專利名稱：一種高效提取熱帶植物dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA的提取方法，具體涉及一種高效提取熱帶植物DNA的方法。
背景技術(shù)：
高質(zhì)量DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要保證。迄今為止，人們提出了諸多提取DNA的方法，譬如基于化學(xué)溶液提取的方法和運(yùn)用過柱吸附提取的方法(安澤偉等， 2009)。然而，不同的材料會對提取DNA的方法有特異性的要求，特別是對于某些頑拗性和稀有的材料更是如此(Hasan, et al, 2008; Rogers and Bendich, 1985; Tang, et al, 2009)。熱帶植物富含的纖維素、多糖、多酚、蛋白、脂肪等物質(zhì)使得細(xì)胞難以裂解，核酸難以分離和純化，因此增加了 DNA提取的難度(Wang，et al, 2008)。目前，雖然研究者報道了一些從熱帶植物組織中提取DNA的方法，比如從熱帶植物塊根中提取DNA的方法(Siarma， et al, 2008)，以及提取香蕉樹(Shankar, et al, 2011)、橡膠樹(An and Huang, 2005)、 椰樹(Angeles，et al. , 200 等熱帶植物DNA的特異性方法，但是此類方法具有明顯的局限性。因此，亟待開發(fā)一種能夠適用于熱帶植物DNA提取的通用型方法以適應(yīng)諸如大規(guī)模研究的需求。申請?zhí)枮?00910095919. 2的專利，提出了一種采用CTAB的方法同時提取山藥等植物中DNA和RNA的方法，該方法的試劑中含有β -巰基乙醇等有害物質(zhì)，同時還采用了氯仿和酚等有毒有害物質(zhì)進(jìn)行了除雜，其對環(huán)境危害大，提取過程安全性較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效提取熱帶植物DNA的方法，該方法通用、高效、安全和簡便。本發(fā)明的上述目的是通過如下步驟來實現(xiàn)的一種高效提取熱帶植物DNA的方法，取熱帶植物的葉片、根、莖或果實，粉碎，置于無菌容器中，加入裂解緩沖液，混勻；調(diào)節(jié)溫度為60-70°C進(jìn)行水浴反應(yīng)20-40 min，取反應(yīng)后混合溶液離心，取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，離心，棄去上清液，取沉淀物，采用有機(jī)溶劑洗滌2-5次，每次洗滌后，離心，棄去上清液，將離心后的沉淀干燥即獲得提取的熱帶植物的DNA。本發(fā)明所述的裂解緩沖液含以下組分質(zhì)量百分含量為m的溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)、200mM Tris、2M NaCl、質(zhì)量百分含量為21的聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、25mM 乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、質(zhì)量百分含量為1%的十二烷基肌氨酸鈉(LSS)、20mM硼砂， 該裂解緩沖液的PH值為8. 0 ；所述的裂解緩沖液使用前先預(yù)熱至60-70°C。與傳統(tǒng)CTAB方法所使用的裂解緩沖液相比，本發(fā)明裂解緩沖液含有更多的NaCl、 EDTA和Tris成分。這些成分使得裂解緩沖液中具有豐富的Na+和Cl_，從而為組織裂解提供了高鹽條件，同時使反應(yīng)體系保持穩(wěn)定的酸堿度。本發(fā)明裂解緩沖液不含巰基乙醇， 而代以PVPP這種安全和易用的成分以維持反應(yīng)體系的還原環(huán)境，防止多酚氧化成難以去除的多醌類物質(zhì)。此外，本發(fā)明裂解緩沖液中加入了 1%的LSS。LSS是一種陰性去污劑，具有促進(jìn)細(xì)胞裂解的作用。不僅如此，還在本發(fā)明裂解緩沖液中加入了 20 mM的硼砂以結(jié)合多糖和多酚類物質(zhì)，促進(jìn)非核酸類組分的沉淀。本發(fā)明所述的熱帶植物葉片、根、莖或果實和裂解緩沖液的質(zhì)量體積比為 lg:5-20mL。本發(fā)明在水浴反應(yīng)的過程中每隔3-5 min將反應(yīng)液混勻一次。本發(fā)明在采用異丙醇沉淀DNA時，異丙醇的用量為混合溶液離心后上清液總體積的 0. 6-0. 8 倍。本發(fā)明洗滌時的有機(jī)溶劑為乙醇，乙醇的體積百分含量為70-99. 5%，乙醇洗滌前先預(yù)冷至3-5 °C。