專利名稱：用于多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法、系統(tǒng)和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的一些實施方式涉及用于治療哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病的細胞類型的誘導(dǎo)和應(yīng)用，但不限于此。
背景技術(shù)：
某些神經(jīng)系統(tǒng)損傷、影響中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病、以及神經(jīng)退行性疾病的特征在于特定細胞的損失、或存在神經(jīng)細胞的功能異常，這些會引起患者出現(xiàn)不同的神經(jīng)病學體征和癥狀以及可能不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能喪失。僅作為ー個實例，一些患有中風、脊椎損傷或其它神經(jīng)損傷和變性的患者經(jīng)受功能細胞類型的損失，或如帕金森氏癥 和阿爾茨海默氏癥這樣的反過來導(dǎo)致系統(tǒng)功能的喪失或異常的神經(jīng)病癥。目前，用于治療和修復(fù)這樣的細胞和系統(tǒng)功能的治療選擇是有限的。因此，仍然需要方法、系統(tǒng)和組合物來促進其它治療，包括致力于替換缺失或受損的神經(jīng)系統(tǒng)細胞、組織和功能的療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一些實施方式包括通過微小RNA(microRNA)的應(yīng)用而在體外或體內(nèi)選擇性地誘導(dǎo)多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法、系統(tǒng)和組合物，包括但不限于miRNA-124、miRNA-137和/或miRNA_9*，這些miRNA的表達產(chǎn)物，和含有這些miRNA的功能元件(functional elements)的分子和組合物,但本發(fā)明并不局限于本文所描述的那些實施方式，且不存在具體放棄。本發(fā)明的一些實施方式也包含這樣的誘導(dǎo)細胞的治療給予和應(yīng)用以治療哺乳動物損傷和疾病，包括但不限于，可能在其它方面導(dǎo)致細胞或系統(tǒng)功能降低的神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病。


現(xiàn)在將參照附圖僅通過舉例方式描述本發(fā)明的一些實施方式，對其它實施方式不存在具體的放棄，在附圖中圖I顯示用生長因子處理或用對照miRNA和miRAN_124或miRNA_137轉(zhuǎn)染3、5和9天的MSC的亮場圖像(明場像，bright fieldimage)。圖2是顯示miRAN-124、miRNA-137和miRNA_9*在MSC中誘導(dǎo)神經(jīng)元標記的數(shù)據(jù)表不。圖3顯示用測試的miRNA轉(zhuǎn)染細胞或由DMEM處理后的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。圖4顯示用對照miRNA、miRAN-124或miRNA-137轉(zhuǎn)染(動物)脂肪和臍帶來源的MSC(cord derived MSC)的結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明的一些實施方式包括通過微小RNA(microRNA) ( “miRNA”或“miR”)的應(yīng)用而在體外或體內(nèi)選擇性誘導(dǎo)多能性基質(zhì)細胞(“MSC”)的神經(jīng)元分化的方法、系統(tǒng)和組合物，包括但不限于，miRNA-124和/或miRNA-137、和/或miRNA_9*，這些miRNA的表達產(chǎn)物，以及含有這些miRNA的功能元件的分子和組合物，但本發(fā)明并不局限于本文所描述的那些實施方式，且對任何實施方式不存在具體放棄。本發(fā)明的一些實施方式也包含這樣的經(jīng)誘導(dǎo)的細胞用于治療治療哺乳動物損傷和疾病的治療給藥和用途，包括但不限于，可能在其它方面導(dǎo)致細胞或系統(tǒng)功能降低的神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病。在一些實施方式中，分化的MSC的這種誘導(dǎo)，和/或所產(chǎn)生的細胞，可以通過給予所述患者治療有效量的感興趣的miRNA、或由這樣的miRNA誘導(dǎo)的分化MSC，而用于治療患者體內(nèi)的細胞、組織或器官損傷。我們已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)某些miRNA能夠誘導(dǎo)受試者中MSC的長期神經(jīng)元分化用于基于細胞療法的用途，這些受試者呈現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷和 疾病，包括但不限于，神經(jīng)退行性紊亂和脊髄損傷。這樣的受試者可以包括哺乳動物，包括但不限于人。因此，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的miRNA以及所產(chǎn)生的經(jīng)誘導(dǎo)的MSC的新應(yīng)用，除了其它可能 的用途，它們能夠減少或減輕哺乳動物中某些神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的影響。