專利名稱：用于在植物中遺傳控制昆蟲侵襲的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及害蟲侵襲的遺傳控制。更具體地，本發(fā)明本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制靶編碼序列在害蟲細(xì)胞中的表達(dá)以提供害蟲防護(hù)作用的重組DNA技術(shù)。
背景技術(shù)：
人類生存的環(huán)境充滿了害蟲侵襲。害蟲包括昆蟲、蜘蛛、甲殼類動物、真菌、細(xì)菌、 病毒、線蟲、扁形蟲、蛔蟲、蟯蟲、鉤蟲、絳蟲、錐形蟲、血吸蟲、馬蠅、跳蚤、扁虱、螨、虱等，它們是人類環(huán)境中普遍存在的，已應(yīng)用了多種手段企圖控制這些害蟲的侵襲。用于控制微小害蟲(例如細(xì)菌、真菌和病毒)侵襲的組合物已被提供為抗生素組合物、抗病毒組合物以及抗真菌組合物形式。用于控制較大害蟲(例如，線蟲、扁形蟲、蛔蟲、蟯蟲、犬心蟲、絳蟲、錐形蟲、血吸蟲等)侵襲的組合物典型地已作為化學(xué)組合物的形式存在，它們可被應(yīng)用到已知會出現(xiàn)害蟲侵襲的物質(zhì)表面，或者以藥丸、粉末、藥片、軟膏或膠囊等形式被受侵襲的動物攝取。本發(fā)明涉及提供較之本領(lǐng)域已知的組合物，用于控制害蟲侵襲的改進(jìn)方法。商業(yè)農(nóng)農(nóng)作物通常是昆蟲攻擊的靶。在過去數(shù)十年中，關(guān)于開發(fā)用于控制植物中昆蟲侵襲的更為有效的方法和組合物，已有了一些實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展?；瘜W(xué)殺蟲劑對于根除害蟲侵襲非常有效。但是，使用化學(xué)殺蟲劑有多種缺點(diǎn)?；瘜W(xué)殺蟲劑是非選擇性的。人們意欲應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑來控制對多種農(nóng)作物和其它植物來說有害的無脊椎害蟲。但是，因?yàn)槿狈x擇性，化學(xué)殺蟲劑對于非靶動物也會施加其作用，并且，在化學(xué)殺蟲劑應(yīng)用過的一段時間，通常會使田野貧瘠?；瘜W(xué)殺蟲劑持續(xù)存在于環(huán)境中，通常很慢被代謝，如果完全不被代謝的話。它們會積累于食物鏈中，特別是高等食肉動物的食物鏈中。這些化學(xué)殺蟲劑的積累導(dǎo)致對這些試劑抗性的發(fā)展以及導(dǎo)致進(jìn)化梯高端的物種，所述殺蟲劑作為誘變劑和/或致癌劑發(fā)生作用，通常導(dǎo)致不可逆的有害遺傳修飾。因此人們強(qiáng)烈需要對環(huán)境友善的方法用于控制或根除植物中或植物上的昆蟲侵襲，即，選擇性的、環(huán)境惰性的、非持續(xù)保留的以及生物可降解的，并且能很好地是用于害蟲抗性管理體系的方法。包括蘇云金芽孢桿菌(B. t.)的組合物是可通過商業(yè)途徑獲得的，其作為對環(huán)境安全并且可接受的殺昆蟲劑已使用了在超過三十年。Bt細(xì)菌的殺昆蟲作用是這些細(xì)菌專有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的結(jié)果，所述蛋白質(zhì)不會持續(xù)存在于環(huán)境中，并且，對于受影響的靶物種具有高度的選擇性，僅通過被靶害蟲攝取來施加其作用，它們已顯示出了對環(huán)境和其它非靶生物(包括人類)的無害性。含有編碼殺昆蟲B. t.蛋白的一種或多種基因的轉(zhuǎn)基因植物還可在本領(lǐng)域內(nèi)獲得，它們明顯有效于控制有害昆蟲的侵襲。使用表達(dá)Bt殺昆蟲蛋白的重組植物的實(shí)質(zhì)性結(jié)果是，在使用此類轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的地區(qū)，應(yīng)用到環(huán)境以控制農(nóng)作物田間害蟲侵襲的化學(xué)殺蟲劑的量明顯減少。化學(xué)殺蟲劑應(yīng)用的減少使得土壤更為清潔，并且使得從土壤流向周圍溪流、江河、池塘和湖泊的水也更為清潔。除這些環(huán)境好處之外，轉(zhuǎn)基因抗昆蟲農(nóng)作物生長的農(nóng)作物田間，有利昆蟲的數(shù)量有顯著增加，這是因?yàn)榛瘜W(xué)殺蟲劑的使用減少的緣故。本領(lǐng)域中已報道了反義方法和組合物，它們被相信能通過單鏈RNA分子(理論上， 能在體內(nèi)與高度互補(bǔ)的有義鏈RNA分子雜交)的合成施加其作用。反義技術(shù)難于在很多系統(tǒng)中使用，這有三個主要原因。首先，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的反義序列不穩(wěn)定。