專利名稱：Tl固定化酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品和化工領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及針對TL脂肪酶的固定化酶方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酶作為一種生物催化劑，具有底物選擇性，反應(yīng)條件溫和，污染小等優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)工業(yè)催化劑帶來的反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)副產(chǎn)物污染環(huán)境等缺點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用潛力。尋找催化活力高，反應(yīng)條件溫和的酶，或是對現(xiàn)有酶進(jìn)行改造使其更適應(yīng)生產(chǎn)應(yīng)用，是未來酶工程在工業(yè)中應(yīng)用的主要發(fā)展方向。固定化酶技術(shù)是將游離的酶通過物理或者化學(xué)手段將其束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，使其仍然能進(jìn)行特有的催化反應(yīng)并能回收重復(fù)使用的一種技術(shù)。由于上述優(yōu)點(diǎn)，使得很 多科研工作者展開了對固定化酶的細(xì)致研究。在1967年，固定化酶首次被應(yīng)用在拆分氨基酸工業(yè)中。近年來隨著有機(jī)化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、材料科學(xué)等的發(fā)展，固定化酶技術(shù)取得了長足的進(jìn)步。脂肪酶是催化油脂發(fā)生水解、酯交換、酯化反應(yīng)的一類酶，它能夠特異性地在油水界面上發(fā)揮催化活性，在食品、造紙、皮革、洗滌劑、制藥等工業(yè)上有著巨大的應(yīng)用。然而，天然酶穩(wěn)定性差，反應(yīng)后難以純化，不能重復(fù)利用，不僅降低了酶的使用效率，提高了生產(chǎn)成本，而且難以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化操作，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。在此背景下，固定化酶技術(shù)成為解決上述生產(chǎn)瓶頸的一種有效途徑。TL脂肪酶是在嗜熱絲孢菌(Thermomyces Lanuginosus)中發(fā)現(xiàn)的一類脂肪酶,其主要用于油脂的水解、三甘油酯的改性及單甘脂和甘二酯的生產(chǎn)。液體的TL脂肪酶主要用于水解反應(yīng)。固定化的TL酶用來催化酯交換反應(yīng)，其優(yōu)點(diǎn)是可以重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。W08906278A1描述了一種固定化TL酶的方法，通過培養(yǎng)腐殖霉屬的真菌或經(jīng)過基因改造的腐殖霉屬真菌獲得含有脂肪酶的發(fā)酵液，以酚醛型或者丙烯酸型樹脂為固定化載體，固定化過程為將一定量的一定PH值酶液加入處理好的弱堿性大孔型離子交換樹脂中，在室溫下震蕩8h，然后水洗，室溫真空干燥，得產(chǎn)品。EP1239045A1描述了一種固定化TL酶的方法，具體為將脂肪酶粉末溶解在磷酸緩沖液中，加入乙醇和聚丙烯型樹脂ACXUREL MP1001，室溫下震蕩過夜。通過過濾收集固定化酶，用緩沖液清洗，室溫下進(jìn)行干燥。然而，到目前為止，市場上現(xiàn)有的TL固定化酶并不能滿足生產(chǎn)要求。其催化的酯交換反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中存在大量的皂，大量浪費(fèi)原料，增加成本，分析其原因可能是不同類型的載體與酶結(jié)合的過程中存在一些無法克服的技術(shù)問題造成或者載體與酶固定過程中與反應(yīng)介質(zhì)的沖突。因此目前固定化的TL需要大量的油脂洗脫，造成大量的原料浪費(fèi)。同時為下游的分離提純帶來了巨大的困難，限制了其在油脂工業(yè)上的應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出新的固定化TL酶方法，使得TL酶保持較高活力且在反應(yīng)中不產(chǎn)生皂，從而擴(kuò)大TL脂肪酶在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍，并克服了現(xiàn)有固定化TL酶在生產(chǎn)中產(chǎn)生皂的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是提供一種新的TL酶固定化方法。本發(fā)明的另一主要目的是提供一種固定化的TL酶。本發(fā)明的目的還在于提供本發(fā)明的固定化TL酶在工業(yè)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種制備固定化脂肪酶的方法，所述方法包括步驟a)對載體進(jìn)行前處理，所述載體選自離子交換樹脂或骨架為聚苯乙烯的大孔吸附樹脂；
