啟動(dòng)子。根據(jù)所用的細(xì)胞宿主，選擇這些不同的控制序列。本發(fā)明的多核苷酸可以被插入到在所選宿主內(nèi)自主復(fù)制的載體或整合到所選宿主中的載體。在自主復(fù)制的體系中，根據(jù)宿主細(xì)胞，優(yōu)選地使用質(zhì)?；虿《绢?lèi)型的體系。病毒載體具體地可以是腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘病毒或皰疹病毒。那些本領(lǐng)域人員知道可被用于每一種如此體系的技術(shù)。當(dāng)需要序列被整合于宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)時(shí)，例如使用質(zhì)?；虿《绢?lèi)型的體系是可能的，這些病毒是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺伴隨病毒(AAV)。在非病毒載體中，優(yōu)先使用的載體是裸多核苷酸例如裸DNA或RNA，細(xì)菌人工染色體(BAC)、用于酵母內(nèi)表達(dá)的酵母人工染色體(YAC)、用于小鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的小鼠人工染色體(MAC)以及優(yōu)選地用于人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的人人工染色體(HAC)。根據(jù)本領(lǐng)域人員常用的方法制備這些載體，以及用標(biāo)準(zhǔn)方法可以將所形成的重組載體引入到合適的宿主中，例如脂轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、熱休克法、化學(xué)膜透化后的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合。本發(fā)明的一個(gè)主題也是經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞，具體的是原核和真核細(xì)胞，其中至少一種本發(fā)明的多核苷酸或至少一種本發(fā)明的載體已經(jīng)被引入到細(xì)胞中。在可以被用于本發(fā)明的目的的細(xì)胞中，所提及的細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。所提及的細(xì)胞也可以包括方法可以實(shí)施于其上的昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如方法可以使用桿狀病毒。本發(fā)明的一個(gè)主題也是非人的轉(zhuǎn)基因生物體，例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物，其中所有的或一部分細(xì)胞含有游離或整合形式的本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體。優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明，非人的轉(zhuǎn)基因生物體是那些攜帶由含有無(wú)功能的或具有一個(gè)突變的本發(fā)明的多核苷酸的細(xì)胞的生物體。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是嚙齒類(lèi)動(dòng)物，具體的是小鼠、鼠或兔，以及豬科(Suidae)，具體的是豬。用本領(lǐng)域人員已知的任何常用方法可以獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如通過(guò)胚胎干細(xì)胞的同源重組、將這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胚胎內(nèi)、選擇生殖系中被影響的嵌合體以及上述的嵌合體的生長(zhǎng)。因此本發(fā)明的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物可以表達(dá)或過(guò)表達(dá)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因或它們的同源基因，或表達(dá)所述的已經(jīng)引入一個(gè)突變的基因。例如可以將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用作為用于研究糖尿病病因的模型。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體可以被用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
11
根據(jù)本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)可以純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，可以單獨(dú)或聯(lián)合地用方法從細(xì)胞裂解液和提取物中、或從培養(yǎng)基上清液中純化出蛋白質(zhì)，這些方法例如分餾法、層析法、利用特異的單克隆或多克隆抗體的免疫親和技術(shù)等。優(yōu)選地，根據(jù)一個(gè)方法純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，這個(gè)方法包括第一步，用離心分離出膜蛋白質(zhì)，隨后是第二步，用 T. C. Thomas, M. G. McNamee, (Purification of membrane proteins. Section IX, pp 499-520, in Methods in Enzymology, Guide to Protein Purification, edited by M. P. Deutscher, vol. 182，Academic Press, New York, 1990)所描述的免疫親禾口法純化。