本發(fā)明的一些實施方式包括通過miRNA-124、miRNA-137、和/或miRNA_9*的應(yīng)用和表達而誘導(dǎo)MSC的神經(jīng)元分化的方法、系統(tǒng)、和/或組合物，但不限于此。MSC是典型地以非常低的濃度(10000個有核細胞中約I個)典型地存在于成年骨髄中的中胚層來源的細胞(mesoderm-derived cells)。MSC能夠分化產(chǎn)生細胞，如骨髓基質(zhì)、血管、脂肪、骨骼和軟骨。這些細胞可能也具有分化為神經(jīng)元\或神經(jīng)膠質(zhì)-樣細胞的潛能，這取決于環(huán)境信號。此外，這些細胞可能被進ー步誘導(dǎo)表達或通過與生長因子和激素的不同組合進行培養(yǎng)而保持特定神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)表型。在實驗動物模型中以及最近在試驗性臨床實驗中，MSC已經(jīng)顯示出在各種神經(jīng)疾病和功能異常中發(fā)揮治療作用。它們的作用主要歸因于免疫抑制和神經(jīng)保護功能。在實驗性自身免疫性腦炎(“EAE”)中，多發(fā)性硬化癥(“MS”)的動物模型，用骨髓來源的MSC處理小鼠引起了疾病表現(xiàn)的顯著抑制。ー些研究證明，除了自身免疫調(diào)節(jié)降低之外，這些細胞的神經(jīng)分化還在諸如缺血性腦的各種實例中增強了它們的治療作用。在我們的研究中，我們檢測了三種神經(jīng)元-相關(guān)性miRNA,即miRNA-124、miRNA-137和miRNA_9*對人MSC分化的影響。這些miRNA沒有在MSC中正常表達。我們發(fā)現(xiàn)miRNA-124、miRNA-137或miRNA-9*的表達誘導(dǎo)了 MSC的神經(jīng)元分化，正如細胞形態(tài)學以及β III-微管蛋白和ΜΑΡ2的表達提高所指示的。miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*引起酪氨酸羥化酶的增加，這暗示著MSC向多巴胺能表型的分化。miRNA124前體(前體miRNA124，pre-miRNA124)的靶標之ー是抑制大量神經(jīng)元基因的轉(zhuǎn)錄因子REST。我們的結(jié)果顯示神經(jīng)元-相關(guān)性miRNA可以誘導(dǎo)MSC的長期神經(jīng)元分化，用于在神經(jīng)退行性和神經(jīng)炎性紊亂以及脊髄損傷中基于細胞療法的用途。與通過生長因子處理而誘導(dǎo)的瞬時分化(transientdifferentiation)相比，miRNA的用途優(yōu)于現(xiàn)有方法的ー個優(yōu)點在于能夠在將引起長期神經(jīng)元分化的MSC中穩(wěn)定地表達miRNA前體。就這點而論，容易獲得患者自己的骨髓來源的MSC、以及大量富集和擴增MSC的可行性表明這樣的細胞的神經(jīng)元分化能夠用作自體神經(jīng)干細胞，其可用于治療大量與神經(jīng)元缺乏或受損有關(guān)的獲得性或先天性神經(jīng)性紊亂。僅作為ー個實例，MSC能夠由通過吸脂去除的脂肪進行制備，以及由臍帶血(cord blood)或胎盤進行制備，但不限于此。MSC降低的免疫原性可以促進現(xiàn)成的(off the shelf)或者來自匹配或部分錯配家族成員的異體神經(jīng)元的使用，而用于治療(僅作為非限制性實例)由必需酶(essential enzymes)或其它必需產(chǎn)物(essential products)的先天性缺失而引起的病癥。(本發(fā)明)不限于僅在本文中明確公開的實施方式，且不存在對任何實施方式的具體放棄，本發(fā)明的一些實施方式包括1.MSC的神經(jīng)元分化，其是通過培養(yǎng)或其它暴露于miRNA，包括但不限于，miRNA124 和/或 miRNA137、和 / 或 miRNA-9*。2.用這樣的miRNA對MSC的轉(zhuǎn)染；3.將在體外誘導(dǎo)神經(jīng) 元分化的MSC給予患有神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的受試者；和/或4.將用這樣的miRNA轉(zhuǎn)染的MSC給予患有神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的受試者。在一些實施方式中，隨著MSC向神經(jīng)元的可再現(xiàn)的轉(zhuǎn)分化(reproducibletransdifferentiation), MSC的治療用途能夠在體外或體內(nèi)獲得和擴展,從而包括(僅作為某些實例)對腦血管疾病、脊髄損傷的治療，對神經(jīng)退行性紊亂如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(“ALS”)、多發(fā)性硬化癥(“MS”)以及相關(guān)的運動神經(jīng)元疾病的治療，但不限于此。正在進行的臨床研究已經(jīng)表明MSC鞘內(nèi)注射和靜脈輸注能夠部分地改善MS患者中疾病的臨床表現(xiàn)，且使ALS患者達到較輕程度。這樣的臨床研究提供了以下證據(jù)，即MSC鞘內(nèi)注射和靜脈輸注都是安全的過程，因為被處理的患者中沒有一個產(chǎn)生任何嚴重的副作用。因此，用MSC的細胞療法預(yù)示性地代表用于治療大量神經(jīng)紊亂的ー個重要途徑，其中，特別地，MSC能夠被誘導(dǎo)為神經(jīng)元或少突細胞和/或能夠誘導(dǎo)局部存在的干細胞神經(jīng)發(fā)生的分泌因子。