b)提供脂肪酶，并任選在其中加入酶蛋白交聯(lián)劑；c)將步驟a)中所得的經(jīng)前處理的載體與步驟b)中所提供的脂肪酶接觸，使所述脂肪酶固定于所述經(jīng)前處理的載體；d)干燥步驟c)中所得的固定有脂肪酶的載體，以獲得所述固定化脂肪酶。在一個優(yōu)選例中，所述聚苯乙烯的大孔吸附樹脂可為聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的大孔吸附樹脂。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述載體選自極性大孔吸附樹脂、非極性大孔吸附樹脂、陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述非極性大孔吸附樹脂選自D101、HPD100A、Amberl iteXAD-4、HPD100, HPD300、HPD700、X_5、XAD-4 或 HP20 ；所述極性大孔吸附樹脂選自D201、LSA-10或Amberlite XAD7HP ；所述陽離子交換樹脂選自D113、DOOl或Ambetlite IRC50 ；所述陰離子交換樹脂選自D301或Styrene-DVB 201X2。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述大孔吸附樹脂的前處理是如下進(jìn)行的將載體置于水中浸泡去雜，然后用溶劑浸泡I 24h以去除有機(jī)雜質(zhì)和不溶物，再用水洗去所述溶劑，其中所述溶劑為乙醇、正己烷、丙酮或石油醚；所述離子交換樹脂的前處理是如下進(jìn)行的用O. 05mol/L lmol/L的堿液和酸液交替浸泡或沖洗所述樹脂1-5次，然后僅用O. 05mol/L lmol/L的堿液再次浸泡或沖洗樹脂I次，再用水洗至水呈中性。在一個優(yōu)選例中，所述水為去離子水、蒸餾水或雙蒸水。在另一個優(yōu)選例中，大孔吸附樹脂的前處理中所用的乙醇是濃度范圍為100% -50% (V/V)的乙醇。在另一個優(yōu)選例中，大孔吸附樹脂的前處理中所述溶劑的添加量范圍為樹脂體積的O. 5-10倍，優(yōu)選1-5倍。在另一個優(yōu)選例中，離子交換樹脂的前處理中的所述酸選自HC1、H2SO4或H3PO4,所述堿選自NaOH、氨水或Κ0Η。在另一個優(yōu)選例中，每次堿液和酸液浸泡或沖洗的時間為1-24小時。在另一個優(yōu)選例中，所述離子交換樹脂的前處理方法為以樹脂與堿液或酸液
I: I I : 5、優(yōu)選I : I. 5 I : 3、更優(yōu)選I : 2的重量體積比(W/V)浸泡或沖洗所述樹脂，順序?yàn)橄葔A后酸，重復(fù)數(shù)次后最后一遍用堿液處理，然后用水洗至水呈中性。在另一個優(yōu)選例中，將經(jīng)過處理的載體浸泡在去離子水(或蒸餾水、雙蒸水)中保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，步驟b)中所提供的脂肪酶選自嗜熱絲孢菌(Thermomyces Lanuginosus)的發(fā)酵產(chǎn)物；通過基因工程或蛋白質(zhì)工程改造而得的脂肪酶；或市售的脂肪酶。在一個優(yōu)選例中，所述基因工程或蛋白質(zhì)工程改造而得的脂肪酶是化學(xué)修飾的酶、蛋白質(zhì)工程的突變體或基因工程菌產(chǎn)生的酶。在另一個優(yōu)選例中，所述市售的脂肪酶優(yōu)選為丹麥諾維信公司的LipozymeTLIOOLo·在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述脂肪酶未經(jīng)任何前處理而用于步驟c)中。在另一個優(yōu)選例中，可對所述脂肪酶進(jìn)行稀釋。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述酶蛋白交聯(lián)劑選自戊二醛溶液、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚乙烯胺、明膠或精胺。在一個優(yōu)選例中，所述酶蛋白交聯(lián)劑的用量為酶液體積的O. 001-0. I (V/V)，優(yōu)選戊二醛的用量為每ml酶液中加入O. 01 O. Iml的I %戊二醛溶液或等比例其它濃度戊二
