專利名稱：與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
馬藺又名馬蓮、馬蘭花，拉丁文名/rishctea/ Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz，系鳶尾科鳶尾屬多年生草本宿根植物，在我國北方野生分布廣泛，抗旱抗寒性強、耐鹽堿、耐粗放管理。葉片色澤青綠、花淡雅美麗、修剪頻率少、病蟲害少，是優(yōu)良的觀葉賞花地被植物。近年來，在我國逐漸被用作水保護坡、園林綠化觀賞地的優(yōu)良材料。同時，還屬極具開發(fā)潛力的藥用、飼用和經(jīng)濟植物資源，優(yōu)異的耐鹽和抗旱基因也有待開發(fā)。傳統(tǒng)育種方法是對馬藺種質(zhì)在苗期模擬鹽分生境和大田生長形態(tài)、生理指標(biāo)耐鹽性鑒定，以篩選耐鹽種質(zhì)材料。這種方法研究時間長，工作量大，有時還常出現(xiàn)因抽樣錯誤導(dǎo)致評價的失真。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplification of polymorphic DNA、RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(amplified fragments length polymorphism、AFLP)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat、 SSR)、相關(guān)序列擴增多態(tài)性標(biāo)記(sequence-related amplified polymorphism、SRAP)、簡單重復(fù)序列區(qū)間標(biāo)記(inter-simple sequence r印eat、ISSR)等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物優(yōu)異抗性種質(zhì)材料篩選與鑒定、遺傳特性分析、目標(biāo)基因標(biāo)定、新品種選育等方面。 其中ISSR標(biāo)記為顯性標(biāo)記，操作簡單快速，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高、重復(fù)性好， 具有多等位基因的特性，被廣泛應(yīng)用于植物抗逆性鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等的研究中。有報道關(guān)于“野生馬藺中和抗性有關(guān)基因片段的分離與初步分析”(《吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)》2005. 2，蔡玉珍等)，另外在馬藺抗旱種質(zhì)鑒定及分子標(biāo)記輔助篩選方面也有一些報道，但在馬藺耐鹽基因的分子標(biāo)記篩選和分子標(biāo)記輔助育種方面，尚未見研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服馬藺傳統(tǒng)育種方法中耐鹽種質(zhì)篩選困難的問題，本發(fā)明提供一種與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明提供的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，所述方法為用標(biāo)記引物ISSR841擴增馬藺材料DNA，如果能擴增出220 bp,300 bp和320 bp的擴增片段，則標(biāo)志馬藺耐鹽基因的存在，所述標(biāo)記引物ISSR841序列為GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中 Y= (C，T)。進一步，篩選所述分子標(biāo)記引物的方法包括(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選； (2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建；(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得。所述(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選方法為對鹽脅迫處理的馬藺種質(zhì)材料定期測定生長形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)，利用組間平均法進行綜合聚類分析，篩選強耐鹽及敏鹽種質(zhì)材料。所述(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建將篩選的強耐鹽及敏鹽種質(zhì)材料分別提取葉片DNA，將各強耐鹽種質(zhì)材料DNA等量混合構(gòu)建耐鹽基因池，將各敏鹽種質(zhì)材料DNA等量混合構(gòu)建敏鹽基因池。所述(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得選用已公布的 100條ISSR引物對耐鹽基因池和敏鹽基因池進行多態(tài)性篩選，經(jīng)擴增譜帶的比較分析，獲得多態(tài)性分子標(biāo)記引物。進一步，所述(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選方法為16份馬藺種質(zhì)材料出苗3-4 真葉期時移苗于花盆中，移栽成活后5-6葉期，進行NaCl鹽脅迫(利用化學(xué)試劑NaCl，根據(jù)設(shè)計濃度配成不同濃度溶液加入花盆中)，設(shè)置NaCl鹽濃度分別為0. 4%、0. 8%、1. 2% (W/ V),并設(shè)對照水(不加NaCl鹽)，均3次重復(fù)，每個材料12盆(每鹽濃度設(shè)置3盆，并對照設(shè)置3盆)，每隔7天，分別對3個NaCl鹽濃度脅迫處理和對照的馬藺種質(zhì)材料的綠葉數(shù)、葉寬和株高的生長形態(tài)指標(biāo)以及葉片丙二醛、脯氨酸、葉綠素和電導(dǎo)率的生理指標(biāo)測定1次， 共測定4次，對0. 