第二，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的反義序列的不穩(wěn)定性隨之對將該序列送遞到遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的宿主、細(xì)胞類型或生物系統(tǒng)造成困難。第三，隨著不穩(wěn)定性和反義序列的送遞遇到的困難對于如下企圖來說也制造了困難，所述企圖是在編碼該反義序列的重組細(xì)胞內(nèi)部提供能有效調(diào)節(jié)靶有義核苷酸序列表達(dá)水平的劑量。用于在細(xì)胞、組織或生物內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的技術(shù)鮮有改進(jìn)，特別地，缺少用于通過使用重組DNA技術(shù)來延遲、抑制或減少特定基因表達(dá)的發(fā)展的技術(shù)。此外，作為這些手段的不可預(yù)見性的結(jié)果，沒有用于在真核或原核生物中調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)水平的、商業(yè)途徑可獲得的手段。以前已展示了在多種害蟲中對特定基因進(jìn)行雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制。已在一種果蠅，即黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中對dsRNA介導(dǎo)的用于遺傳控制的手段加以 了檢測(Kennerdell 和 Carthew, 1998 ；Kennerdell 和 Carthew, 2000)。Kennerdell 和 Carthew(1998)描述了一種方法，用于送遞涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(其表達(dá)雙鏈RNA分子)的 dsRNA或?qū)sRNA溶液注射到昆蟲體內(nèi)或在胚胎發(fā)育之前注射到卵囊內(nèi)。研究人員之前已經(jīng)展示，通過將含有雙鏈或小干擾RNA分子的溶液喂飼給線蟲或?qū)⒕€蟲浸于該溶液中，以及通過注射dsRNA分子，可在線蟲中獲得雙鏈RNA介導(dǎo)的基因抑制。Rajagopal等人Q002)描述了如下失敗的嘗試通過喂飼含特異于靶基因的dsRNA 的溶液，或通過將幼蟲浸于該溶液中，來抑制有害昆蟲斜紋夜蛾(Spodoptera litura) 幼蟲的內(nèi)源基因，但是，在用微施用器(micro applicator)將dsRNA注射到第五齡幼蟲的血淋巴之后，Rajagopal等人卻成功地獲得了抑制。最近，Yadav等人Q006)報道了在植物中產(chǎn)生的宿主制備的dsRNA可以防止植物感染線蟲。類似地，美國專利申請公開 No. 2003/0150017預(yù)見性地描述了用于使用送遞到幼蟲的dsRNA抑制鱗翅目幼蟲棉鈴蟲 (Helicoverpa armigera)的優(yōu)選基因座，所述送遞通過攝取了被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生dsRNA的植物來實(shí)現(xiàn)。WO 2005/110068教導(dǎo)了在玉米根蟲(CRW)的食物中提供針對關(guān)鍵CRW基因的CRW 特異性dsRNA。在體外和植物中在CRW食物中提供dsRNA，結(jié)果是在攝入該食物后CRW幼蟲的成長受阻礙或被殺死，并且對一些不同的基因證明了該作用。因此，需要鑒定有效核苷酸序列，所述序列用于通過阻抑、延遲或其它方式減少特定鞘翅目害蟲中的基因表達(dá)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的改進(jìn)方法中，該方法的目的是控制害蟲侵襲或誘導(dǎo)新的表型性狀。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供抑制鞘翅目害蟲中靶基因表達(dá)的方法。在某些實(shí)施方案中， 該方法包括調(diào)節(jié)或抑制鞘翅目害蟲中一種或多種靶基因的表達(dá)，所述方法能導(dǎo)致攝食、生長、發(fā)育、繁殖和/或感染力停止，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。所述方法包括將穩(wěn)定化的雙鏈 RNA(dsRNA)，包括其修飾形式(例如，小干擾RNA(siRNA)序列)的部分或全部引入到鞘翅目昆蟲體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞外環(huán)境(例如，中腸)中，其中dsRNA進(jìn)入到細(xì)胞中，并且抑制至少一種或多種靶基因的表達(dá)，并且，其中該抑制在鞘翅目害蟲上施加了有害的作用。本發(fā)明的方法和相關(guān)組合物可以用于通過在害蟲的食物中提供本文描述的一種或多種包含dsRNA 分子的組合物，在任何害蟲宿主、害蟲共生體或害蟲存在的環(huán)境內(nèi)部或表面上限制或消除鞘翅目害蟲的侵襲。