醛溶液。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，步驟c)中，所述經(jīng)處理的載體與脂肪酶以g/ml計的重量/體積比為25 : I I : 25。在一個優(yōu)選例中，所述比例優(yōu)選為10 : I I : 10，更優(yōu)選I : I。在另一個優(yōu)選例中，使用水浴搖床、氣浴搖床、攪拌機(jī)或磁力攪拌器使所述經(jīng)處理的載體與脂肪酶接觸和固定。在另一個優(yōu)選例中，通過取上清測剩余蛋白含量來判斷酶蛋白的固定程度，所述剩余蛋白含量的測定采用選自下組的方法進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)法、lorry法、雙縮脲法、BCA法。在另一個優(yōu)選例中，在剩余蛋白含量低于O. lmg/ml O. 5ml/ml時,終止固定步驟。在另一個優(yōu)選例中，所述干燥是通過選自下組的方法進(jìn)行的冷凍干燥、真空干燥、流化床干燥和室溫干燥。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種固定化脂肪酶或其包裝產(chǎn)品，所述的固定化脂肪酶是通過本發(fā)明的方法制備的。在一個優(yōu)選例中，所述包裝產(chǎn)品還包括包裝物，優(yōu)選容器或包裝袋。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種進(jìn)行酯交換、酯化、酸解或醇解反應(yīng)的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的固定化脂肪酶作為催化劑。在本發(fā)明的另一方面中，還提供了本發(fā)明的固定化脂肪酶在酯交換、酯化、酸解或醇解反應(yīng)中的用途。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種TL固定化酶方法，進(jìn)一步說是一種在反應(yīng)中不產(chǎn)生或極少產(chǎn)生皂的固定化酶方法。所述方法主要包括如下三個步驟載體的選擇和前處理步驟、酶固定化步驟、以及干燥步驟。采用該方法制得的固定化脂肪酶在催化反應(yīng)中活力較高，且不會產(chǎn)生大量的皂，具有極大應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。I、載體的詵擇及前處理本發(fā)明中采用了現(xiàn)有技術(shù)中未曾使用過的聚苯乙烯型大孔吸附樹脂作為載體、或經(jīng)處理的離子交換樹脂為載體，出乎意料地使得以其固定化的脂肪酶具有高活性和穩(wěn)定性，且在催化酯交換反應(yīng)過程中不產(chǎn)生皂，操作簡單，大大降低了油脂加工的成本。
如本文所用，術(shù)語“大孔吸附樹脂”是指一類不含交換基團(tuán)且具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，其具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過物理吸附從溶液中有選擇地吸附有機(jī)物。術(shù)語“聚苯乙烯型大孔吸附樹脂”是指以聚苯乙烯為骨架的大孔吸附樹脂。應(yīng)理解該術(shù)語包括聚苯乙烯型大孔吸附樹脂的各種亞型，例如聚苯乙烯-二乙烯苯骨架的樹脂?？捎糜诒景l(fā)明中的聚苯乙烯型大孔吸附樹脂可包括(但不限于)非極性的D101、HPD100A, AmberliteXAD-4、HPD100, HPD300、HPD700、X_5、XAD-4 或 HP20 ；極性的 D201、LSA-10, Amberlite XAD7HP等。在本發(fā)明中優(yōu)選采用非極性的聚苯乙烯型大孔吸附樹脂，更優(yōu)選 D101、HPD100A、X-5。如本文所用，術(shù)語“離子交換樹脂”是指帶有官能團(tuán)(有交換離子的活性基團(tuán))、具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、不溶性的高分子化合物，常用作離子交換層析介質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明的離子交換樹脂包括(但不限于)陰離子交換樹脂，如D301、Styrene-DVB201X2等;陽離子交換樹脂，如D113、D001、Ambetlite IRC50等。