一種磁性固定化酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化工材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁性固定化酶的制備方法，即一種載體為PVP-DB-171 (聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基三甲氧基硅烷)/Si02/Fe304的固定化酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化酶是通過物理的或化學的方法，將酶分子束縛在載體上，在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)可控等優(yōu)點。固定化酶在環(huán)境、能源、材料、化學、制藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
[0003]現(xiàn)有的固定化方法有吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合法等，同時，載體材料的選擇也是決定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。載體的結(jié)構(gòu)及性能在很大程度上直接影響著固定化效果。
[0004]發(fā)展至今的固定化酶技術(shù)，研制出了各種各樣的固定化酶，但真正投入工業(yè)化應(yīng)用的并不多，主要原因是固定化使用的載體材料成本高，其次是由于固定化效率低，穩(wěn)定性差等。新型Fe3O4納米粒子催化劑具有超順磁性、催化劑回收率尚、親和性尚、反應(yīng)功能基團多樣化、生物相容性好、制備工藝簡單、價廉易得等特點。因此，新型Fe3O4納米材料的應(yīng)用成為人們關(guān)注的重要領(lǐng)域之一。
[0005]游離酶存在對反應(yīng)環(huán)境敏感，如pH、溫度等因素，且游離酶無法回收，導致生產(chǎn)成本的增加。但是，將游離酶進行磁性固定化后，得到納米級磁性固定化酶。它是一類具有磁響應(yīng)特性的酶，具有操作穩(wěn)定性，而且納米級固定化酶在液相中分散均勻。并利用其磁響應(yīng)性能達到固定化酶與反應(yīng)介質(zhì)完全分離的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決游離酶對反應(yīng)環(huán)境敏感、無法回收和生產(chǎn)成本高等問題，故將游離酶固定化在納米級磁性載體PVP-DB-171/Si02/Fe304。本發(fā)明的磁性固定化酶的制備方法，按以下步驟進行:一、制備Fe3CVit性微球；二、制備S1 2/^304核殼粒子；三、制備磁性載體1^?-08-171/5;102/^6304;四、磁性固定化磷脂酶A工;五、測定固定化酶的活性；六、固定化磷脂酶A1的重復利用次數(shù)的研宄。
[0007]本發(fā)明的有益點:
1、本發(fā)明制備了磁性載體PVP-DB-171/Si02/Fe304，賦予了固定化磷脂酶么^交強的磁場響應(yīng)性，從而可以借助外部磁場從反應(yīng)體系中快速簡便地富集、分離和回收固定化磷脂酶A1，最終得到的固定化酶活回收率為85%，重復使用10次相對酶活力保留在70%以上；
2、磁性載體固定酶放入磁場穩(wěn)定的流化床反應(yīng)器中，可以減少持續(xù)反應(yīng)體系中的操作，適合于大規(guī)模連續(xù)化操作；
3、通過磁性能(VSM)測定、掃描電子顯微(SEM)分析及N2吸附-脫附試驗對磁性載體進行表征，結(jié)果可知制備的磁性載體成球性很好，粒徑大小均一，有規(guī)律的聚集，可以清晰看出孔狀結(jié)構(gòu)，具有松散的團聚體結(jié)構(gòu)；
4、當用于固定化酶的催化過程中時，應(yīng)具有功能基特性和生物相容性，即可連接具有生物活性的物質(zhì)如酶等，又不影響酶的生物活性。
[0008]【具體實施方式】:
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0009]【具體實施方式】一:本實施方式的磁性固定化酶載體的制備方法。按以下步驟進行:一、制備Fe3O4磁性微球:將三價鐵鹽和二價亞鐵鹽按一定的比例配成溶液，并選用堿性沉淀劑(如NH3.H2O, NaOH等)進行共沉淀，選用優(yōu)良的工藝條件，即可制得性能優(yōu)良的磁性微粒；二、制備Si02/Fe304核殼粒子；三、制備磁性載體PVP-DB-171/Si02/Fe304，其具體方法為:在80mL乙醇中加人0.14g DB_171，3.98g NVP和0.20g AIBN，75°C回流6h。旋蒸后于60°C真空干燥24h制得PVP-DB-171 ο在10mL三口瓶中加人2g Si02/Fe304的水溶液和200mL水，混合均勻后，逐滴加入50mg PVP-DB-171的乙醇溶液20mL，加人0.3g三乙胺，700C回流10h，采用釹鐵硼永磁鐵將混合物磁分離，用去離子水洗滌3次，得到PVP-DB-171/Si02/Fe304，將其配成質(zhì)量分數(shù)為0.8%的水溶液待用；四、磁性固定化磷脂酶A1，其具體方法為將磷脂酶A1加入0.lmol/L且pH值為5.5?9.5的磷酸緩沖液中，制成質(zhì)量濃度為0.2%的磷脂酶A1磷酸緩沖液，然后將浸泡后的載體加入到12?88mL磷脂酶八1磷酸緩沖液中，在40°C下用磁力攪拌器攪拌6h，攪拌速度為12r/min，然后進行磁分離，用0.lmol/L且pH值為7?7.2的磷酸緩沖液沖洗3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1;五、測定固定化酶活性；六、固定化磷脂酶A1的重復利用次數(shù)的研宄。