該方法對于防止昆蟲攻擊植物特別有益。在一種實(shí)施方案中，害蟲限定為消化系統(tǒng)的PH為大約4. 5至大約9. 5，大約5至大約9，大約6至大約7以及大約pH 7. 0。另一方面，本發(fā)明提供了示例性核酸組合物，其與靶害蟲中一種或多種天然核酸序列的至少一部分同源。在某些實(shí)施方案中，害蟲選自葉甲物種(Diabrotica sp.)，包 H rPΞΕji, (WCR, Diabrotica virgifera 5 Diabrotica virgifera virgifera) > 南部玉米根蟲(SCR，Diabrotica undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米根蟲(MCR， Diabrotica virgifera zea) > Ei H ΞΕ ji, (BZR, Diabrotica balteata, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa)、北部玉米根蟲(NCR, Diabrotica barberi)、Diabrotica undecimpunctata ；以及科羅拉多馬鈴薯甲蟲(CPB，Leptinotarsa decemlineata)、赤擬谷盜(RFB，Tribolium castaneum)和墨西哥豆甲(Epilachna varivestis)。在其它實(shí)施方案中，害蟲選自鱗翅目昆蟲，包括歐洲玉米螟(ECB, Ostrinia nubilalis)、小地老虎 (BCff, Agrotis ipsilon)、玉米粘蟲(CEW，Helicoverpa zea)、秋夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)、棉鈴象鼻蟲(BffV, Anthonomus grandis)、香(Bombyx mori)禾口煙草天娥 (Manduca sexta)，以及雙翅目昆蟲，包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、瘧蚊 (Anopheles gambiae)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)。本發(fā)明提供的所述核酸的具體實(shí)例示于所附序列表中的SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :906。另一方面，本發(fā)明提供了用于抑制鞘翅目害蟲如玉米根蟲或相關(guān)物種的基因表達(dá)的方法，該方法包括在害蟲的食物中提供基因抑制量的至少一種從上文描述的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的dsRNA分子，其至少一個片段與害蟲細(xì)胞內(nèi)的mRNA序列互補(bǔ)。該方法可以進(jìn)一步包括觀察害蟲的死亡、攝食抑制、受阻或停止。根據(jù)本發(fā)明使害蟲攝食的dsRNA分子，包括其修飾形式，如siRNA分子，可以與從選自SEQ ID NO =I-SEQ IDNO :906的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的 RNA 分子具有約 80，81，82，83，84，85，86，87，88 89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99 或約100%同一性。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以選自SEQ ID NO :697、SEQ IDNOs 813-819、SEQ ID NO :841 和 SEQ ID NO :874。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一組分離和純化的核苷酸序列，如SEQ ID NO I-SEQ ID NO :906所示。本發(fā)明提供了穩(wěn)定化的dsRNA分子或一種或多種miRNA的表達(dá)，用于抑制鞘翅目害蟲中從這些序列和片段表達(dá)靶基因。穩(wěn)定化的dsRNA，包括miRNA或siRNA 分子可以包含至少兩個編碼序列，它們相對于至少一個啟動子是有義和反義方向排列的， 其中包含有義鏈和反義鏈的核苷酸序列通過至少約5-約1000個核苷酸的間隔序列連接或相連，其中有義鏈和反義鏈可以是不同的長度，并且其中所述兩個編碼序列中的每一個序列與SEQ ID NO =I-SEQID NO :906所示的任何一個或多個核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，至少90%，至少95%，至少98%，或100%的序列同一性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了選自SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906的核酸序列的片段或串聯(lián)體。