本發(fā)明的一個(gè)主題也是用于制備重組SiT-8蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其包括在容許表達(dá)所述蛋白質(zhì)以及純化所述的重組蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)修飾的細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或來(lái)源于本發(fā)明的非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體的細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種蛋白質(zhì)，其特征在于可以用任何一種上述的制備方法得到的蛋白質(zhì)。如上所示所得到的蛋白質(zhì)可以是糖基化和非糖基化形式，以及可以或可以不具有天然蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明者通過(guò)研究跨膜電位的方法也已經(jīng)能夠顯示出本發(fā)明的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有3個(gè)細(xì)胞外氨基酸環(huán)(第96-106位、164-176位和M1-245位氨基酸)，可以制成針對(duì)于此的單克隆或多克隆抗體。因此本發(fā)明的一個(gè)主題也是單克隆或多克隆抗體，其特征在于其們能特異地識(shí)別本發(fā)明的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，抗體特異地識(shí)別序列SEQ ID N0. 2蛋白質(zhì)、它的片段、或如上所定義的所述蛋白質(zhì)的變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體特異地識(shí)別相應(yīng)于SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 10(PEP1、PEP2和PEP4)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞外環(huán)，和/或相應(yīng)于SEQ ID NO. 9 (PEP3)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)。例如本發(fā)明的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或Fab或F(ab’)2片段。為了得到可檢測(cè)的和/或可定量的信號(hào)，它們也可以是免疫交聯(lián)物或標(biāo)記抗體的形式。可以直接從人血清或用本發(fā)明的蛋白質(zhì)接種的動(dòng)物血清中得到所述的抗體，本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異地是那些由基因重組或肽合成所生成的蛋白質(zhì)。根據(jù)常用的方法可以得到特異的多克隆抗體。根據(jù)傳統(tǒng)的雜交瘤培養(yǎng)方法可以得到特異的單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)主題是一種包括至少一種本發(fā)明的抗體的蛋白質(zhì)芯片。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體用于制備包括所述抗體的蛋白質(zhì)芯片的用途。本領(lǐng)域人員能根據(jù)所選自的支持物選擇用于生產(chǎn)這樣的芯片的合適的制備技術(shù)。本發(fā)明的一個(gè)主題也是本發(fā)明的抗體或抗體芯片用于檢測(cè)和/或純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)的用途，優(yōu)選地是所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)環(huán)，優(yōu)選地是相應(yīng)于SEQ ID N0. 7到 SEQ ID NO. 10 的序列。總而言之，可以在任何必須能觀察到本發(fā)明的正?；蛲蛔兊鞍踪|(zhì)表達(dá)的狀態(tài)下有利地應(yīng)用本發(fā)明的抗體。具體地，單克隆抗體可以被用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的這些蛋白質(zhì)。因此，它們構(gòu)成了一組對(duì)特異組織切片中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)分析的方法，具體的是對(duì)SEQ ID NO. 2蛋白質(zhì)或它的一種變體。一般地，對(duì)于這些分析，所用的抗體可被例如金標(biāo)記方法用免疫熒光化合物所標(biāo)記以成為可檢測(cè)的抗體，或酶免疫交聯(lián)物的形式。具體地它們使得驗(yàn)證這些蛋白質(zhì)在生物學(xué)組織或樣品中的異常表達(dá)成為可能。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的SiT-8蛋白質(zhì)的方法，包括第一步，將生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體接觸，以及第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證所形成的抗原-抗體復(fù)合物。