實施例提供本發(fā)明的一些實施方式的以下實施例，但并不是要將本發(fā)明限于僅在此處描述的那些實施方式且不存在對任何實施方式的具體放棄。微小RNA微小RNA(“miRNA”)代表一類內(nèi)源性、小的(作為ー些非限制性的實例，19_23個核苷酸)非編碼RNA，其通過RNA干擾(“RNAi”)途徑起作用而影響轉(zhuǎn)錄后基因沉默。miRNA基于互補祀向特定基因的mRNA,且介導(dǎo)mRNA斷裂(完全互補(perfect complementarity))或翻譯阻抑(translation repression)(部分互補)。miRNA已經(jīng)被證實在發(fā)育中起重要作用，且可以作為用于建立或保持決定細胞命運的特定表達譜的基本的基因調(diào)控元件而起作用。MSC的操縱性(manipulating)神經(jīng)元分化可能涉及在分化過程中協(xié)調(diào)基因表達程序的調(diào)控途徑。分化通常需要細胞的mRNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的改變。ー類基因調(diào)控分子是微小RNA, —個小的(小分子的)RNA的亞類,其被認為使用RNA干擾途徑中的元件(elements)在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)蛋白編碼基因的表達。miRNA可能在細胞分化中起重要作用，因為它們被預(yù)測同時單獨調(diào)控數(shù)百個靶基因。方法為了確定miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*對MSC分化的影響，我們在4_12段(passages)中采用這些細胞的三種不同制劑。將MSC細胞涂布于DMEM+10% FCS上24hr，然后用所述三種miRNA的成熟序列的雙鏈RNA寡核苷酸和陰性對照寡核苷酸轉(zhuǎn)染。所使用的miRNA如下
Dharmacon 模擬產(chǎn)物MI0000443/MIMAT0000422-人選定的前體/成熟成熟hsa-miR-124[MIMAT0000422] 前體hsa-miR-124-1[MI0000443]有機體人成熟序列UAAGGCACGCGGUGAAUGCC(SEQ ID NO. I)MI0000454/MIMAT0000429-人選定的前體/成熟成熟hsa-miR-137[MIMAT0000429]前體hsa-miR-137[MI0000454]有機體人成熟序列UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG(SEQ ID NO. 2)miRNA 9* 序列AUAAAGCUAGAUAACCGAAA⑶(SEQ ID NO. 3)miRNA 9 模擬UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA(SEQ ID NO. 4)3天后，將細胞轉(zhuǎn)移到補充有B27的神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基(NeurobasalMedium，NB)中。細胞形態(tài)每24小時監(jiān)測一次，且在轉(zhuǎn)染5、7和9天后通過免疫熒光染色、蛋白質(zhì)印跡分析或?qū)崟rPCR對神經(jīng)元標記進行分析。作為神經(jīng)元分化誘導(dǎo)的陽性對照，我們使用通過Shh、FGF8和bFGF的組合刺激的細胞。結(jié)果miRNA-124、miRNA-137、和miRNA-9*促講MSC的神經(jīng)元分化。圖I是代表產(chǎn)生相似結(jié)果的六個單獨實驗的圖示。如圖I所顯示的，用miRNA-137、miRNA-124或miRNA-9*對細胞的轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染72小時后就已經(jīng)減少細胞增殖且誘導(dǎo)細胞中形態(tài)分化。用miRNA-137對MSC的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了快速和穩(wěn)健的形態(tài)變化，且所述細胞獲得了有致密細胞體(compactcellbodies)的典型神經(jīng)元表型和有靜脈曲張的長突起(elongatedprocesses)。miRNA-124-轉(zhuǎn)染的細胞在細胞增殖以及隨后產(chǎn)生若干細胞類型方面顯示出強烈的下降；有長突起的伸長細胞(elongated cell)、具有多個較短突起的小細胞和扁平的星狀細胞。對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞與對照未處理的細胞類似。有趣地，miRNA-137的作用比GF的作用更快速且更強烈。約90% miRNA-137轉(zhuǎn)染的細胞顯示神經(jīng)元形態(tài)。
miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*增加MSC中神經(jīng)元標記的表汰。為了講ー步檢測miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*對神經(jīng)元分化的影響，我們檢測了神經(jīng)干細胞標記、巢蛋白(nestin)、星形細胞標記GFAP和神經(jīng)元標記β III-微管蛋白以及酪氨酸羥化酶的表達。細胞用合適的miRNA轉(zhuǎn)染或用DMEM或神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基+Β27處理。5天后，巢蛋白mRNA的表達使用實時PCR測定，且巢蛋白、GFAP、β III-微管蛋白和酪氨酸羥化酶的表達在處理9天后通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測。結(jié)果表示為產(chǎn)生相似結(jié)果的五個不同實驗。圖2顯示轉(zhuǎn)染5天后，如實時PCR測定的，巢蛋白mRNA大量増加。相反，用不同的miRNA轉(zhuǎn)染9天后，我們發(fā)現(xiàn)β III-微管蛋白的表達增加，然而沒有觀察到巢蛋白或GFAP的表達。此外，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-137和miRNA-9*誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶表達的大量増加，然而在miRNA-124轉(zhuǎn)染的細胞中觀察到較小的増加。在對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞中，所有這些標記物的表達不存在的或者可忽略不計。 miR-9*誘導(dǎo)MSC中多巴胺能標記物，酪氡酸羥化酶。圖3顯示MSC用合話的miRNA轉(zhuǎn)染或用DMEM處理后的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。9天后，通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測酪氨酸羥化酶表達。結(jié)果表不為產(chǎn)生相似結(jié)果的五個不同實驗。在MSC中,miRNA-9*誘導(dǎo)多巴胺能標記物，酪氨酸羥化酶。我們的結(jié)果證實miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*誘導(dǎo)MSC的神經(jīng)元分化，盡管在我們的測試模型中分別以不同程度(進行誘導(dǎo))。miRNA-137誘導(dǎo)更快速更穩(wěn)健的效果，產(chǎn)生神經(jīng)元細胞的同質(zhì)群體(同源群體，homogenous population)。酪氨酸輕化酶在這些細胞中高水平的表達暗示這些細胞顯示多巴胺能表型。與對照miRNA-處理的細胞相比，miRNA-124也誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，如通過高水平的β III-微管蛋白所測定的。在我們的研究中，這種處理引起了表達較低水平酪氨酸羥化酶的細胞的混合群體。沒有處理誘導(dǎo)星形細胞分化，如通過GFAP表達缺失所測定的。此外，處理5天后，兩種miRNA都引起了巢蛋白表達的大量瞬時增加，表明神經(jīng)干細胞樣或神經(jīng)元祖細胞樣細胞的生成。MSC向NSC或NPC樣細胞的受控分化可被進ー步利用，以通過使用特定轉(zhuǎn)錄因子或生長因子的特定組合將這些細胞分化為不同的神經(jīng)元細胞系或具有不同表型的神經(jīng)元。miRNA-124和miRNA-9*已經(jīng)被報道參與神經(jīng)元分化和神經(jīng)突生長。相似地,有一項報道證實了 miRNA137對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞和NSC的神經(jīng)元分化的影響。然而，沒有報道m(xù)iRNA對MSC的神經(jīng)元分化的作用，且沒有示出miRNA124和miRNA137對具有特定表型的神經(jīng)元生成的影響。此外，沒有報道這些miRNA中的任ー個可誘導(dǎo)具有NSC/NPC表型的細胞。miRNA—124矛ロmiRNA—137誘導(dǎo)月旨肪矛ロ擠帶來源的MSC(cord derivedMSC)中ネ申經(jīng)兀分化。脂肪和臍帶來源的MSC用對照miRNA、miRNA-124和miRNA-137轉(zhuǎn)染，這類似于骨髓MSC (圖 4)。脂肪來源的MSC的制備脂肪來源的MSC通過從大腿或腹壁吸脂而獲得。將100-200ml吸出物在可從脂肪細胞和碎片中分離MSC的特別設(shè)計的Cytori分離器中處理。所述細胞被進ー步處理和保持，如對骨髓來源的MSC描述的那樣。人臍帶MSC的制備新鮮的人臍帶在出生后獲得(經(jīng)父母同意)且在4°C在DMEM中收集。去除臍帶血管且將間充質(zhì)組織(華通氏膠(Wharton’s jelly))切成小塊。250Xg離心5min后，所述組織用無血清DMEM清洗，在37°C用膠原酶處理18h，隨后在37°C用2. 5 %胰蛋白酶消化30min。所述經(jīng)分離的MSC在與對骨髓來源的MSC所描述的相似條件下進ー步分散和保持。12天后,提取mRNA,且使用實時PCR測定b3_微管蛋白和看家基因(house keepinggene)S12的水平。我們的結(jié)果(圖4)證實miRNA-124和miRNA-137不僅在骨髓來源的MSC中還在脂肪組織和臍帶血來源的細胞中誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。神經(jīng)元標記β III微管蛋白在miRNA處理后在這些細胞中被誘導(dǎo)。這些細胞來源中的每ー個都具有自己的優(yōu)點。骨髓來源的MSC已得到很好的特征描述，且已經(jīng)成功地使用超過20年而沒有致癌性。