[0010]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟三中制備磁性載體PVP-DB-171的旋蒸溫度為30?80°C。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0011]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟三中制備磁性載體PVP-DB-171的真空干燥時間為12?36h。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0012]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟四中磁性固定化磷脂酶A1*加入緩沖液的PH值為4?9，攪拌溫度在20?60°C，攪拌速度為8?20r/min。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0013]【具體實施方式】五:本實施方式與具體的實施方式一不同的是步驟五中測定磷脂酶A1的活性的具體方法為測定固定化酶活性。其它步驟與【具體實施方式】一相同。
[0014]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟六中研宄固定化磷脂酶A1的重復利用次數(shù)的數(shù)具體方法，將本文所制備的磁性載體PVP-DB-171/S1 2/Fe304，最終得到的固定化酶活回收率為85%，重復使用10次相對酶活力保留在70%以上。
【主權(quán)項】
1.一種磁性固定化酶的制備方法，其特征在于載體PVP-DB-171 (聚乙烯吡咯烷酮-乙稀基三甲氧基娃燒)/Si02/Fe304的制備方法通過以下步驟實現(xiàn):一、制備Fe 304磁性微球，按以下步驟進行:將三價鐵鹽和二價亞鐵鹽按一定的比例配成溶液，并選用堿性沉淀劑(如NH3.H20、NaOH等)進行共沉淀；二、制備Si02/Fe304核殼粒子;三、制備磁性載體PVP-DB-171/Si02/Fe304，按以下步驟進行:在 80mL 乙醇中加入 0.14g DB-171,3.98g NVP 和0.20g AIBN，75°C回流6h，旋蒸后于60°C真空干燥24h制得PVP-DB-171，在10mL三口瓶中加入2g Si02/Fe304的水溶液和200mL水，混合均勻后，逐滴加入50mg PVP-DB-171的乙醇溶液20mL，加入0.3g三乙胺，700C回流10h，采用釹鐵硼永磁鐵將混合物磁分離，用去離子水洗滌3次，得到PVP-DB-171/Si02/Fe304，將其配成質(zhì)量分數(shù)為0.8%的水溶液待用；四、磁性固定化磷脂酶A1，磷脂酶A1加入到0.lmol/L且pH值為5?10的磷酸緩沖液中，制成質(zhì)量濃度為0.2%的磷脂酶A1磷酸緩沖液，然后將浸泡后的載體加入到12?88mL磷脂酶A i磷酸緩沖液中，在40°C下用磁力攪拌器攪拌6h，攪拌速度為12r/min，然后進行磁分離，用0.lmol/L且pH值為7.0?7.2的磷酸緩沖液沖洗3次，即得到磁性固定化磷脂酶A1;五、測定固定化酶活性；六、固定化磷脂酶A1的重復利用次數(shù)的研宄。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用制備一種載體PVP-DB-171/Si02/Fe304的制備方法，其特征在于步驟三中然后旋蒸后于30?80°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用一種載體PVP-DB-171/Si02/Fe304的制備方法，其特征在于步驟三中旋蒸后真空干燥12?36h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟四中使用的緩沖液的pH值為4?9，攪拌溫度在20?60°C，攪拌速度為8?20r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟五中測定磷脂酶A1的活性的具體方法為測定固定化酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化磷脂酶A1的方法，其特征在于步驟六中固定化酶活回收率為85%，重復使用10次相對酶活力保留在70%以上。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種磁性固定化酶的制備方法，涉及一種新型載體PVP-DB-171（聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基三甲氧基硅烷）/SiO2/Fe3O4的制備方法。發(fā)明的目的是為了解決游離酶對反應(yīng)環(huán)境敏感、無法回收和生產(chǎn)成本高等問題，故將游離酶固定化在納米級磁性載體PVP-DB-171/SiO2/Fe3O4。它是一類具有磁響應(yīng)特性的酶，具有操作穩(wěn)定性，而且納米級固定化酶在液相中分散均勻。并利用其磁響應(yīng)性能達到固定化酶與反應(yīng)介質(zhì)完全分離的目的。最終得到的固定化酶活回收率為85%，重復使用10次相對酶活力保留在70%以上。
【IPC分類】C12N11-08, C12N11-14
【公開號】CN104560940
【申請?zhí)枴緾N201510028284
【發(fā)明人】江連洲, 于殿宇, 趙清霞, 王俊國, 王立琦, 趙丹丹, 杜華楠, 劉飛
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月21日