在本發(fā)明中優(yōu)選采用陰離子交換樹脂。本發(fā)明的載體還可為基于以上或其它樹脂的改性或改良樹脂，例如通過重氮化或氨基化改性的樹脂或采用其它化學(xué)改性手段經(jīng)功能化處理的樹脂。可參考例如徐敬亮等，氨基功能載體固定化酶研究進(jìn)展化工進(jìn)展201029(3) :494-496。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可用于本發(fā)明中的聚苯乙烯型大孔吸附樹脂和離子交換樹脂除了以上用商品名所限定的具體產(chǎn)品以外，還包括任何具有其它商品名的市售樹脂產(chǎn)品或通過自行制備或加工得到的樹脂，只要它們具有與所述具體產(chǎn)品相同或相似的結(jié)構(gòu)和吸附或交換性能。本發(fā)明中所用的這些載體(尤其是聚苯乙烯型大孔樹脂)并不是現(xiàn)有商業(yè)化固定化酶中所用載體，并且本發(fā)明載體的處理方法也與常規(guī)處理方法存在差異。大孔吸附樹脂的處理方法將載體置于去離子水(也可用蒸餾水，雙蒸水)中浸泡去雜，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┙軮 24h，去除有機(jī)雜質(zhì)和其它不溶物，再用去離子水(或蒸餾水、雙蒸水)洗去溶劑，置于去離子水(或蒸餾水、雙蒸水)中備用。其中，所用溶劑可為乙醇，優(yōu)選濃度范圍為100%-50% (v/v)的乙醇；或正己烷、丙酮、石油醚等有機(jī)溶劑。所述溶劑的添加量范圍為樹脂體積的O. 5-10倍，優(yōu)選1-5倍。離子交換樹脂用低濃度(O. 05mol/L-lmol/L)的堿液(例如NaOH、KOH或氨水)和酸液(例如HCl、H2SO4或H3PO4)(酸液和堿液的濃度均為O. 05mol/L-lmol/L)交替處理(處理方法可為例如先用堿液浸泡樹脂I 3h (優(yōu)選2h)，然后洗至中性，再用酸浸泡或沖洗I 3h (優(yōu)選2h)后，洗至中性，重復(fù)該過程1-5次)樹脂1-5次，最后一次處理僅用堿液，每次處理時間為1-24小時，處理完畢后用水(優(yōu)選去離子水、蒸餾水或雙蒸水)洗至水呈中性，再浸泡在水(優(yōu)選去離子水、蒸餾水或雙蒸水)中保存?zhèn)溆谩＝?jīng)上述處理的離子交換樹脂內(nèi)部的PH保持為堿性，更有利于酶發(fā)揮其活性。2、酶固定化稱取一定量處理過的載體于容器中，放入一定體積的TL酶液，于15 35°C (優(yōu)選15 25°C，更優(yōu)選室溫)水浴搖床(可以采用氣浴搖床，機(jī)械攪拌器和磁力攪拌器，渦流攪拌器的形式)中150rpm(10-200rpm)固定。固定完成后，取出吸附有酶的樹脂吸去殘留液體。脂肪酶的來源可以為嗜熱絲孢菌在合適的培養(yǎng)條件下發(fā)酵而得，也可以是通過基 因工程，蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代生物學(xué)手段改造而得，包括化學(xué)修飾的酶，蛋白質(zhì)工程的突變體或基因工程菌產(chǎn)生的酶。脂肪酶的來源還可以為商業(yè)上可獲得的，如丹麥諾維信公司的Lipozyme TLlOOL0用于固定化過程中的酶液可無需經(jīng)過任何分離、純化等改變其原有組成或環(huán)境的前處理。也可對酶液進(jìn)行稀釋或pH調(diào)節(jié)等處理，以適于反應(yīng)。用于本發(fā)明的TL酶液中可包括(但不限于)I.通過培養(yǎng)嗜熱絲孢菌(Thermomyces Lanuginosus)獲得的發(fā)酵液(例如參見文獻(xiàn) Charlotte Pinholt, Mathias Fano, Charlotte ffiberg, Influence of glycosylationon the adsorption of Thermomyces lanuginosus lipase to hydrophobic andhydrophilicsurfaces, European Journal of Pharmaceutical Sciences 40(2010)273-281)；2.通過培養(yǎng)從嗜熱絲孢菌得到脂肪酶基因的，用基因改性米曲霉經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)獲得的脂肪酶酶液(例如參見同上文獻(xiàn)Charlotte Pinholt, Mathias Fano, Charlotteffiberg, European Journal of Pharmaceutical Sciences 40(2010) :273-281)。3.市售的商品TL液體脂肪酶，例如諾維信公司的Lipozyme TLlOOL04.