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種用于進(jìn)行上述方法的試劑盒，包括a)至少一種本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體；b)檢測(cè)在免疫反應(yīng)期間所形成的抗原-抗體復(fù)合物的試劑；根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特殊的實(shí)施方案，試劑盒可以任選地包括用于構(gòu)成容許免疫反應(yīng)的媒介的試劑。利用人或動(dòng)物的胰腺，具體的是小鼠、鼠、兔和豬的胰腺，本發(fā)明的抗體也被用于檢測(cè)和/或分選胰島，優(yōu)選地是β細(xì)胞。對(duì)于分離的細(xì)胞，可以用流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行這樣的分選。對(duì)于島，將它們標(biāo)記將改善目前的分離方法用Ficoll、euro-Ficoll或 Ficoll-乏影葡胺鈉通過(guò)密度梯度的分離，或一種優(yōu)選的方法，它是一種細(xì)胞分離器上的白蛋白質(zhì)梯度。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種用于分選胰島β細(xì)胞的方法，包括第一步，將可能含有這些島和/或細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證抗體所標(biāo)記的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞。本發(fā)明的抗體也可以用于監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞的過(guò)程，這些細(xì)胞特異地是人或動(dòng)物細(xì)胞，并且也可被用于分選這些在分化后表達(dá)aiT-8蛋白質(zhì)，具體的是序列 SEQ ID NO. 2蛋白質(zhì)的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種用于監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化為胰島細(xì)胞或分化為β細(xì)胞的過(guò)程的方法，包括第一步，將可能含有所述的正在進(jìn)行分化的干細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，第二步，用任何合適的方式驗(yàn)證抗體所標(biāo)記的細(xì)胞，以及第三步，用任何合適的方式識(shí)別所標(biāo)記的抗體。所述的方法也可以包括附加步驟包括用任何合適的方式分離所標(biāo)記的細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片可被用于篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的多核苷酸相互作用和/或調(diào)控所述多核苷酸的表達(dá)的化學(xué)或生物化學(xué)化合物。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的多核苷酸相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片接觸，以及第二步，檢測(cè)在候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片之間所形成的復(fù)合物。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的多核苷酸、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或DNA芯片接觸，以及第二步，用任何合適的方式測(cè)定所述多核苷酸的表達(dá)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片可被用于篩選在體外或體內(nèi)能直接或間接地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用，和/或能調(diào)控所述蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的化學(xué)或生物化學(xué)化合物。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)或生物化學(xué)化合物的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片接觸，以及第二步，檢測(cè)在候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片之間所形成的復(fù)合物。本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種篩選能在體外或體內(nèi)直接或間接地調(diào)控本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的方法，其特征在于其包括第一步，將候選的化學(xué)或生物化學(xué)化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因生物體或蛋白質(zhì)芯片接觸，以及第二步，用任何合適的方式測(cè)定所述蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性。