專利名稱：一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如MEM)和添加劑(如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子)組成。僅僅用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞都不會(huì)存活較長時(shí)間，為了促進(jìn)它們的存活和生長，必須添加額外的因子，比如激素、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和一些痕量元素。一般來說，都選擇血清來提供這些因子。但是血清成分復(fù)雜，存在許多未知因素，有時(shí)會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，掩蓋培養(yǎng)細(xì)胞潛在的生理功能。此外，生理狀況下，由于 血一腦屏障的存在，神經(jīng)組織并不直接暴露于血漿的大部分成分中。因此，培養(yǎng)液中的血清成分可能干擾神經(jīng)細(xì)胞正常的功能活動(dòng)。血清中還含有一定的細(xì)胞毒物質(zhì)和抑制物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有去極化作用，影響細(xì)胞的功能的正常表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中血清培養(yǎng)方法存在干擾、影響觀察的問題。本發(fā)明的一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，以胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基進(jìn)行胎鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)，用神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經(jīng)元。優(yōu)選的，所述胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和O. 5mg/L亞硒酸鈉。本發(fā)明的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，具體培養(yǎng)步驟如下
步驟I)試劑的配制
基培液取 DMEM 高糖培養(yǎng)基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 25°C 一 15°C保存；
種植液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基90%，胎牛血清10% ；
飼養(yǎng)液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基99%，胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉1% ； 步驟2)原代細(xì)胞的培養(yǎng)
培養(yǎng)板的處理24孔塑料培養(yǎng)板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置30分鐘后除去，用滅菌三蒸水進(jìn)行沖洗后吸凈，于35°C 40°C下過夜烤干，備用，接種前用基培液再灌洗一遍；
然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層；
解剖鏡下去除胎鼠大腦皮層的皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，加完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液；
用200目不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，使細(xì)胞充分分離；
取IOPL細(xì)胞懸液與等量體積比為4%的臺(tái)盼藍(lán)混勻后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至4Χ 106/mL，接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板，每孔加50μ 細(xì)胞懸液,再分別加450μ 完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞接種密度為4 X 105/mL ；
培養(yǎng)板置恒溫培養(yǎng)箱中，以37°C的環(huán)境溫度、5%C02，飽和濕度條件下進(jìn)行開放培
養(yǎng);
24h后，全量換體積比為1%的胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉的無血清培養(yǎng)液；以后每隔2-3d進(jìn)行1/2量換液； 選取不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元在相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化并進(jìn)行顯微攝影；
步驟3)免疫組化染色培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光鏡下觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率并進(jìn)行顯微攝影。優(yōu)選的，所述步驟I)中，所述DMEM高糖培養(yǎng)基為13. 4g/L，NaHCO3為2. 2g/L，HEPES為3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存。優(yōu)選的，所述步驟2)中，培養(yǎng)板的處理中，過夜烤干的環(huán)境溫度是37°C。優(yōu)選的，所述步驟2)中，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的溫度下消化15min。優(yōu)選的，所述步驟2)中，是用200目的不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，使細(xì)胞充分分離。有益效果本發(fā)明的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，用無血清培養(yǎng)方法，建立了 Wistar胎鼠的皮層神經(jīng)元體外分散培養(yǎng)模型，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，為今后的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
準(zhǔn)備材料
DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、HEPES購自GIBCO公司；
多聚賴氨酸、胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基(ITS)購自Sigma公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE )、即用型HIGH — SABC免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。本發(fā)明的一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，具體步驟如下
步驟I)試劑的配制
DMEM高糖培養(yǎng)基13.4g/L、NaHCO; 2g/L、HEPES 3. 75g/L，依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存；
種植液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基90%，胎牛血清10% ；
飼養(yǎng)液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基99%，胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培
養(yǎng)基1%。步驟2)原代細(xì)胞培養(yǎng)
(I)培養(yǎng)板的處理24孔塑料培養(yǎng)板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置30分鐘后除去，滅菌三蒸水沖洗，吸凈，37°C過夜烤干，備用；接種前用培養(yǎng)基再灌洗一遍。
(2)取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層；
解剖鏡下去除皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置O. 125%胰蛋白酶溶液中37°C消化15min，吸除消化液，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，加完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液；
用200目不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，使細(xì)胞充分分離；
取ΙΟμ 細(xì)胞懸液與等量4%臺(tái)盼藍(lán)混勻后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至4XlOVmL,接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板，每孔加50μ 細(xì)胞懸液，再分別加450μ 完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞接種密度為4Χ 105/mL ；·
培養(yǎng)板置恒溫培養(yǎng)箱中37°C，5%C02，飽和濕度條件下進(jìn)行開放培養(yǎng)；
24h后，全量換1%ITS的無血清培養(yǎng)液；
以后每隔2-3d進(jìn)行1/2量換液；
選取不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元在相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化并進(jìn)行顯微攝影。步驟3)免疫組化染色
培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光景下觀察NSE表達(dá)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率并進(jìn)行顯微攝影。觀察