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以包含選自SEQID NO :697,SEQ ID NOs :813-819, SEQ ID NO 841和SEQ ID NO :874的序列的片段或串聯(lián)體。當(dāng)表達(dá)為dsRNA并且提供給害蟲時，該片段可以定義為導(dǎo)致害蟲死亡、攝食抑制、 受阻或停止。該片段可以例如包含SEQ ID NO =I-SEQID NO :906中任何一個或多個序列或其互補(bǔ)序列的至少約19，21，23，25，40，60，80，100，125或更多個連續(xù)核苷酸。用于本發(fā)明中的一種有益的DNA片段的長度是約19-約23個核苷酸，或約23-約100個核苷酸，最多至約2000個核苷酸或更多。特別有用的將是包括約23-約300個與害蟲靶序列同源的核苷酸的dsRNA序列。本發(fā)明也提供了從任何所述序列表達(dá)的核糖核酸，包括dsRNA。可以從來自一種或多種靶害蟲的單個序列構(gòu)建選擇用于表達(dá)基因抑制劑的序列，并且用于表達(dá)抑制一種或多種靶害蟲中的單個基因或基因家族的RNA，或該DNA序列可從多種DNA序列構(gòu)建為嵌合體。另一方面，本發(fā)明提供了重組DNA構(gòu)建體，其包含編碼本文描述的dsRNA分子的核酸分子。可以通過從與選自SEQ ID NO =I-SEQ IDNO :906的核苷酸序列具有至少約80% -約 100%同一性的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄dsRNA分子的一條鏈，形成dsRNA。所述重組DNA構(gòu)建體可以定位為能夠在攝入后在害蟲中抑制內(nèi)源靶基因表達(dá)的dsRNA分子。該構(gòu)建體可以包含任選與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子序列連接的本發(fā)明的核苷酸序列。所述啟動子可以是組織特異性的，并且可以例如特異于受害蟲攻擊的組織類型。例如，在根蟲的情況下，可能需要使用提供優(yōu)選根表達(dá)的啟動子。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以包含至少一個非天然存在的核苷酸序列，其可以轉(zhuǎn)錄為能夠在體內(nèi)通過雜交形成dsRNA分子的單鏈RNA。所述dsRNA序列自身組裝，并且可以提供在鞘翅目害蟲的食物中，以達(dá)到需要的抑制。重組DNA構(gòu)建體可以包含兩種不同的非天然序列，所述序列在體內(nèi)表達(dá)為dsRNA 序列并且提供在鞘翅目害蟲的食物中時，抑制至少兩種不同的靶基因在鞘翅目害蟲細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，在包括具有害蟲抑制作用的細(xì)胞的細(xì)胞或植物中產(chǎn)生至少3， 4，5，6，8或10或更多種不同的dsRNAs。所述dsRNA可以從不同轉(zhuǎn)化事件中引入的多個構(gòu)建體表達(dá)，或可以引入單個核酸分子上?？梢杂脝蝹€啟動子或多個啟動子表達(dá)dsRNA。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，產(chǎn)生單個dsRNA，其包含與害蟲內(nèi)的多個基因座同源的核酸。另一方面，本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞，其基因組中具有至少一個重組DNA序列，該序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生至少一個dsRNA分子，該分子在鞘翅目害蟲攝入時起作用，抑制害蟲中靶基因的表達(dá)。dsRNA分子可以由本文描述和序列表所示的任何核酸編碼。本發(fā)明也提供了基因組中具有至少一個本文描述的重組DNA序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。也提供了包含所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，包括任何代的后代植物、種子和植物產(chǎn)品，它們均包含重組DNA。本發(fā)明的方法和組合物可應(yīng)用于任何單子葉和雙子葉植物，這取決于想要的鞘翅目害蟲控制。