本發(fā)明的一個(gè)主題也是用作藥物的本發(fā)明的多核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、載體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體、載體或轉(zhuǎn)化細(xì)胞可被用于制備用于預(yù)防和/或治療糖尿病(特別是與存在至少一種相應(yīng)于SEQ ID NO. 1的基因的突變、和/或相應(yīng)于SEQ ID NO. 2的蛋白質(zhì)的異常表達(dá))，或用于預(yù)防和/或治療高胰島素血癥(當(dāng)觀察到胰島素基因的異常的表達(dá)、成熟或分泌)，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞內(nèi)的和/或待被修飾以用于分泌胰島素的細(xì)胞內(nèi)的胰島素的成熟和分泌，或用于調(diào)節(jié)β細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象的藥物。異常表達(dá)的意思是過(guò)表達(dá)、表達(dá)低下或表達(dá)突變蛋白質(zhì)。異常成熟的意思是前胰島素不能被蛋白質(zhì)裂解或不能被蛋白質(zhì)充分地裂解為胰島素，或胰島素和鋅在細(xì)胞內(nèi)分泌囊泡內(nèi)不能共結(jié)晶、不充分共結(jié)晶或過(guò)多共結(jié)晶。本發(fā)明的一個(gè)主題也是本發(fā)明的蛋白質(zhì)或抗體的多核苷酸用于確定編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因的等位基因變異性、突變、缺失、雜合性的喪失或任何遺傳學(xué)異常。通過(guò)分析本發(fā)明的核酸和序列(基因組DNA、RNA或cDNA)以及本發(fā)明的抗體使得直接檢測(cè)序列 SiT-8基因中的突變成為可能。特別地，識(shí)別具有突變的抗原決定簇的本發(fā)明的抗體的用途使得區(qū)別“正?！钡鞍踪|(zhì)與“與病變相關(guān)的”蛋白質(zhì)成為可能。本領(lǐng)域人員也知道如何進(jìn)行研究基因表達(dá)的變化的技術(shù)，例如通過(guò)具體地用 Northern印跡或用本發(fā)明的探針或引物的RT-PCR對(duì)mRNA的分析，或通過(guò)具體地用利用本發(fā)明的抗體的Western印跡對(duì)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的分析。除了上述的內(nèi)容外，本發(fā)明也包括其他在下面的描述中所出現(xiàn)的內(nèi)容，描述指的是進(jìn)行本發(fā)明的實(shí)施例以及附圖，其中-

圖1顯示了通過(guò)對(duì)編碼ZnT-8蛋白質(zhì)(A)的mRNA的組織表達(dá)的RT-PCR分析， 通過(guò)比較遍在的肌動(dòng)蛋白質(zhì)mRNA⑶的表達(dá)。1 腦；2 心臟；3 腎臟；4 脾臟；5 肝臟；6 結(jié)腸；7 肺；8 小腸；9 肌肉；10 胃；11 睪丸；12 胎盤(pán)；13 唾液腺；14 甲狀腺；15 腎上腺；16 胰腺；17 卵巢；18 子宮；19 前列腺；20 皮膚；21 白細(xì)胞；22 骨髓；23 胎腦； 24 :胎肝。只在胰腺(第16列)中檢測(cè)了所述mRNA的表達(dá)。
-圖2顯示了對(duì)在鼠胰島素瘤細(xì)胞INS-I(第1列)、胎兒(第2列)和成人(第3 列)胰島中的編碼SiT-8蛋白質(zhì)的mRNA的表達(dá)的分析，通過(guò)與上皮細(xì)胞系(Hela細(xì)胞系) 的比較。在鼠胰島素瘤細(xì)胞系和成人及胎兒胰島中檢測(cè)到了 mRNA，而在上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞系)中沒(méi)有檢測(cè)到任何轉(zhuǎn)錄。將肌動(dòng)蛋白質(zhì)mRNA用作為對(duì)照。-圖3顯示了對(duì)aiT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞(Hela細(xì)胞系)中的定位的熒光顯微鏡分析。熒光被定位于細(xì)胞漿的囊泡內(nèi)，以及也被定位于細(xì)胞膜上。-圖4顯示了對(duì)aiT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在被轉(zhuǎn)化的鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1細(xì)胞系)中的定位的熒光顯微鏡分析。熒光被定位于分泌囊泡中，說(shuō)明aiT-8在胰島素的成熟與外排中的作用。下面的實(shí)施例只是用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，并不是以任何方式來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例1 克降編碼&ιΤ-8蛋白質(zhì)的cDNA利用可獲得的人基因組序列通過(guò)搜索與SiT家族的基因同源的基因，用生物信息學(xué)確定出被稱(chēng)為aiT-8基因的編碼aiT-8蛋白質(zhì)的基因。對(duì)基因組序列的分析使得定位和確定aiT-8基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)成為可能。利用從SiT-8基因的序列中所確定出的引物對(duì)(SEQ ID NO. 5 5，-ACTCTAGAATGGA GTTTCTTGAAAGAACGT A和 SEQ ID NO. 6 5，-AATCTAGAGTCACAGGGGTCTTCACAGA)用 RT-PCR從根據(jù)在T. Kenmochi等(Pancreas，2000，20，2，184-90)中所給出的技術(shù)所制備的人胰島的 mRNA中擴(kuò)增出編碼ZnT-8的cDNA。