通過在如上所述的脂肪酶液或酶粉的溶液中加入酸堿調(diào)節(jié)TL酶液到合適的pH值和/或加入水(如蒸餾水、去離子水或雙蒸水)調(diào)節(jié)到合適的蛋白濃度的酶液(例如參見文獻(xiàn) Daniel Otzen, Differential adsorption of variants of the Thermomyceslanuginosus lipase on a hydrophobic surface suggests a role for localflexibility, biointerfaces 2008 64 :223-228)。在本發(fā)明中也可在酶液中加入一定量的酶蛋白交聯(lián)劑(即能起到交聯(lián)酶蛋白作用的物質(zhì))，優(yōu)選所述酶蛋白交聯(lián)劑具有羥基或氨基，例如戊二醛溶液、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚乙烯胺、明膠或精胺等。所述酶蛋白交聯(lián)劑的用量為每毫升酶液中添加0.0 10%(v/v)。例如戊二醛的用量為每毫升酶液中加入0.01 0. Iml的I %戊二醛溶液，也可采用等比例的其它濃度戊二醛溶液。處理過的樹脂載體與TL酶液的重量(g)/體積(ml)比可為25 I I : 25，優(yōu)選10 : I I : 10，更優(yōu)選I : I (可根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整比例)。
固定的方式，可采用水浴搖床或氣浴搖床，攪拌機(jī)或磁力攪拌器等常規(guī)方式。固定期間，可每隔一定時間(例如5min Ih)取上清測剩余蛋白含量來判斷酶蛋白的吸附/結(jié)合程度。剩余蛋白含量的測定可采用考馬斯亮藍(lán)法、lorry法、雙縮脲法、BCA法等常規(guī)蛋白質(zhì)定量檢測方法進(jìn)行。通常，在剩余蛋白含量低于O. lmg/ml O. 5ml/ml時，終止固定步驟。當(dāng)然，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)具體的需要(如質(zhì)量控制要求等)對固定程度進(jìn)行調(diào)整和控制。本發(fā)明的固定化酶方法無需 對酶進(jìn)行復(fù)雜的前處理(如分離、純化等)，且出乎意料地獲得了在固定化酶使用過程中顯著降低皂的產(chǎn)生、甚至不產(chǎn)生皂的技術(shù)效果。3、干燥在固定化步驟進(jìn)完成以后，通過干燥步驟去除體系中多余的水分，干燥的方式可選自冷凍干燥、真空干燥、流化床干燥和室溫干燥等常規(guī)干燥方法。例如，冷凍干燥可在LABCNC0的冷凍干燥機(jī)(廠商美國Labcnco公司，型號freezone)上進(jìn)行，參數(shù)可設(shè)置為(以下是各個步驟參數(shù)，這幾個步驟構(gòu)成一個降溫過程)-200C 降溫速率 I. 5°C /min, 2h (O. 5_5h)，-IO0C降溫速率 I. 5°C /min,6h(3-10h)5°C降溫速率 I. Ol0C /min, 15h, (10_24h)20°C降溫速率 I. 16°C /min，20h(10-24h)真空干燥可在例如Binder真空干燥箱(廠商賓德亞太(香港)有限公司型號VD23)中進(jìn)行，參數(shù)設(shè)置為在真空度為6mbar下，40°C干燥48h (24_60h)。流化床干燥可在流化床中進(jìn)行(例如德國格拉特公司，型號midi glatt),參數(shù)設(shè)置為進(jìn)風(fēng)溫度45 55°C (優(yōu)選50°C )，干燥時間為O. 5 5h(優(yōu)選I. 5h)。室溫干燥可為將樣品放在通風(fēng)干燥的地方放置3 5天自然干燥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要和條件對常規(guī)干燥方法進(jìn)行選擇。4、其它可詵步驟根據(jù)具體的需要，本發(fā)明的方法中還可額外具有如下的一個或多個可選步驟，例如(但不限于)I將酶液經(jīng)過過濾除去小分子，以消除酶液中的小分子對酶活的影響。過濾方法可為例如在超濾膜器上進(jìn)行超濾(廠商美國密理博公司，型號小型)，然后加入磷酸緩沖液(例如PH為5的O. lmol/L的磷酸緩沖液)，使得所得酶液與原酶液體系pH保持一致，并調(diào)整到適當(dāng)?shù)拿傅鞍诐舛取?在固定化步驟中可以加入糊精、白蛋白和/或海藻糖等物質(zhì)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，它們各自的優(yōu)選添加量為糊精I(xiàn) 20% (W/V);白蛋白O. 05 5% (W/V);海藻糖O. 1-10%(W/V)?？商砑右环N或多種上述物質(zhì)，以獲得所需的穩(wěn)定效果。3對載體進(jìn)行改性處理，通過化學(xué)手段接上活性基團(tuán)。例如，可參考徐敬亮等，氨基功能載體固定化酶研究進(jìn)展化工進(jìn)展201029(3) :494-496。5、本發(fā)明的優(yōu)詵實(shí)施方式本發(fā)明的一個示例性優(yōu)選實(shí)施方式如下步驟一、載體的處理