特別地，植物包括但不限于苜蓿、蒔蘿(aneth)、Apple、杏、朝鮮薊、芝麻菜、 蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、卡羅拉(canola)、香瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽、柑橘、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、花旗松、茄子、苦苣、寬葉萵苣、桉樹、茴香、無花果、葫聲、葡萄、柚子、哈密瓜、豆薯、奇異果、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、堅(jiān)果、燕麥、黃秋葵、洋蔥、桔、裝飾用植物、木瓜、歐芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松樹、菠蘿、大蕉、李、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、 溫柏、輻射松、菊苣、蘿卜、覆盆子、水稻、裸麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、蘇合香、蜜柑、茶、煙草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麥、薯蕷以及小胡瓜植物。因此，本發(fā)明也提供了 SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906所示的重組DNA序列或其串聯(lián)體、片段或互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)化的植物，所述序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生至少一種當(dāng)鞘翅目害蟲攝取時抑制害蟲中靶基因表達(dá)的dsRNA分子。在特定實(shí)施方案中，重組DNA序列可以選自SEQ ID NO :697, SEQ ID NOs :813-819, SEQ IDNO :841 和 SEQ ID NO :874 或其片段、互補(bǔ)序列或串聯(lián)體。本發(fā)明還提供了用于控制鞘翅目害蟲侵襲的方法和組合物的組合。一種手段提供了用于保護(hù)植物防止昆蟲侵襲的、本文所述的dsRNA方法，以及一種或多種殺昆蟲劑，所述殺昆蟲劑展示出與dsRNA方法和組合物所展示出的特征不同的特征。例如，可以在昆蟲害蟲的食物中提供一種或多種Bt蛋白，其與本文描述一種或多種dsRNA組合。配制為局部應(yīng)用的組合物，或使用轉(zhuǎn)基因方法獲得的將dsRNA方法和組合物與Bt方法和組合物組合起來的組合物，能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，這是控制昆蟲侵襲的領(lǐng)域中以前未知的。一種協(xié)同效應(yīng)是 dsRNA或Bt蛋白所需的表達(dá)水平降低。當(dāng)組合到一起時，每種害蟲控制劑都僅需要更低的有效劑量。認(rèn)為Bt殺昆蟲蛋白建立了進(jìn)入孔，dsRNA分子通過所述的進(jìn)入孔能更為有效地穿透進(jìn)入遠(yuǎn)離昆蟲腸道的空間，或者更為有效地進(jìn)入Bt蛋白所建立的損傷附近的細(xì)胞，由此僅需要更少量的Bt或dsRNA就能獲得想要的殺昆蟲結(jié)果，或者想要的對靶害蟲靶生物功能的抑制或遏制。因此，本發(fā)明提供了一種組合物，其中含有兩種或多種不同的殺蟲劑，其中每種都對同樣的害蟲或昆蟲物種有毒，其中的至少一種包含本文描述dsRNA。在某些實(shí)施方案中，第二種殺蟲劑可以選自下組馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)、蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白、致病桿菌殺昆蟲蛋白、光桿菌殺昆蟲蛋白、側(cè)孢芽孢桿菌殺昆蟲蛋白、球形芽孢桿菌殺昆蟲蛋白以及木質(zhì)素。蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲蛋白可以是大量殺昆蟲蛋白中的任何種類，所述殺昆蟲蛋白包括但不限于:CryU Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、 TIC1201、TIC407、TIC417、二元?dú)⒗ハx蛋白 CryET33 和 CryET34、二元?dú)⒗ハx蛋白 CryET80 和CryET76、二元?dú)⒗ハx蛋白TIC100和TIC101、二元?dú)⒗ハx蛋白PS149B1、VIP殺昆蟲蛋白、 TIC900或相關(guān)蛋白、或殺昆蟲蛋白ED9或ET37與殺昆蟲蛋白TIC810或TIC812的組合，以及任何前述殺昆蟲蛋白的殺昆蟲嵌合體。在食物中提供的核糖核酸可以提供在人工食物中，該食物配制用于滿足害蟲保持所述食物的特殊營養(yǎng)要求。