本發(fā)明提取的熱帶植物的DNA保存于含有RNase A的TE緩沖液中在_20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明含有RNase A的TE緩沖液中TE緩沖液的組成為pH值為8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值為8. 0的1 mM EDTA，含有RNase A的TE緩沖液中RNase A的質(zhì)量濃度為 10 Pg/mL。本發(fā)明離心時離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000-15000 rpm，溫度為3_5°C，離心時間為1-10 min。本發(fā)明所述的熱帶植物優(yōu)選為金錢菊、大王椰子樹、番木瓜樹、無花果樹、海馬齒、 木薯、橡膠樹、煙草、假檳榔樹或香蕉樹。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)不需要使用諸如β-巰基乙醇、氯仿和酚一類的有毒有害成分，從而使得本方法具有安全性和友好性的特點；
(2)利用本方法從熱帶植物組織提取獲得的DNA量顯著高于普通提取方法提取獲得的 DNA量，且DNA純度符合下游應(yīng)用的要求；
(3)經(jīng)PCR和酶切實驗證明最終獲得的DNA能夠達(dá)到一般分子生物學(xué)研究的要求；
(4)本發(fā)明提取方法具有通用、高效、安全和簡便的特點。


圖1是本發(fā)明實施例中提取的10種熱帶植物葉片總DNA的電泳結(jié)果，其中為比較產(chǎn)率，在用50 PL含有RNase A的TE緩沖液溶解DNA以后，各樣品點樣孔都只加入10 μ 的DNA溶液，Μ, DNA marker (Trans 15k, Trans) ； 1，金錢菊；2，大王椰子樹；3，番木瓜樹； 4，無花果樹；5，海馬齒；6，木薯；7，橡膠樹；8，煙草；9，假檳榔樹；10，香蕉樹；
圖2是本發(fā)明實施例中提取的10種熱帶植物RBCL基因PCR電泳結(jié)果，其中各樣品點樣孔分別加入IOPL的PCR溶液，M，DNA marker (DL2000, Takara) ；1，金錢菊；2，大王椰子樹；3，番木瓜樹；4，無花果樹；5，海馬齒；6，木薯；7，橡膠樹；8，煙草；9，假檳榔樹；10，香蕉樹；
圖3是本發(fā)明實施例中提取方法提取的6種熱帶植物EcoR I限制性酶切電泳結(jié)果，M， DNA marker (Trans 15k, Trans)，1，香蕉樹；2，木薯；3，橡膠樹；4，番木瓜；5，大王椰子樹； 6，假檳榔樹；
圖4是本發(fā)明提取方法與CTAB提取方法獲得的木薯和橡膠總DNA的電泳圖，其中為比較產(chǎn)率，在用50 μ 含有RNase A的TE緩沖液溶解DNA以后，各樣品點樣孔都只加入10 PL的DNA溶液。M，DNA marker (Trans 15k, Trans) ；Dd,本發(fā)明方法；Dc，本發(fā)明方法加入氯仿異戊醇(24:1)沉淀步驟；Dp，本發(fā)明方法加入酚氯仿異戊醇(2524:1)沉淀步驟；CTAB, CTAB提取DNA方法(Sambrook and Russell, 2001)。Μ. esculenta,ifM ； H. brasiliensis，檢膠樹。
具體實施例方式本發(fā)明裂解緩沖液成分 溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)(優(yōu)選自Amresco，美國)；200 mM Tris (優(yōu)選自北京索萊寶科技有限公司，中國)；2 M NaCl (優(yōu)選自廣州光華化工有限公司，中國)；洲聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)(優(yōu)選自北京索萊寶科技有限公司， 中國)；25 mM乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)(優(yōu)選自北京索萊寶科技有限公司，中國)；1% 十二烷基肌氨酸鈉(LSS)(優(yōu)選自北京索萊寶科技有限公司，中國)；20mM硼砂(優(yōu)選自廣州化學(xué)試劑廠，中國)，該緩沖液的酸堿度(PH)= 8.0。本發(fā)明采用的氯仿和異戊醇優(yōu)選購自廣州化學(xué)試劑廠；本發(fā)明的異丙醇優(yōu)選購自廣州化學(xué)試劑廠；本發(fā)明中的TE緩沖液組分為10 mM Tris-HCI (pH 8.0),1 mM EDTA CpH 8.0)，本發(fā)明中采用的RNase A，其濃度為10 mg/mL，優(yōu)選購自大連寶生物工程有限公
司ο本發(fā)明中采用的縮略詞語為