將大孔吸附樹脂載體置于去離子水中浸泡去雜，然后用乙醇浸泡過夜去除有機(jī)雜質(zhì)和其他不溶物，用去離子水沖洗至無醇味，再浸泡在去離子水中保存?zhèn)溆??；蛘?，將離子交換樹脂用去離子水清洗，用5% NaOH和5% HCl交替處理2 5次，然后再用5% NaOH處理，每次處理兩小時左右，然后用去離子水處理至水呈中性，于去離子水中浸泡備用。步驟二、酶固定化稱取40g處理過的樹脂載體于250ml三角瓶中，放入40ml TL酶液，于25°C水浴搖床中150rpm固定，期間每隔一定時間取上清測剩余蛋白含量來判斷酶蛋白的吸附程度，然后取出放入培養(yǎng)皿中吸去殘留液體。步驟三、干燥在固定化步驟進(jìn)行完以后要出去體系中多余的水分即干燥，干燥可采用本領(lǐng)域中 常規(guī)的方式，例如冷凍干燥、真空干燥和室溫干燥。應(yīng)理解，上述優(yōu)選實(shí)施方式只是示例性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本申請中的記載和本領(lǐng)域的常識可在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，對各步驟及條件進(jìn)行改變和優(yōu)化。6、本發(fā)明固定化脂肪酶的應(yīng)用可將本發(fā)明的固定化脂肪酶直接用于工業(yè)化生產(chǎn)中，也可將其制成包裝產(chǎn)品以便于進(jìn)行儲藏、運(yùn)輸、銷售和進(jìn)一步使用。包裝時，優(yōu)選在無菌干燥低溫的條件下灌裝在潔凈的容器中。儲藏條件優(yōu)選為低溫干燥條件儲藏，儲存最適溫度為4 20°C。優(yōu)選在4°C 25°C的溫度下進(jìn)行運(yùn)輸。本發(fā)明的固定化脂肪酶或其包裝產(chǎn)品可用于催化油脂發(fā)生水解、酯交換、酯化反應(yīng)或催化酸解、醇解等，在食品、造紙、皮革、洗滌劑、制藥等工業(yè)上有著巨大的應(yīng)用。例如，本發(fā)明的固定化TL脂肪酶可用于水解、三甘油酯的改性及單甘脂和甘二酯的生產(chǎn)中，尤為優(yōu)選用于催化酯交換反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):I.本發(fā)明中采用提供了一種制備固定化TL酶的新方法，該方法中采用了在固定化領(lǐng)域不常見的大孔吸附樹脂或經(jīng)處理的離子交換樹脂作為固定化載體，且無需對脂肪酶進(jìn)行復(fù)雜的前處理，從而大大簡化了生產(chǎn)步驟、降低了生產(chǎn)成本。2.解決了商品TL酶在油脂反應(yīng)中產(chǎn)生皂的問題。3.本發(fā)明的固定化TL酶可以重復(fù)利用，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了使用率。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》(梁宋平主編高等教育出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。TL酶液購自丹麥諾維信公司，商品名為Lipozyme TL 100L (pH5. O)，不經(jīng)任何處理或調(diào)節(jié)pH至8. O后(O. 05mol/L lmol/L的NaOH)用于本發(fā)明的實(shí)施例中。實(shí)施例I.采用大孔吸附樹脂制備固定化酶將大孔吸附樹脂DlOl、HPDIOOA或X_5(D101和HPD100A購自河北滄州寶恩化工有限公司，X-5購自上海華震樹脂有限公司)分別置于去離子水中浸泡約12h去雜，然后用95%乙醇浸泡過夜去除有機(jī)雜質(zhì)和其它不溶物，用去離子水沖洗至無醇味，置于去離子水中備用。根據(jù)如下配方和步驟制備固定化酶1-19 I、稱取處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥，具體凍干參數(shù)設(shè)置為-20°C降溫速率 I. 5°C /min，2h，_10°C降溫速率 I. 5°C /min，6h5°C降溫速率 L01°C/min，15h，·20°C降溫速率 I. 16°C /min，20h干燥后得固定化酶I。