更詳細(xì)地，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，用RNA提取試劑盒(Roche)從胰島中提取出總RNA。 然后通過(guò)測(cè)定在250nm下的吸光度檢測(cè)所得到的RNA，并將其保存在_80°C。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，用Titan單管RT-PCR試劑盒(Roche)和引物對(duì)SEQ ID NO. 5 及SEQ ID N0. 6進(jìn)行擴(kuò)增。在52°C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，然后通過(guò)30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 53°C 30s，72°C 1分鐘)及在72°C最后延伸5分鐘的方式擴(kuò)增所合成的cDNA。在存在溴化乙錠時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳(1.5%)分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用核酸純化試劑盒 (QIAGEN)純化包括具有序列SEQ ID NO. 1的cDNA序列的1123堿基對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例2 對(duì)編碼ZnT-8蛋白質(zhì)的mRNA的組織表達(dá)的分析利用下面的引物:SEQID NO. 3 :5，-GAT GCT GCC CAC CTC TTA ATT GAC禾口SEQ ID NO. 4 :5，-TCA TCT TTT CCA TCC TGG TCT TGG，用 PCR 分析編碼 ZnT_8 蛋白質(zhì)的 mRNA 在從各種人組織中制備得到的商業(yè)化cDNA中的表達(dá)。引物(SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4)選自兩個(gè)不同的外顯子，以編碼擴(kuò)增基因組序列。所測(cè)試的組織為1 腦；2 心臟；3 腎臟； 4 脾臟；5 肝臟；6 結(jié)腸；7 肺；8 小腸；9 肌肉；10 胃；11 睪丸；12 胎盤(pán)；13 唾液腺； 14 甲狀腺；15 :腎上腺；16 胰腺；17 卵巢；18 子宮；19 前列腺；20 皮膚；21 :白細(xì)胞； 22 骨髓；23 胎腦；24 胎肝。更詳細(xì)地，將2 μ 1 cDNA與2種特異引物(1 μ M終濃度)和常用的PCR混和物(1單位Taq DNA聚合酶、含有1. 5mM鎂、IOmM dNTP的緩沖液)混和。通過(guò)30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 53°C 30s，72°C 1分鐘)及在72°C最后延伸5分鐘的方式進(jìn)行擴(kuò)增。然后在存在溴化乙錠時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳(1. 5% )分析產(chǎn)物。在圖1中所給出的結(jié)果顯示，通過(guò)與用作為對(duì)照的肌動(dòng)蛋白質(zhì)信使(圖1B)的比較，相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的mRNA只在胰腺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖IA的第16列)，而在其他所
15分析的23種組織的細(xì)胞內(nèi)都沒(méi)有表達(dá)(圖IA的第1到15列及17到M列)。實(shí)施例3 相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的mRNA在胎兒和成人胰腺細(xì)胞內(nèi)及在鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-I)內(nèi)的表汰利用來(lái)自各種人組織的RNA:胎兒和成人胰島、鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-1，Asfari M. et al.，Endocrinology，1992，130，1，167-78)，用 RT-PCR 進(jìn)行對(duì)編碼 ZnT-8 蛋白質(zhì)的 mRNA表達(dá)的分析，通過(guò)與用作為對(duì)照的人上皮細(xì)胞系(Hela)的比較。用磷酸緩沖液(PBS) 將IO6個(gè)細(xì)胞洗滌兩次，然后在2000g下離心3分鐘。如在實(shí)施例1中所描述的提取總RNA， 并將RNA濃度調(diào)整為Ing/ μ 1 (ZnT-8)或lpg/ μ 1 ( β -激動(dòng)蛋白質(zhì)對(duì)照)。如在實(shí)施例2中所描述的，擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖2中所給出的結(jié)果顯示編碼SiT-8蛋白質(zhì)的mRNA被表達(dá)于胎兒和成人胰島的細(xì)胞內(nèi)以及鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-I)內(nèi)，但在上皮細(xì)胞系(Hela細(xì)胞系)內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。實(shí)施例4 :ZnT~8/GFP融合蛋白質(zhì)的表汰蛋白質(zhì)是相應(yīng)于SEQ ID NO. 1 (ZnT-8)的cDNA所編碼的人蛋白質(zhì)。