8%NaCl鹽濃度連續(xù)脅迫到第28天時測得的3個生長形態(tài)指標(biāo)和4個生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)，利用組間平均法進行綜合聚類分析，將16份馬藺種質(zhì)材料的耐鹽性劃分為 3個耐鹽級別，篩選出2份強耐鹽的種質(zhì)材料和4份敏鹽種質(zhì)材料。所述16份馬藺種質(zhì)材料分別為北京四季青鎮(zhèn)1份，山西太原1份，內(nèi)蒙古赤峰1 份、鄂爾多斯1份、臨河3份、呼和浩特2份、科爾沁左翼中旗1份、科左后旗1份，新疆鞏留縣1份、特克斯縣1份、察布查爾縣1份和伊寧縣2份。進一步，所述步驟(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建為取馬藺種質(zhì)苗期的新鮮幼葉1克，于液氮中研磨成粉末，采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)法，使用植物基因組提取試劑盒進行馬藺基因組DNA的提取，用1% (w/v )瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，將所有材料DNA分別用超純水稀釋至10 ng/ μ L以供ISSR標(biāo)記分析，將篩選出的2份強耐鹽馬藺種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合構(gòu)建耐鹽基因池，將篩選出的4份敏鹽種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合構(gòu)建敏鹽基因池。進一步，所述步驟(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得對耐鹽基因池和敏鹽基因池，選用已公布的100條ISSR引物進行多態(tài)性篩選，經(jīng)過耐鹽池和敏鹽池擴增譜帶的比較分析，獲得多態(tài)性分子標(biāo)記引物ISSR841和3個與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記，分別為ISSR841-220、ISSR841-300和ISSR841-320，所述的擴增分子量分別為220 bp、300 bp和320bp。本發(fā)明利用溫室苗期模擬鹽分脅迫的技術(shù)方法結(jié)合ISSR分子標(biāo)記，對馬藺種質(zhì)資源進行耐鹽性的鑒定評價，通過耐鹽池和敏鹽池DNA譜帶的比對分析，優(yōu)選出與馬藺種質(zhì)耐鹽基因相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記，提出一種與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，以及獲得此馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖ISSR標(biāo)記的方法，以克服馬藺傳統(tǒng)育種方法中耐鹽種質(zhì)篩選困難的問題，結(jié)果可重復(fù)性好。本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點
(1)本發(fā)明提供的一種與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖ISSR標(biāo)記的方法，操作方法簡單易行，結(jié)果可信，效率高，可快速預(yù)測來自不同生境條件下的馬藺種質(zhì)材料的耐鹽性能，利于馬藺耐鹽親本的篩選和馬藺耐鹽新品系的確定，可加速馬藺耐鹽新品種的育種。
(2)本發(fā)明篩選了 1個與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖ISSR標(biāo)記的特異性引物，通過其獲得了 3個ISSR分子標(biāo)記，有利于馬藺耐鹽基因的進一步挖掘。


附圖1為利用本發(fā)明方法篩選得到的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中第3、4泳道為引物ISSR841分別在耐鹽和敏鹽基因池擴增出的ISSR標(biāo)記譜帶，共擴增出三條耐鹽基因池特有的多態(tài)性標(biāo)記，分別為ISSR841-220、ISSR841-300、 ISSR841-320，擴增分子量分別為220 bp,300 bp,320 bp。第1、2泳道，第5、6泳道和第7、 8泳道分別為引物ISSR840、ISSR842及ISSR843擴增結(jié)果，這三條引物在耐鹽和敏鹽基因池間均無多態(tài)性。M為Marker D2000。附圖2為利用引物ISSR841對4個馬藺材料的ISSR分子標(biāo)記聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中第1泳道為材料BC-ML01，第2、3、4泳道分別為馬藺材料BC-ML02、BC-ML03、 BC-ML04，M為Marker D2000。在第1泳道中出現(xiàn)了擴增分子量分別為220 bp,300 bp,320 bp三條多態(tài)性標(biāo)記，其他3個材料均沒有。
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1 與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記獲得方法