CTAB 為溴化十六烷基三甲基銨(Cetyltrimethylammonium bromide)、EDTA 為乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)、LSS 為十二燒基肌氨酸鈉(N-lauroyl sarcosine sodium)、PVPP 為聚乙烯聚吡咯烷 M (Polyvinylpolypyrrolidone)> PCR ^IK'pfBIIIJ^ixlSi(Polymerase chain reaction),,實施例1
本實施提供的金錢菊的DNA的提取過程如下 (1)以金錢菊葉片為原料，采集同一種植物的嫩葉、成熟葉片和老葉后混合成一個樣品，立即保存于液氮中，之后，用無菌的研磨棒在盛有液氮的研缽中將葉片研磨成粉末，每個樣品取約100 mg的組織粉末用于提取DNA，余下的組織粉末保存在-80°C冰箱備用；
(2)在65°C預(yù)熱本發(fā)明裂解緩沖液；
(3)在2.0mL無菌EP管內(nèi)加入約100 mg研磨好的粉末，立即加入1. 0 mL本發(fā)明裂解緩沖液，混勻；
(4)將上述裂解緩沖液在65°C水浴30min,中途每隔約5 min混勻一次；
(5)將水浴后混合溶液置于離心機(jī)中離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為14000rpm，溫度為4°C，離心 10 min ；
(6)取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，再離心，異丙醇的添加量為上清液總體積的2/3， 離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為14000 rpm，溫度為4°C，離心^iiin ；
(7)棄上清液，加入1mL體積百分含量為75%的乙醇(4 °C預(yù)冷)，洗滌沉淀，14000 rpm, 40C，離心2 min,棄上清液，保留沉淀物；
(8)在沉淀物中加入1mL體積百分含量為99. 5%的乙醇(4°C預(yù)冷)，洗滌沉淀，14000 rpm, 40C，離心2 min,棄上清液，室溫干燥DNA沉淀；(9)加入50 μ L含有RNase A的TE緩沖液，溶解DNA沉淀，同時消化除去DNA沉淀中含有的RNA，最終獲得純凈的金錢菊葉片DNA溶液，該DNA為金錢菊葉片的總DNA，在_20°C 長期保存?zhèn)溆?，其中含有RNase A的TE緩沖液中TE緩沖液的組分為pH值為8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值為8. 0的1 mM EDTA，含有RNase A的TE緩沖液中RNase A的質(zhì)量濃度為 10 Pg/mL。實施例2
本實施例以大王椰子樹的葉片為原料，采集同一種植物的嫩葉、成熟葉片和老葉后混合成一個樣品，立即保存于液氮中。之后，用無菌的研磨棒在盛有液氮的研缽中將葉片研磨成粉末。每個樣品取約100 mg的組織粉末用于提取DNA。余下的組織粉末保存在_80°C冰箱備用。提取步驟如下
(1)在60°C預(yù)熱本發(fā)明裂解緩沖液，
(2)將約1g新鮮植物葉片置于盛有液氮的研缽中迅速研磨至粉末狀；
(3)在2.0mL無菌EP管內(nèi)加入約100 mg研磨好的粉末，馬上加入2. 0 mL本發(fā)明裂解緩沖液，混勻；
(4)60°C水浴40min,中途每隔約5 min混勻一次；
(5)15000 rpm，3°C，離心 10 min ；
(6)取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，離心；異丙醇的添加量為上清液總體積的0.6倍， 離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為15000 rpm，溫度為3°C，離心^iiin ；
(6)棄上清液，在DNA沉淀中加入1mL體積百分含量為75%的乙醇(4 °C預(yù)冷)，洗滌沉淀，15000 rpm, 3°C，離心2min,棄上清液；
(7)在DNA沉淀中加入1mL體積百分含量為80%的乙醇(4°C預(yù)冷)，洗滌沉淀，15000 rpm, 30C，離心2min，棄去上清液，室溫干燥DNA沉淀；
(8)加入50μ L含有RNase A的TE緩沖液，溶解DNA沉淀，同時消化除去DNA沉淀中含有的RNA，最終獲得純凈的大王椰子葉片總DNA溶液，在-20°C長期保存?zhèn)溆?，其中含?RNase A的TE緩沖液中TE緩沖液的組分為pH值為8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值為8. 0 的1 mM EDTA，含有RNase A的TE緩沖液中RNase A的質(zhì)量濃度為10 Pg/mL。實施例3
本實施例以番木瓜樹的葉片為原料，采集同一種植物的嫩葉、成熟葉片和老葉后混合成一個樣品，立即保存于液氮中。之后，用無菌的研磨棒在盛有液氮的研缽中將葉片研磨成粉末。每個樣品取約100 mg的組織粉末用于提取DNA。余下的組織粉末保存在_80°C冰箱 提取步驟如下