用)(bal限制性內(nèi)切酶消化實(shí)施例1中所得到的1123堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，然后將其克隆到載體 pcDNA3. I-CT-GFP(Invitrogen)中以得到經(jīng)測(cè)序證實(shí)的被稱(chēng)為pZnT-8-GFP的載體。將載體pZnT-8-GFP短暫地轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞系(Hela)內(nèi)并將其穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到鼠胰島素瘤細(xì)胞系(INS-I)內(nèi)。將Hela上皮細(xì)胞(ATCC編號(hào)CCL-2)培養(yǎng)于加有5%去補(bǔ)體的小牛血清和2mM谷氨酰胺的 Opti-MEM 培養(yǎng)基中(Modified Eagle，s Medium, Life Technologies) 然后將細(xì)胞在37°C孵育于富含5% CO2的濕化大氣中。將INS-I細(xì)胞培養(yǎng)于加有胎牛血清(10% )、2_巰基乙-1-醇(50 μ M)、丙酮酸鈉(ImM)、HEPES (IOmM)、L-谷氨酰胺(2mM)、100U/ml 青霉素和鏈霉素(100 μ g/ml)的 RPMI(Life Technologies)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)利用Exgen500 (Euromedex)用載體pZnT-8-GFP (每IO6個(gè)細(xì)胞 lug DNA)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于35mm Petri培養(yǎng)皿中的細(xì)胞。在用載體&iT-8-GFP轉(zhuǎn)染后，在加有400 μ g/ml G418的前述的同一培養(yǎng)基中選擇并克隆INS-I，然后用以下參數(shù)激發(fā)波長(zhǎng) 450-490nm ；發(fā)射波長(zhǎng)530nm，在倒置熒光顯微鏡(Axipvert，Zeiss)下觀察克隆的熒光。在轉(zhuǎn)染48個(gè)小時(shí)后，通過(guò)如上面所說(shuō)明的對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的INS-I細(xì)胞克隆的熒光觀察分析aiT-8-GFP融合蛋白質(zhì)在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。在圖3中所給出的結(jié)果(Hela細(xì)胞系)顯示&ιΤ_8蛋白質(zhì)被定位于細(xì)胞漿內(nèi)囊泡中及定位于細(xì)胞膜上，該定位證實(shí)aiT-8蛋白質(zhì)具有細(xì)胞外分泌途徑并且位于細(xì)胞的表在圖4中所給出的結(jié)果(INS-1細(xì)胞系)顯示SiT-8蛋白質(zhì)被定位于胰島素分泌囊泡中；該定位說(shuō)明aiT-8參與了胰島素的成熟；另外，因?yàn)樵撛囼?yàn)是在基礎(chǔ)水平(無(wú)葡萄糖的刺激)下進(jìn)行的，因此在用葡萄糖刺激后，在胰島素外排期間，蛋白質(zhì)也將存在于細(xì)胞膜上。實(shí)施例5 對(duì)ZnT-8蛋白質(zhì)序列的分析用 TMpred (http://www. ch. embnet. org/sof tware/TMPRED_form. html)禾口 SOSUI (http://sosui. proteome. bio. tuat. ac. jp/sosuimenuO. html)進(jìn)行對(duì) ZnT-8 一級(jí)序列的分析以及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。完整的aiT-8蛋白質(zhì)具有6個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域(第74-95、107-126、141-163、 177-196,216-240和246-267位氨基酸)，N和C末端位于胞漿內(nèi)。實(shí)施例6 針對(duì)ZnT-8的細(xì)胞外環(huán)(ΡΕΡ1、ΡΕΡ2和ΡΕΡ4)及針對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)(ΡΕΡ3) 的多克降杭體的制各根據(jù)Merrifield 等(J. Am. Chem. Soc. , 1964,85 :2149-) (1946)最先描述的方法固相合成相應(yīng)于具有序列 SEQ ID NO. 7 PEPl :HIAGSLAVVTDAAHLL ；SEQ ID NO. 8 :PEP2 CERLLYPDYQIQATV ；SEQ ID NO. 9 :PEP3 :CLGHNHKEVQANASVR ；禾口 SEQ ID NO. 10 :PEP4 YFKPE^QADPIC的抗原決定簇的肽，將其純化并綴合于一種載體蛋白質(zhì)(例如白蛋白質(zhì)) 上。根據(jù)以下的接種方案將綴合的肽注射到兔內(nèi)DO 首次接種；D14 第二次接種；擬8 第三次接種；D38 鑒定特異性；D56 第四次接種；D66和D80 回收血清。直接使用或用酸性介質(zhì)洗脫在蛋白質(zhì)A柱上純化后使用血清。 利用Eurogentec SA, Belgium公司的用戶說(shuō)明以及要求進(jìn)行這些操作。實(shí)施例7 對(duì)在實(shí)施例6中得到的抗體的熒光標(biāo)記通過(guò)親和層析法在蛋白質(zhì)G柱(Pharmacia)上純化抗體。