一、耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選 (1)選用北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心的科研團隊于2009年從我國北方不同地區(qū)采集的16份野生馬藺種質(zhì)材料，包括北京四季青鎮(zhèn)1份(BJCY-ML001)，山西太原1份 (BJCY-ML006),內(nèi)蒙古赤峰1份(BJCY-ML005)、鄂爾多斯1份(BJCY-ML007)、臨河3份 (BJCY-MLO11、BJCY-MLO12、BJCY-MLO13 )、呼和浩特 2 份(BJCY-ML-16、BJCY-MLO18 )、科爾沁左翼中旗1份(BJCY-ML(^9)、科左后旗1份(BJCY-ML031)，新疆鞏留縣1份(BJCY-ML020)、 特克斯縣1份(BJCY-ML021)、察布查爾縣1份(BJCY-ML023 )、伊寧縣2份(BJCY-ML022、 BJCY-ML035)。于2010年9月9日于北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心日光溫室對16份野生馬藺種質(zhì)材料在營養(yǎng)盤中育苗，種子利用98%(w/v )濃硫酸試劑預(yù)處理20-30 s，然后用清水沖洗5-8次至水清澈無酸味，以活化種子，提高出苗率。育苗基質(zhì)采用草炭壤土 =2:1比例混合。出苗3-4真葉期時移苗于花盆(盆口內(nèi)徑22cm，高18cm)中，盆栽基質(zhì)采用草炭 壤土 =1 1比例進行混合，每盆裝基質(zhì)1. 6 kg，定植10株。(2)移栽成活后于5-6葉期，進行NaCl鹽脅迫(利用化學(xué)試劑NaCl，根據(jù)設(shè)計濃度配成不同濃度溶液加入花盆中)，設(shè)置NaCl鹽濃度分別為0. 4%、0. 8%、1. 2%(w/v )，并設(shè)對照(不加NaCl鹽的水)，均3次重復(fù)，每個材料12盆(每鹽濃度設(shè)置3盆，并對照設(shè)置3盆)。 鹽脅迫期間，每隔7天，分別對3個NaCl鹽脅迫處理和對照的16份馬藺種質(zhì)材料的生長形態(tài)指標(biāo)(綠葉數(shù)、葉寬、株高)和葉片生理指標(biāo)(丙二醛、脯氨酸、葉綠素、電導(dǎo)率)測定1次， 共測定4次。其中葉片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法測定；葉綠素含量采用分光光度計比色法測定；電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法測定；綠葉數(shù)為測定時葉片的2/3以上為綠色的具有光合作用的葉片數(shù)目；株高為植株生長的自然垂直高度；葉寬為最長葉片中部的寬度。(3)對0. 8% NaCl鹽濃度連續(xù)脅迫到第28天時測得的3個生長形態(tài)指標(biāo)和4個生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)，利用SPSS16. 0軟件以組間平均法進行綜合聚類分析，將16份馬藺種質(zhì)材料的耐鹽性劃分為3個耐鹽級別，篩選出2份強耐鹽的種質(zhì)材料(BJCY-ML007、BJCY-ML-Ol 1) 和 4 份敏鹽種質(zhì)材料(BJCY-MLO18、BJCY-ML020、BJCY-ML021, BJCY-ML035 ) 二、耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建
(I)DNA提取取上述耐鹽及敏鹽馬藺種質(zhì)材料苗期的新鮮幼葉Ig左右，于液氮中研磨成粉末，采用CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide)法，使用植物基因組提取試劑盒 (北京索萊寶科技有限公司)進行馬藺基因組DNA的提取。TE (Tris-EDTA)溶解后于4°C冰箱內(nèi)過夜，用1% (w/v )瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。將所有材料DNA分別用超純水稀釋至10 ng/ μ L，以供ISSR標(biāo)記分析備用。(2)將篩選出的2份強耐鹽的馬藺種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合和4份敏鹽種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合，分別構(gòu)建耐鹽基因池和敏鹽基因池。三、多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得
(1)對耐鹽基因池和敏鹽基因池，用“加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)”公布的100條ISSR 引物進行多態(tài)性分析與篩選，獲得特異性引物ISSR841，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y= (C，T)。擴增反應(yīng)在BIO-RAD C-100 PCR儀中進行。PCR反應(yīng)體系為25 μ L 反應(yīng)體系中含有 50 ng 模板 DNA，2. 5 mM MgCl2, 0.32 mM dNTPs, 0.4 μ M 引物，1. 5 U Taq酶以及IXPCR buffer。PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ； 94°C變性45s，53°C退火30s，72°C延伸1 min，進行44個循環(huán)；72°C延伸5 min ；然后置于10°C保存。(2)擴增產(chǎn)物在6% (w/v )聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電泳儀和電泳槽分別為DYY-10C型和DYCZ-28D (北京市六一儀器廠)，電泳時間3 h。凝膠銀染方法參照^iang et al. (2002)的方法并稍作改進為取下凝膠板上的凝膠，放入已配置好固定液(340 ml, 0. 5%( v/v )乙酸+10% (v/v )乙醇)的保鮮盒中，置于搖床上，固定5-6 min;然后，倒掉固定液，用清水沖洗1次，倒入滲透液(300 ml，0. 2% (w/v) AgNO3),于搖床上滲透12 min ； 回收滲透液，凝膠用清水沖洗2次，倒入顯色液(400 ml, 1.5% (w/v) Na0H+0. 6% (v/v )甲醛+0.002% (w/v)硫代硫酸鈉)于搖床上至條帶清晰地顯出；倒掉顯色液，凝膠用清水沖洗 2次，倒入終止液(400 ml，0. 75% (w/v) Na2CO3),暫時保存。于X線膠片觀察燈上觀察和記錄電泳結(jié)果。(3)比對耐鹽池和敏鹽池的DNA擴增譜帶，以耐鹽池獲得的特有條帶為耐鹽標(biāo)記， 從而獲得了 3個與馬藺耐鹽相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記，分別為ISSR841-220、ISSR841-300、 ISSR841-320，擴增分子量分別為220 bp,300 bp,320 bp。(參見附圖1)