(1)在70°C預(yù)熱本發(fā)明裂解緩沖液；
(2)將約1g新鮮植物葉片置于盛有液氮的研缽中迅速研磨至粉末狀；
(3)在2.0mL無菌EP管內(nèi)加入約100 mg研磨好的粉末，馬上加入1. 5 mL本發(fā)明裂解緩沖液，混勻；
(4)70°C水浴20min,中途每隔約5 min混勻一次；
(5)離心，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000rpm，溫度為5°C，離心時間為10 min。
(6)取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，離心；異丙醇的添加量為上清液總體積的0. 8 倍，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000 rpm，溫度為5°C，離心!Min ；
(7)加入1 mL體積百分含量為80%的乙醇(4 °C預(yù)冷)，洗滌沉淀，離心時離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000 rpm，溫度為5°C，離心時間為3 min，棄上清液；
(8)加入1mL體積百分含量為95%的乙醇(4°C預(yù)冷)，洗滌沉淀，離心時離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000 rpm，溫度為5°C，離心時間為3 min，棄上清液，重復(fù)上述步驟1_3次，室溫干燥 DNA沉淀；
(9)加入50yL含有RNaseA的TE緩沖液，溶解DNA沉淀，同時消化除去DNA沉淀中含有的RNA，最終獲得純凈的番木瓜葉片總DNA溶液，在_20°C長期保存?zhèn)溆?，其中含有RNase A的TE緩沖液中TE緩沖液的組分為pH值為8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值為8. 0的1 mM EDTA，含有RNase A的TE緩沖液中RNase A的質(zhì)量濃度為10 Pg/mL。實施例4
與實施例1不同的是采用的原料為無花果樹的葉片，提取的DNA為大王椰子的DNA。實施例5
與實施例1不同的是采用的原料為海馬齒的葉片，提取的DNA為番木瓜的DNA。實施例6
與實施例1不同的是采用的原料為木薯的葉片，提取的DNA為無花果的DNA。實施例7
與實施例1不同的是采用的原料為橡膠樹的葉片，提取的DNA為海馬齒的DNA。實施例8
與實施例1不同的是采用的原料為煙草的葉片，提取的DNA為煙草的DNA。實施例9
與實施例1不同的是采用的原料為假檳榔樹的葉片，提取的DNA為假檳榔的DNA。實施例10
與實施例1不同的是采用的原料為香蕉樹的葉片，提取的DNA為香蕉的DNA。上述實施例1 一 10提取的10種常見熱帶植物的DNA的產(chǎn)率和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)和酶切實驗如下所示
一、本發(fā)明方法提取10中熱帶植物葉片DNA的質(zhì)量比較
采用PGENERAL T6分光光度計(北京普析通用儀器有限公司，中國)分別測量DNA溶液在230 nm、260 nm、280 nm的光吸收峰度值。通過計算A260/280比值和A260/230比值分別獲得DNA溶液中蛋白、多糖和多酚等雜質(zhì)的污染度，從而估測DNA純度。用公式“DNA樣品的濃度(μ g/μ L)= ο擬60 χ稀釋倍數(shù)χ 50”計算dna溶液的濃度。為比較不同方法提取DNA的產(chǎn)率，每個樣品在電泳時都取10 μ L的DNA溶液。1% 瓊脂糖(Invitrogen，California，美國)凝膠，1 X TAE (上海生物工程公司)，GoldView (北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)染色，120V，30 min電泳，檢測DNA。利用UVP紫外成像系統(tǒng) (EC3 system,美國)掃描成像。采用以上方法提取十種常見熱帶植物的葉片作為材料金錢菊(CbreoAsh tinctorial ^ 大王 子(Moystonea regia ) Λ 番 7^ /R (Carica papaya ) Λ $ # 果{Ficus carica )、海馬齒{Sesuvium portulacastrum)Λ7^W (,Maninot esculenta )^^1 W Qieveabrasiliensis)> jfllfi iNicotiana tabacum)、殷猿貓(Arckontopkoenix alexandrae)以及香蕉(ifesa nana)。從下表1可以看出，本發(fā)明提取方法能夠從上述樣品中成功提取出DNA， 等體積上樣凝膠電泳結(jié)果表明本發(fā)明提取方法從各種材料提取DNA的得率存在明顯的差別(如附圖1所示)，光度測量結(jié)果表明提取獲得的DNA純度符合要求(A^K)/280 ^ 1. 8)(表 1)。通過光度測量結(jié)果計算獲得的DNA溶液濃度和產(chǎn)率吻合電泳顯示的結(jié)果(圖1，表1)。