脂肪來源的MSC被較少的描述，但是能被大量獲得，且臍帶血細胞能夠以非侵入方式容易地獲得，它們不需要捐贈者和患者之間完全的基因相容性(genetic compatibility),因而更容易得到。含有miRNA前體和⑶NF的質(zhì)粒的構(gòu)津。由于⑶NF已牽涉多巴胺能神經(jīng)元的存活，因而我們構(gòu)建了在分開的啟動子下與⑶NF —起共表達miRNA-124前體或miRNA-137前體的質(zhì)粒。關(guān)于分步克隆(stepby step cloning) GDNF 于 premir 載體(來自SystemBiosciences 的 CD_511_1 或 PCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP)，描述了測序步驟和克隆所述miRNA前體GDNF載體的程序以及克隆miRNA的程序，但并不限于僅在此處描述的實施方式，且不存在對任何實施方式的具體放棄。人膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(“⑶NF”)模板的cDNA從Origene獲得。為了將⑶NF克隆至premir 124和137載體(System Biosciences)中，針對GDNF ORF的具有Xhol和Sall限制性酶消化位點的引物設(shè)計如下正向cacc ctcgag (Xhol) atg aag tta tgg gat gtc gtg get gtc tgc (SEQIDNO. 5)反向aaa gtcgac (Sail) tea gat aca tcc aca cct ttt age gga atg (SEQIDN0. 6)PCR之后，清洗⑶NF DNA產(chǎn)物，然后用Xhol和Sall消化，且再次清洗DNA，產(chǎn)生可立即進行克隆的⑶NF的DNA。通過使用以下引物將Xhol限制性位點添加到premir 124和premirl37載體中正向 gac gcc acc atg gag age ctc gag (Xhol) age ggc ctg ccc gcc (bEQIDNO. 7)反向 ggc ggg cag gcc get ctc gag (Xhol) get ctc cat ggt ggc gtc (SEQIDNO. 8)GFP基因通過使用限制性酶Xhol和Sall而從premir 124和137載體中去除，然后清洗所述載體。⑶NF與premir 124和137載體的連接(ligation)。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入One ShotTop 10化學感受態(tài)細胞中。用小量抽提法(mini prep)處理后,通過培養(yǎng)克隆而選擇具有premir 124 和 137 的質(zhì)粒。 通過使用Xhol和Sall消化質(zhì)粒從而檢測⑶NF的插入。然后測序所述質(zhì)粒。miR-124和137的序列以及premir載體的骨架(backbone)MiR-124
GAACAAAGAGCCTTTGGAAGACGTCGCTGTTATCTCATTGTCTGTGTGATTGGGGGAGCTGCGGCGGGGAGGATGCTGTGGTCCCTTCCTCCGGCGTTCCCCACCCCCATCCCTCTCCCCGCTGTCAGTGCGCACGCACACGCGCCGCTTTTTATTTCTTTTTCCTGGTTTTCTTATTCCATCTTCTACCCACCCCTCTTCCTTTCTTTCACCTTTCCTTCCTTCCTTCCTCCTTTCCTTCCTCAGGAGAAAGGCCTCTCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCTGGCTGAGCACCGTGGGTCGGCGAGGGCCCGCCAAGGAAGGAGCGACCGACCGAGCCAGGCGCCCTCCGCAGACCTCCGCGCAGCGGCCGCGGGCGCGAGGGGAGGGGTCTGGAGCTCCCTCCGGCTGCCTGTCCCGCACCGGAGCCCGTGGGGTGGGGAGGTGTGCAGCCTGTGACAGACAGGGGCTTAGAGATGC(SEQ ID NO. 9)MiR-137 CAGCACTCTTCTGTGTTAAGTATTTGATTTTGTGATTTGTCTTTCAGAATTGGAAATAGAGCGGCCATTTGGATTTGGGCAGGAAGCAGCCGAGCACAGCTTTGGATCCTTCTTTAGGGAAATCGAGTTATGGATTTATGGTCCCGGTCAAGCTCAGCCCATCCCCAGGCAGGGGCGGGCTCAGCGAGCAGCAAGAGTTCTGGTGGCGGCGGCGGCGGCAGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGTAGCAGCGGCAGCGGCAGCTTGGTCCTCTGACTCTCTTCGGTGACGGGTATTCTTGGGTGGATAATACGGATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGGAGAGTACCAGCGGCAGGGGGGCAGCGGCCGCCCTCCCCAGCCCACCAGCTGGCCACTAAACGCCCGTGGTTGCCAAGGTAGCACTTTCTTGTTCTTTTCATTTCCTCGGGTGTTTTCGCACTGGTTCCACCGGAAAGGCTGTGCGCTGCGCCTCTGGTGACCAGGACTGGA(SEQ ID NO. 10)所附為骨架載體(⑶-511_1)的序列位點(LOCUS)CD511B_l_pCDH_CMV_7544bp ds-DNA 環(huán)形 16-DEC-2008 :定義登錄號版本來源有機體