該食物中可以補(bǔ)充害蟲控制量的RNA，該RNA從分開的表達(dá)系統(tǒng)中純化，以確定害蟲控制量的RNA組合物或確定害蟲攝取經(jīng)過補(bǔ)充的食物后的抑制活性程度。該食物也可以是用DNA序列轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述DNA序列構(gòu)建用于表達(dá)試劑、RNA或基因抑制劑。害蟲攝取一種或多種所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，觀察到需要的表型結(jié)果，表明該試劑抑制害蟲細(xì)胞內(nèi)的靶核苷酸序列的表達(dá)。被靶向進(jìn)行抑制的基因可編碼必須的蛋白，所述蛋白的預(yù)期功能選自肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、消化酶合成，細(xì)胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴的保持， 神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，未知功能，以及凋亡。本發(fā)明的另一方面也提供了用于改進(jìn)受到昆蟲害蟲侵襲的農(nóng)作物產(chǎn)生的農(nóng)作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟a)將包含選自SEQID NO=I-SEQ ID NO :906的序列的多核苷酸或其互補(bǔ)序列或串聯(lián)體或片段引入所述農(nóng)作物植物；和b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物以使所述多核苷酸表達(dá)，其中所述多核苷酸的表達(dá)抑制昆蟲害蟲的攝食和由于害蟲侵襲導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生RNA分子，其抑制攝取了所述農(nóng)作物植物的一部分的昆蟲害蟲中的至少第一靶基因，其中該靶基因行使選自下組的至少一種必須功能害蟲攝食，害蟲存活力，害蟲細(xì)胞凋亡，害蟲或任何害蟲細(xì)胞的分化和發(fā)育，害蟲的有性繁殖，肌肉形成，肌肉顫搐，肌肉收縮、保幼激素的形成和/或減少，保幼激素的調(diào)節(jié)， 離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜電位的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成，卵形成，幼蟲成熟、消化酶形成，血淋巴合成， 血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，幼蟲階段轉(zhuǎn)變，化蛹，破蛹，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)合成和保持，核苷酸代謝，氮代謝，水利用，水保持，以及感覺感知。在其它實(shí)施方案中，昆蟲害蟲是玉米根蟲害蟲，選自=Diabrotica undecimpunctata howardi (南部玉米根蟲(SCR))，Diabrotica virgifera virgifera (西部玉米根蟲(WCR) )，Diabrotica barberi (北部玉米根蟲(NCR))，Diabrotica virgifera zea (墨西哥玉米根蟲(MCR) )，Diabrotica balteata(巴西玉米根蟲(BZR) )，Diabrotica viridula(巴西玉米根蟲(BZR))，和 Diabrotica speciosa(巴西玉米根蟲(BZR))。也提供了改進(jìn)由受到昆蟲害蟲侵襲的農(nóng)作物植物產(chǎn)生的農(nóng)作物的干旱耐受力的方法，所述方法包括以下步驟a)將選自SEQ ID NO I-SEQ ID NO :906的多核苷酸序列或其片段引入所述農(nóng)作物植物；和b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物以使所述多核苷酸表達(dá)，其中所述多核苷酸的表達(dá)抑制昆蟲害蟲的攝食和由于害蟲侵襲導(dǎo)致的干旱耐受力受損。本發(fā)明的另一方面進(jìn)一步提供了農(nóng)業(yè)上和商業(yè)上重要的產(chǎn)品和/或組合物，包括但不限于，動物飼料、農(nóng)產(chǎn)品和意欲用作人類消耗的食物或用于人類消耗的組合物和農(nóng)產(chǎn)品中的產(chǎn)品和副產(chǎn)品，包括但不限于玉米面、玉米粗粉、玉米漿、玉米油、玉米淀粉、爆米花、 玉米餅、谷物等。這些組合物可以含有可檢測量的本文示出的核苷酸序列，因此也可以診斷含有此類核苷酸序列的任何轉(zhuǎn)基因事件。這些產(chǎn)品是有用的，至少因?yàn)樗鼈兛赡軄碓从谠诟贇⑾x劑和有機(jī)磷酸酯的條件下繁殖的農(nóng)作物，這是由于它們摻入了本發(fā)明的核苷酸用于控制鞘翅目害蟲在植物中的侵襲的結(jié)果。