將5ml血清轉(zhuǎn)入到用含有0. 15M NaCl的IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)平衡的柱(Iml)中，然后用同20ml同一緩沖液洗滌以洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后用0. IM甘氨酸-HCl溶液(pH 2. 5)分離抗體，然后用 40 μ 1 2Μ Tris-HCl 緩沖液(pH 10. 0)中和。將2mg抗體稀釋于Iml磷酸緩沖液(pH 8. 0)中。即時(shí)制備N(xiāo)HS-FITC (SIGMA ； Img/ ml DMS0)溶液。將75μ1 NHS-FITC溶液與抗體溶液混和，然后將混和物在室溫下孵育45 分鐘。按以下的方式在PDlO柱(PHARMACIA)中純化所標(biāo)記的抗體用30ml PBS洗滌柱，裝入Iml需純化的標(biāo)記抗體的溶液以及5ml PBS，最后收集2ml純化物，保存含有標(biāo)記抗體的第二部分純化物。參考文獻(xiàn)1. Soria B. In-vitro differentiation of pancreatic beta—cells. 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權(quán)利要求
1.單克隆或多克隆抗體，其特征在于其特異地識(shí)別選自SEQID No :7、8、9和10的表位。
2.權(quán)利要求1的抗體，其是嵌合抗體、人源化抗體或Fab或F(ab')2片段。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其是標(biāo)記的抗體。
4.包括至少一種權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體的蛋白質(zhì)芯片。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體用于制備蛋白質(zhì)芯片的用途。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體或權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)芯片的用途，其用于檢測(cè)和/或純化包括選自SEQ ID No :7、8、9和10的序列的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的用途，其用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的SEQID No :2的蛋白質(zhì)。
8.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的aiT-8蛋白質(zhì)的方法，其包括第一步，將所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體接觸；以及第二步檢測(cè)所形成的抗原-抗體復(fù)合物。
9.試劑盒，其包括a)至少一種權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的單克隆或多克隆抗體；b)用于檢測(cè)在免疫反應(yīng)期間產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物的試劑。
10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體的用途，其用于檢測(cè)和/或分選來(lái)自人或動(dòng)物胰腺組織的生物學(xué)樣品中的胰島和/或胰島β細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述組織選自由人胰腺、小鼠胰腺、大鼠胰腺、兔胰腺和豬胰腺組成的組。
12.一種用于選擇胰島β細(xì)胞的方法，其包括第一步，將可能含有此類(lèi)島和/或細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體接觸；第二步，檢測(cè)用所述抗體標(biāo)記的細(xì)胞；以及第三步，分離所述標(biāo)記的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體的用途，其用于追蹤干細(xì)胞分化成胰島β細(xì)胞的過(guò)程。
14.一種用于追蹤干細(xì)胞分化成胰島β細(xì)胞的過(guò)程的方法，其包括第一步，將可能含有正在分化的所述干細(xì)胞的生物學(xué)樣品的細(xì)胞與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗體接觸；第二步，檢測(cè)用所述抗體標(biāo)記的細(xì)胞；以及第三步，觀察所述標(biāo)記的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性表達(dá)于胰腺胰島β細(xì)胞的ZnT-8蛋白，涉及編碼上述的與胰島素成熟及外排相關(guān)的蛋白質(zhì)的多核苷酸，并涉及它們的應(yīng)用，例如在分選及研究β細(xì)胞和篩選治療糖尿病和高胰島素血癥的藥物上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102250242SQ20111015755
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2003年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月18日
發(fā)明者米歇爾·塞夫, 阿蘭·法維耶 申請(qǐng)人:原子能委員會(huì), 約瑟夫·傅里葉大學(xué)