注釋注釋ApEinfo :甲基化I特征位點/ 修飾(Qualifiers)尚未歸類的特征(misc_feature)2315. · 2764/標記=EFl啟動子/ApEinfo_fwd 顏色=藍綠色/ApEinfo_rev 顏色=綠色尚未歸類的特征 2765. . 2789/標記=EFl啟動子(I)/ApEinfo_ 標記=EFl 啟動子/ApEinfo_fwd 顏色=藍綠色/ApEinfo_rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2874…3629/ 標記=copGFP/ApEinfo_fwd 顏色=#OOffOO
/ApEinfo—rev 顏色=綠色
尚未歸類的特征3639. . 4229/ 標記=WPRE/ApEinfo—fwd 顏色=藍綠色/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2790. . 2860/標記=EFl啟動子(2)/ApEinfo—標記=EFl 啟動子/ApEinfo—fwd 顏色=藍綠色/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2765. · 2789/ 標記=EFfwd 引物/ApEinfo—fwd 顏色=#ff80ff/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征1922. . 2183/ 標記=CMV/ApEinfo—fwd 顏色=#ff80ff/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2272. . 2314/ 標記=MCS/ApEinfo_fwd 顏色=#80ff00/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2205. . 2271/ 標記=CMV ⑴/ApEinfo—標記=CMV/ApEinfo—fwd 顏色=#ff80ff/ApEinfo—rev 顏色=綠色尚未歸類的特征2184. . 2204/標記=DAB 90正向引物/ApEinfo—fwd 顏色=藍綠色/ApEinfo—rev 顏色=綠色源I acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagcao_l acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact3d1 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
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7441 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt7501 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctg(SEQ ID NO. 11)我們發(fā)現(xiàn)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC分泌⑶NF且表達各個miRNA。因此，由分化的多巴胺能神經(jīng)元分泌的⑶NF預(yù)期提供存活信號至分化的細胞和內(nèi)源性多巴胺能神經(jīng)元?？烧T導(dǎo)的miRNA的構(gòu)律。棺入的MSC已被報道遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受損組織且發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)的作用。具體地，在帕金森病動物模型中，植入的MSC已顯示為移植(engraft)入受損的紋狀體(striatum)中。在一些實施方式中，但不限于此,可誘導(dǎo)的miRNA前體表達載體可被使用，其在所需的時間點將允許特定miRNA前體表達的誘導(dǎo)。因此，MSC將被特定miRNA前體轉(zhuǎn)染，且其將在受損紋狀體中MSC移植之前或隨后的不同時間點被誘導(dǎo)表達。對于這樣的研究，我們已采用可誘導(dǎo)的miRNA和染色(living color),并采用使用Tet-on系統(tǒng)(Clontech)的突光蛋白報告子(reporter)。這個系統(tǒng)通過啟動子的添加而允許特定miRNA的誘導(dǎo)(僅作為實例，可通過強カ霉素(doxycyline))，以及其中生成miRNA的細胞的鑒定。概括地說，我們已經(jīng)證實了 miRNA124、miRNA137和miRNA-9*誘導(dǎo)MSC轉(zhuǎn)分化為NSC/NPC以及具有特定神經(jīng)元表型(miRNA137)的神經(jīng)元的能力。其它的神經(jīng)元miRNA，如miRNA-9和miR218，也可影響MSC的轉(zhuǎn)分化和誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。與通過生長因子處理而誘導(dǎo)的瞬時分化相比，使用miRNA124優(yōu)于現(xiàn)有方法的一個優(yōu)點是能夠在MSC中穩(wěn)定地表達miRNA前體，其將引起長期的神經(jīng)元分化。