在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的皮層神經(jīng)元最初呈圓形，體積小，透亮，無突起。在培養(yǎng)12 24h后觀察可見大部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞多為圓形或橢圓形，偶見突起，周圍出現(xiàn)光暈。培養(yǎng)2-3d后可見，胞體增大，突起增多延長。培養(yǎng)6-7d后，神經(jīng)元細(xì)胞體大而飽滿，神經(jīng)細(xì)胞突起分支增多，以雙極神經(jīng)元居多。細(xì)胞突起增長，有的細(xì)胞突起相互連接，神經(jīng)細(xì)胞胞體呈圓形或橢圓形及多邊形不等。培養(yǎng)IOd后，神經(jīng)細(xì)胞開始減少并退化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡，突起萎縮減少。第7天的細(xì)胞，NSE免疫組化染色(DAB顯色)，胞漿和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的為陽性細(xì)胞。NSE是糖酵解過程中的一種二聚體同功酶，是神經(jīng)元分化成熟的特異性標(biāo)志酶，它分布在神經(jīng)元的胞體、軸突和樹突部分。使用NSE特異性抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，能夠鑒定體外無血清培養(yǎng)體系中的神經(jīng)元及其純度，而且能反映神經(jīng)元的生長發(fā)育情況。染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，以三個(gè)視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度,經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度達(dá)96. 7%左右。結(jié)論
以胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎大鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)，鏡下觀察結(jié)果顯示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。同時(shí)，用神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色來鑒定神經(jīng)元，以免疫化學(xué)染色，結(jié)果顯示神經(jīng)元胞體飽滿，胞漿內(nèi)顆粒明顯，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，而且純度達(dá)96. 7%左右。胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、O. 5mg/L亞硒酸鈉。胰島素可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的攝取，對(duì)大多數(shù)類型細(xì)胞的存活和生長有重要作用。鐵是一種營養(yǎng)細(xì)胞的必需的微量元素，為防止鐵離子的細(xì)胞毒性，通常鐵以化合物轉(zhuǎn)鐵蛋白的形式提供。硒是有助于水解過氧化物和超氧化物。結(jié)果表明ITS無血清培養(yǎng)基可以滿足胎鼠皮層神經(jīng)元生長發(fā)育需求的營養(yǎng)，且該方法相對(duì)于有血清培養(yǎng)法具有一定的優(yōu)越性，值得推廣應(yīng)用。上述實(shí)施例只是為了說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的是在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的 普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的實(shí)質(zhì)所作出的等效的變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，以胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基進(jìn)行胎鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)，用神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經(jīng)元。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基中含有O. 5g/L胰島素、O. 5g/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和O. 5mg/L亞硒酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，具體步驟如下 步驟I)試劑的配制 基培液取 DMEM 高糖培養(yǎng)基 10g/L 15g/L、NaHCO3 2g/L 3g/L、HEPES 3g/L 5g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 25°C 一 15°C保存； 種植液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基90%，胎牛血清10% ； 飼養(yǎng)液按體積比計(jì)，DMEM高糖培養(yǎng)基99%，胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉1% ； 步驟2)原代細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)板的處理24孔塑料培養(yǎng)板，每孔加入O. lmg/ml的多聚賴氨酸200μ ，靜置.30分鐘后除去，用滅菌三蒸水進(jìn)行沖洗后吸凈，于35°C 40°C下過夜烤干，備用，接種前用基培液再灌洗一遍； 然后，取E14-17d的Wistar大鼠，麻醉后于無菌條件下取出胎鼠，剝除胎膜放入裝有基培液的無菌皿中，取胎鼠大腦皮層； 解剖鏡下去除胎鼠大腦皮層的皮層外膜及血管組織，基培液中洗凈血污，剪碎，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，35°C 40°C下消化IOmin 20min，吸除消化液，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，加完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液； 用200目不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，使細(xì)胞充分分離； 取IOPL細(xì)胞懸液與等量體積比為4%的臺(tái)盼藍(lán)混勻后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至4XlOVmL,接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板，每孔加50μ 細(xì)胞懸液，再分別加450μ 完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞接種密度為4Χ 105/mL ； 培養(yǎng)板置恒溫培養(yǎng)箱中，以37°C的環(huán)境溫度、5%C02，飽和濕度條件下進(jìn)行開放培養(yǎng)；24h后，全量換體積比為1%的胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸鈉的無血清培養(yǎng)液；以后每隔2-3d進(jìn)行1/2量換液； 選取不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元在相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化并進(jìn)行顯微攝影； 步驟3)免疫組化染色 培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體免疫組化染色鑒定，光景下觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率并進(jìn)行顯微攝影。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，.其特征在于，所述步驟I)中，所述DMEM高糖培養(yǎng)基為13. 4g/L，NaHCO3為2. 2g/L，HEPES為3. 75g/L,依次溶于三蒸水，定容至1000ml，抽濾除菌，置于一 20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，培養(yǎng)板的處理中，過夜烤干的環(huán)境溫度是37°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，置于體積比為O. 125%的胰蛋白酶溶液中，是在37°C的溫度下消化15min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，是用200目的不銹鋼篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，使細(xì)胞充分分離?！?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法,以胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－亞硒酸鈉無血清培養(yǎng)基進(jìn)行胎鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)，用神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色，來鑒定胎鼠皮層神經(jīng)元。本發(fā)明的胎鼠皮層神經(jīng)元的原代無血清培養(yǎng)方法，用無血清培養(yǎng)方法，建立了Wistar胎鼠的皮層神經(jīng)元體外分散培養(yǎng)模型，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，為今后的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/0793GK102839151SQ20111016444
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者葉蓓 申請(qǐng)人:蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院