實施例2 采用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法篩選耐鹽材料的實例
2011年5月收集來自內(nèi)蒙古不同生境4份馬藺種質(zhì)材料，分別來自巴彥淖爾市 (BC-MLO1)，赤峰市(BC-ML02 )，興安盟(BC-ML03 )和錫林郭勒盟(BC-ML04 )，其中 BC-MLO1 采自中度鹽漬化低地草甸，其余3個材料采自溫性草原(馬藺零星分布)。4個材料的種子用 98%濃硫酸試劑進行預(yù)處理20-30s，用清水沖洗掉種子上剩余濃硫酸，利用Ilcm培養(yǎng)皿發(fā)芽，每皿播種30粒種子。待馬藺種子葉片生長到4cm左右時開始利用。
(I)DNA提取取馬藺葉片Ig左右，于液氮中研磨成粉末，采用CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide)法，使用植物基因組提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進行馬藺基因組DNA的提取。TE (Tris-EDTA)溶解后于4°C冰箱內(nèi)過夜，用1% (w/v) 瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。將所有材料DNA分別用超純水稀釋至10 ng/yL，以供ISSR 標(biāo)記分析備用。(2)PCR擴增擴增反應(yīng)在BIO-RAD C-100 PCR儀中進行。引物為ISSR841，序列 GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y=(C，T)。反應(yīng)體系為25 μ L反應(yīng)體系中含有50 ng模板DNA，2.5 mM MgCl2, 0. 32 mM dNTPs, 0. 4 μ M 引物，1· 5 U Taq酶以及 IXPCR buffer。 PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5 min ； 94°C變性45 s，53°C退火30 s，72°C延伸1 min，進行44個循環(huán)；72°C延伸5 min ；然后置于10°C保存。(3)電泳擴增產(chǎn)物在6% (w/v)聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電泳儀和電泳槽分別為DYY-10C型和DYCZ-28D (北京市六一儀器廠)，電泳時間3 h。(4)銀染顯色取下凝膠板上的凝膠，放入已配置好固定液(340 ml,0. 5% (ν/ν) 乙酸+10% (ν/ν)乙醇)的保鮮盒中，置于搖床上，固定5-6 min;然后倒掉固定液，用清水沖洗1次，倒入滲透液(300 ml,0. 2% (w/v) AgNO3),于搖床上滲透12 min;回收滲透液，凝膠用清水沖洗 2 次，倒入顯色液(400 ml，1.5% (w/v) Na0H+0. 6% (ν/ν)甲醛+0. 002%(w/v) 硫代硫酸鈉)于搖床上至條帶清晰地顯出；倒掉顯色液，凝膠用清水沖洗2次，倒入終止液 (400 ml，0. 75% (w/v) NaCO3),暫時保存。(5)觀片拍照于X線膠片觀察燈上觀察和記錄電泳結(jié)果，同時拍照。(6)結(jié)果分析通過讀帶，在膠片上來自巴彥浩特市的材料BC-MLOl電泳譜帶上在 220 bp,300 bp,320 bp處出現(xiàn)了明顯的特有的多態(tài)性標(biāo)記，另外3個材料則沒有出現(xiàn)，通過結(jié)果可知4個材料中BC-MLOl耐鹽性最強。(參見附圖2)
盡管通過參照本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例，已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。SEQUENCE LISTING <110>北京市農(nóng)林科學(xué)院
<120>與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法
<130> "野生馬藺中和抗性有關(guān)基因片段的分離與初步分析"(《吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)》 2005. 2，蔡玉珍等 <160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Iris ensata
<400> 1
gagagagagagagagacc 18<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>Iris ensata
<400>2
gagagagagagagagatc
權(quán)利要求