我們的研究顯示神經(jīng)元-相關(guān)性miRNA可被用于誘導(dǎo)MSC的長期神經(jīng)元分化，用于在神經(jīng)退行性紊亂和脊髄損傷中的基于細胞的療法中，僅作為ー些實例，其可由以下所顯示I.通過微小 RNA (miRNA-124, miRNA-137 和 miRNA-9*)的 MSC 的神經(jīng)元分化；2.通過miRNA-137、miRNA-124和miRNA-9*的MSC的特異性多巴胺能分化；以及3.通過微小RNA誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)干細胞樣或神經(jīng)祖細胞樣細胞的瞬時分化。用miRNA轉(zhuǎn)染提供了機會性窗ロ，其中，細胞能夠被分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同細胞系(神經(jīng)元、星形細胞和少突細胞)或者使用轉(zhuǎn)錄因子或生長因子的特定組合而分化為特定神經(jīng)元表型。所述窗ロ能夠由miRNA表達的水平或轉(zhuǎn)染后特定時間點所控制。miRNA轉(zhuǎn)分化MSC為未決定分化方向的祖細胞(uncommittedprogenitor cells)和不同神經(jīng)元細胞亞群的能力使利用這些細胞治療多種神經(jīng)疾病成為可能，包括脊髄和周圍神經(jīng)損傷、出血或阻塞性病變(obstructive lesion, “CVA”)引起的對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害或者外傷性中樞或周圍神經(jīng)損傷。此外，轉(zhuǎn)分化的MSC可以被用于由特發(fā)性自身免疫性疾病(“EAE”)引起的神經(jīng)退行性疾病或者如帕金森氏癥或阿爾茨海默病的疾病或者如ALS的病因不明的疾病中。此外，通過轉(zhuǎn)分化的MSC對神經(jīng)功能的改善也可以被用于藥物引起的神經(jīng)元損傷和/或毒性所造成的各種退行性疾病中。因此，在我們的研究中，miRNA-124、miRNA-137和miRNA-9*促進MSC的神經(jīng)分化，伴隨形態(tài)學變化和表型標記的表達?！嵤┓绞降恼T導(dǎo)miRNA可按照良好的醫(yī)療實踐給予和服用，需考慮達到靶 MSC預(yù)期效果所使用的技術(shù)、個體患者的臨床情況、給予的部位和方法、給予的時間安排、患者年齡、性別、體重和醫(yī)生所知的其它因素。用于本文目的的“藥學有效量”因此可由本領(lǐng)域中所知的這些考慮因素所決定。該量必須是對實現(xiàn)改善而有效的，包括但不限于，在體內(nèi)和/或體外MSC的所需分化、降低損害和損傷、或者癥狀的改善或消除、以及作為適當措施被所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇的其它指標。本發(fā)明的實施方式可以為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病擴大治療窗ロ，且能夠用于治療每年在美國患這樣的損傷和疾病的龐大患者人群。因此，在一些實施方式中，通過包含本發(fā)明實施方式的誘導(dǎo)miRNA的選擇性應(yīng)用，本發(fā)明包含預(yù)防、控制、或減輕哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病的新方法，包括但不限干，腦損傷、神經(jīng)變性、或脊髄損傷。按照ー些實施方式，通過ー種或多種這樣的miRNA的使用和/或給予而在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)靶細胞中的分化，用于限制這樣的損傷或疾病影響的治療中，可以實現(xiàn)這樣的干預(yù)治療，但不限于此。因此，一些實施方式包括通過轉(zhuǎn)分化MSC的選擇性應(yīng)用和/或誘導(dǎo)而預(yù)防、控制、或減輕哺乳動物損傷(包括但不限于腦損傷)的新組合物和方法，不局限于所述主題，也不存在對主題的具體放棄。 本申請通過作者、引用、和/或通過專利號可參考各種出版物，包括但不限于，文章、報告(presentations)、和美國專利。姆ー篇任何這樣的文獻的公開內(nèi)容均以其整體并入本申請中供參考。盡管已結(jié)合上述優(yōu)選和可替換實施方式對本發(fā)明進行具體示出和描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的是，在不背離如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本文描述的本發(fā)明的實施方式的各種替換方案可用于本發(fā)明的實施中。所附權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，并且落在這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的方法和設(shè)備及其等同物也尤其所涵蓋。本發(fā)明的描述應(yīng)當被理解為包括此處所描述的元素的所有新穎性和非顯而易見的組合，且對這些元素的任何新穎性和非顯而易見組合，權(quán)利要求可存在于本申請或以后的申請中。上述實施方式是例示性的,且沒有單ー的特征或元素對于本申請或以后的申請中可被要求的所有可能組合是必不可少的。在權(quán)利要求限定其等同物的“ー種”或“第一”元件時，這樣的權(quán)利要求應(yīng)當理解為包括一種或多種這樣的元素的合并，既不要求也不排除兩種或多種這樣的元素。
權(quán)利要求