2、稱取處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入真空干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥(真空度為6mbar下，40°C干燥48h)，干燥后得固定化酶2。3、稱取處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶3。4、稱取處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸餾水，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶4。5、稱取處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶5。6、取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶6。7、取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸餾水，和O. 8ml I %的戊二醛溶液，在25°C搖床中150rpm振蕩2h，樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶7。8、取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶8。9取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH5的TL酶液和IOml蒸餾水，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶9。10、取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入30ml pH8的TL酶液和IOml蒸餾水，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶10。
11、取出處理好的DlOl樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶11。12、取出處理好的HPD100A樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和O. 8ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干，干燥后得固定化酶12。13、取出處理好的HPD100A樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干，干燥后得固定化酶13。14、取出處理好的HPD100A樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和O. 8ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干，干燥后得固定化酶14。 15、取出處理好的HPD100A樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和I. 6ml I %的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放入通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干，干燥后得固定化酶15。16、取出處理好的X-5樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶16。17、取出處理好的X-5樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH5的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶17。18、取出處理好的X-5樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和0.8ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶18。19、取出處理好的X-5樹脂40g于250ml三角瓶中，加入40ml pH8的TL酶液，和1.6ml 1%的戊二醛溶液在25°C搖床中150rpm振蕩2h，然后將樹脂取出放入干燥的培養(yǎng)皿中，放在室內(nèi)通風(fēng)良好的地方進(jìn)行干燥，干燥后得固定化酶19。以上處理在固定化過程結(jié)束后對上清液進(jìn)行蛋白含量的測定，測定方法為考馬斯亮藍(lán)法，其剩余蛋白含量均在O. lmol/L以下(如表I所示)。酶固定化效率計算公式如下