1.與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述方法為用標(biāo)記引物ISSR841擴增馬藺材料DNA，如果能擴增出220 bp,300 bp和320 bp的擴增片段，則標(biāo)志馬藺耐鹽基因的存在，所述標(biāo)記引物ISSR841序列為GAG AGA GAG AGA GAG AYC，其中Y 為C或T。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 篩選所述分子標(biāo)記引物的方法包括(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選；(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建；(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選方法為對鹽脅迫處理的馬藺種質(zhì)材料定期測定生長形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)，利用組間平均法進行綜合聚類分析，篩選強耐鹽及敏鹽種質(zhì)材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建將篩選的強耐鹽及敏鹽種質(zhì)材料分別提取葉片 DNA,將各強耐鹽種質(zhì)材料DNA等量混合構(gòu)建耐鹽基因池，將各敏鹽種質(zhì)材料DNA等量混合構(gòu)建敏鹽基因池。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得選用已公布的100條ISSR 引物對耐鹽基因池和敏鹽基因池進行多態(tài)性篩選，經(jīng)擴增譜帶的比較分析，獲得多態(tài)性分子標(biāo)記引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述步驟(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選方法為16份馬藺種質(zhì)材料出苗3-4真葉期時移苗于花盆中，移栽成活后5-6葉期，進行NaCl鹽脅迫，設(shè)置NaCl鹽濃度分別為0. 4%、0. 8%、 1. 2%，并設(shè)對照，均3次重復(fù)，每個材料12盆，每隔7天，分別對3個NaCl鹽脅迫處理和對照的馬藺種質(zhì)材料的綠葉數(shù)、葉寬和株高的生長形態(tài)指標(biāo)以及葉片丙二醛、脯氨酸、葉綠素和電導(dǎo)率的生理指標(biāo)測定1次，共測定4次，對0. 8%NaCl鹽濃度連續(xù)脅迫到第28天時測得的3個生長形態(tài)指標(biāo)和4個生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)，利用組間平均法進行綜合聚類分析，將16份馬藺種質(zhì)材料的耐鹽性劃分為3個耐鹽級別，篩選出2份強耐鹽的種質(zhì)材料和4份敏鹽種質(zhì)材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述16份馬藺種質(zhì)材料分別為北京四季青鎮(zhèn)1份，山西太原1份，內(nèi)蒙古赤峰1份、鄂爾多斯1份、臨河3份、呼和浩特2份、科爾沁左翼中旗1份、科左后旗1份，新疆鞏留縣1份、特克斯縣1份、察布查爾縣1份和伊寧縣2份。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于， 所述步驟(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建為取馬藺種質(zhì)苗期的新鮮幼葉1克，于液氮中研磨成粉末，采用十六烷基三甲基溴化銨法CTAB法，使用植物基因組提取試劑盒進行馬藺基因組DNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，將所有材料DNA分別用超純水稀釋至10 ng/ μ L以供ISSR標(biāo)記分析，將篩選出的2份強耐鹽馬藺種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合構(gòu)建耐鹽基因池，將篩選出的4份敏鹽種質(zhì)材料提取的葉片DNA等量混合構(gòu)建敏鹽基因池。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述步驟(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得對耐鹽基因池和敏鹽基因池，選用已公布的100條ISSR引物進行多態(tài)性篩選，經(jīng)過耐鹽池和敏鹽池擴增譜帶的比較分析，獲得多態(tài)性分子標(biāo)記引物ISSR841和3個與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的ISSR標(biāo)記，分別為ISSR841-220、ISSR841-300和ISSR841-320，所述的ISSR標(biāo)記擴增分子量分別為 220 bp,300 bp 和 320bp。
全文摘要
本發(fā)明提供一種與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖的分子標(biāo)記方法，所述方法為用標(biāo)記引物ISSR841擴增馬藺材料DNA，如果能擴增出220bp、300bp和320bp的擴增片段，則標(biāo)志馬藺耐鹽基因的存在，所述標(biāo)記引物ISSR841序列為GAGAGAGAGAGAGAGAYC，其中Y=(C，T)。篩選所述分子標(biāo)記引物的方法包括(1)耐鹽和敏鹽種質(zhì)材料的篩選；(2)耐鹽基因池和敏鹽基因池構(gòu)建；(3)多態(tài)性好且可重復(fù)的ISSR引物篩選及分子標(biāo)記的獲得。本發(fā)明提供的與馬藺耐鹽基因相關(guān)或連鎖ISSR標(biāo)記的方法，操作簡單易行，結(jié)果可信，效率高，可快速預(yù)測來自不同生境條件下的馬藺種質(zhì)材料的耐鹽性能，利于馬藺耐鹽親本的篩選和馬藺耐鹽新品系的確定，可加速馬藺耐鹽新品種的育種。
文檔編號C12N15/10GK102260741SQ20111018664
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者孫福鼎, 孟林, 毛培春, 田小霞 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院