表1本發(fā)明方法提取10中熱帶植物葉片DNA的質(zhì)量比較
權(quán)利要求
1.一種高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是取熱帶植物的葉片、根、莖或果實， 粉碎，置于無菌容器中，加入裂解緩沖液，混勻；調(diào)節(jié)溫度為60-70°C進(jìn)行水浴反應(yīng)20-40 min,取反應(yīng)后混合溶液離心，取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，離心，棄去上清液，取沉淀物， 采用有機(jī)溶劑洗滌2-5次，每次洗滌后，離心，棄去上清液，將離心后的沉淀干燥即獲得提取的熱帶植物的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是所述的裂解緩沖液的組成含有質(zhì)量百分含量為洲的溴化十六烷基三甲基銨、200mM Tris、2M NaCl、質(zhì)量百分含量為21的聚乙烯聚吡咯烷酮、25mM乙二胺四乙酸二鈉、質(zhì)量百分含量為1%的十二烷基肌氨酸鈉、20mM硼砂，該裂解緩沖液的pH值為8. 0，所述的裂解緩沖液使用前先預(yù)熱至 60-70 O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是所述的熱帶植物葉片、根、莖或果實和裂解緩沖液的質(zhì)量體積比為lg:5-20mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是在水浴反應(yīng)的過程中每隔3-5 min將反應(yīng)液混勻一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是采用異丙醇沉淀 DNA時，異丙醇的用量為混合溶液離心后上清液總體積的0. 6-0. 8倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是洗滌時的有機(jī)溶劑為乙醇，乙醇的體積百分含量為70-99. 5%，乙醇洗滌前先預(yù)冷至3-5°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是提取的熱帶植物的DNA保存于含有RNase A的TE緩沖液中在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是含有RNaseA的 TE緩沖液中TE緩沖液的組成為pH值為8. 0的10 mM Tris-HCI和pH值為8. 0的1 mM EDTA，含有RNase A的TE緩沖液中RNase A的質(zhì)量濃度為10 Pg/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是離心時離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000-15000 rpm，溫度為3_5°C，離心時間為1-10 min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效提取熱帶植物DNA的方法，其特征是所述的熱帶植物為金錢菊、大王椰子樹、番木瓜樹、無花果樹、海馬齒、木薯、橡膠樹、煙草、假檳榔樹或香蕉樹。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效提取熱帶植物DNA的方法，取熱帶植物的葉片、根、莖或果實，粉碎，置于無菌容器中，加入本發(fā)明的裂解緩沖液，混勻；調(diào)節(jié)溫度為60-70℃進(jìn)行水浴反應(yīng)20-40min，取反應(yīng)后混合溶液離心，取上清液，加入異丙醇沉淀DNA，離心，棄去上清液，取沉淀物，采用有機(jī)溶劑洗滌2-5次，每次洗滌后，離心，棄去上清液，將離心后的沉淀干燥即獲得提取的熱帶植物的總DNA。該提取方法不需要使用諸如β-巰基乙醇、氯仿和酚一類的有毒有害成分，從而使得本方法具有安全性和友好性的特點；并且該提取方法還具有通用、高效、安全和簡便的特點。
文檔編號C12N15/10GK102250881SQ201110169049
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者孔華, 王旭初, 郭安平, 郭運(yùn)玲, 黃啟星 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所