1.ー種刺激來自哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法，包括以下步驟 提供包括微小RNA-124的組合物，以及 向哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞群給予藥學有效量的所述組合物以在所述群中刺激神經(jīng)元分化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
3.ー種刺激來自哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法，包括以下步驟 提供包括微小RNA-137的組合物，以及 向哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞群給予藥學有效量的所述組合物以在所述群中刺激神經(jīng)元分化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
5.ー種刺激來自哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法，包括以下步驟 提供包括微小RNA-9*的組合物，以及 向哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞群給予藥學有效量的所述組合物以在所述群中刺激神經(jīng)元分化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
7.微小RNA-124在用于刺激哺乳動物的多能性基質(zhì)干細胞的神經(jīng)元分化的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述哺乳動物是人。
9.微小RNA-137在用于刺激哺乳動物的間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)元分化的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中，所述哺乳動物是人。
11.微小RNA-9*在用于刺激哺乳動物的多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的藥物中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中，所述哺乳動物是人。
13.一種治療患有神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟 通過在體外使多能性基質(zhì)細胞暴露于單獨的或者以任意組合的微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*，從而刺激所述細胞的神經(jīng)元分化；以及將這樣的神經(jīng)元分化的細胞給予所述哺乳動物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
15.一種治療患有神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟 在體外用單獨的或者以任意組合的微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*轉(zhuǎn)染多能性基質(zhì)細胞；以及 將這樣的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞給予所述哺乳動物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
17.一種治療患有神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的哺乳動物的方法，包括以下步驟 用包括一種或多種編碼單獨的或者以任意組合的微小RNA-124、微小RNA-137或微小RNA-9*的核苷酸的載體來轉(zhuǎn)染多能性基質(zhì)細胞，其中，這樣的核苷酸在所述載體中的表達可由啟動子誘導(dǎo)， 將這樣的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞給予所述哺乳動物，以及 通過將所述啟動子給予所述哺乳動物，在所述哺乳動物中誘導(dǎo)所述核苷酸的表達以產(chǎn)生微小RNA-124、微小RNA-137、或微小RNA-9*。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明的一些實施方式包括通過微小RNA的應(yīng)用而在體外或體內(nèi)選擇性誘導(dǎo)多能性基質(zhì)細胞的神經(jīng)元分化的方法、系統(tǒng)和組合物，該微小RNA包括但不限于miRNA-124、miRNA-137和/或miRNA-9*，這些miRNA的表達產(chǎn)物、以及含有這些miRNA的功能元件的分子和組合物。本發(fā)明的一些實施方式還包括這樣的誘導(dǎo)的細胞用于治療哺乳動物損傷和疾病的治療給藥和用途，包括但不限于，可能在其它方面導(dǎo)致細胞或系統(tǒng)功能降低的神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病。
文檔編號C12N5/00GK102666855SQ201080035364
公開日2012年9月12日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者查亞·布魯?shù)? 西蒙·斯拉文 申請人:腦干生物技術(shù)有限公司