權(quán)利要求
1.一種制備固定化脂肪酶的方法，所述方法包括步驟 a)對載體進(jìn)行前處理，所述載體選自離子交換樹脂或骨架為聚苯乙烯的大孔吸附樹月旨; b)提供脂肪酶，并任選在其中加入酶蛋白交聯(lián)劑； c)將步驟a)中所得的經(jīng)前處理的載體與步驟b)中所提供的脂肪酶接觸，使所述脂肪酶固定于所述經(jīng)前處理的載體； d)干燥步驟c)中所得的固定有脂肪酶的載體，以獲得所述固定化脂肪酶。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述載體選自極性大孔吸附樹脂、非極性大孔吸附樹脂、陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， 所述非極性大孔吸附樹脂選自D101、HPDIOOA, AmberliteXAD_4、HPD100, HPD300、HPD700、X-5、XAD-4 或 HP20 ； 所述極性大孔吸附樹脂選自D201、LSA-10或Amberlite XAD7HP ； 所述陽離子交換樹脂選自:D113、DOOl或Ambetlite IRC50 ； 所述陰離子交換樹脂選自D301或Styrene-DVB201X2。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， 所述大孔吸附樹脂的前處理是如下進(jìn)行的將載體置于水中浸泡去雜，然后用溶劑浸泡I 24h以去除有機(jī)雜質(zhì)和不溶物，再用水洗去所述溶劑，其中所述溶劑為乙醇、正己烷、丙酮或石油醚； 所述離子交換樹脂的前處理是如下進(jìn)行的用O. 05mol/L lmol/L的堿液和酸液交替浸泡或沖洗所述樹脂1-5次,然后僅用O. 05mol/L lmol/L的堿液再次浸泡或沖洗樹脂I次，再用水洗至水呈中性。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟b)中所提供的脂肪酶選自嗜熱絲孢菌(Thermomyces Lanuginosus)的發(fā)酵產(chǎn)物；通過基因工程或蛋白質(zhì)工程改造而得的脂肪酶；或市售的脂肪酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶未經(jīng)任何前處理而用于步驟c)中。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述酶蛋白交聯(lián)劑選自戊二醛溶液、聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、聚乙烯胺、明膠或精胺。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟c)中，所述經(jīng)處理的載體與脂肪酶以g/ml計的重量/體積比為25 : I I : 25。
9.一種固定化脂肪酶或其包裝產(chǎn)品，其特征在于，所述的固定化脂肪酶是通過權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法制備的。
10.一種進(jìn)行酯交換、酯化、酸解或醇解反應(yīng)的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求9所述的固定化脂肪酶作為催化劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及TL固定化酶及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明中提供了一種制備固定化脂肪酶的方法，其包括步驟a)對載體進(jìn)行前處理，所述載體選自離子交換樹脂或骨架為聚苯乙烯的大孔吸附樹脂；b)提供脂肪酶；c)將步驟a)中所得的經(jīng)前處理的載體與步驟b)中所提供的脂肪酶接觸，使所述脂肪酶固定于所述經(jīng)前處理的載體；d)干燥步驟。本發(fā)明中還提供了用本發(fā)明方法制備的固定化脂肪酶及其應(yīng)用。本發(fā)明的固定化酶具有高活性和穩(wěn)定性，且在食品工業(yè)中催化酯交換反應(yīng)過程中不產(chǎn)生皂，操作簡單，大大降低了油脂加工的成本。
文檔編號C12P7/64GK102839166SQ20111017070
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者鄭妍, 辛本榮, 楊天奎, 徐學(xué)兵 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司