此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品是從由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子來生產(chǎn)的，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)RNA，所述RNA來自本發(fā)明的一種或多種連續(xù)核苷酸，或一種或多種鞘翅目害蟲的核苷酸及其互補(bǔ)序列。此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品還可用于控制此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品的鞘翅目害蟲，例如，控制面粉象鼻蟲，因?yàn)樵谵r(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品制品中存在有能抑制害蟲基因的RNA，所述RNA是本發(fā)明所示的基因序列所表達(dá)的。也提供了生產(chǎn)所述農(nóng)產(chǎn)品制品的方法，包括獲得用包含選自SEQ IDNO=I-SEQ IDNO 906的序列或其串聯(lián)體或片段或互補(bǔ)序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物，并且從所述植物或其部分制備農(nóng)產(chǎn)品制品。此外，本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)食品或飼料的方法，包括獲得用選自SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906的多核苷酸或其片段或互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)化的植物，并且從所述植物或其部分制備食品或飼料。本發(fā)明也提供了計算機(jī)可讀的介質(zhì)，在其上記錄有SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906 示出的核苷酸序列中的一種或多種或其互補(bǔ)序列，用于大量基于計算機(jī)的應(yīng)用，包括但不限于，DNA同一性和相似性檢索、蛋白質(zhì)同一性和相似性檢索、轉(zhuǎn)錄譜表征、基因組之間的比較以及人工雜交分析。


圖1 用pM0N98503 (SEQ ID NO :820)轉(zhuǎn)化并且用西部玉米根蟲(WCR)侵襲的Fl 玉米植物事件的生物測定。圖2 用包含串聯(lián)體Cl (SEQ ID NO :821)的pM0N98504轉(zhuǎn)化并且用西部玉米根蟲 (WCR)侵襲的Fl玉米植物事件的生物測定。圖3 :Dv49和Dv248片段的選擇和Dv49_Dv248串聯(lián)體C38的示意性設(shè)計。圖4 基于串聯(lián)體C38合成的dsRNAs F1-F13。圖5 :DV49-DV248串聯(lián)體38劑量反應(yīng)(片段F1-F6)。圖6 :DV49-DV248串聯(lián)體38劑量反應(yīng)(片段F7-F10)。圖7 :DV49-DV248串聯(lián)體38劑量反應(yīng)(片段F11-F13)。
具體實(shí)施例方式下文是對本發(fā)明的詳細(xì)描述，其被提供來協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可不離開本發(fā)明宗旨或范圍的情況下在本文所述的實(shí)施方式中做出改良和變化。本發(fā)明提供了用于遺傳控制害蟲侵襲的方法和組合物。例如，本發(fā)明提供了重組DNA技術(shù)，用于轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制害蟲細(xì)胞中靶編碼序列的表達(dá)，從而提供害蟲防護(hù)作用，該方法是通過使害蟲攝食一種或多種從靶編碼序列的全部或部分轉(zhuǎn)錄的雙鏈或小干擾核糖核酸(RNA)分子，從而控制侵襲。因此，本發(fā)明涉及用雙鏈RNA(dsRNA)，包括小干擾 RNA(siRNA)對編碼序列的表達(dá)進(jìn)行序列特異性抑制，以達(dá)到預(yù)期的害蟲控制水平。提供了分離和基本純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重組DNA構(gòu)建體，用于轉(zhuǎn)錄物發(fā)明的dsRNA分子，所述序列和構(gòu)建體在引入時阻抑或抑制害蟲中的內(nèi)源編碼序列或靶編碼序列的表達(dá)。也提供了轉(zhuǎn)基因植物，它們(a)包含編碼用于轉(zhuǎn)錄dsRNA分子從而控制植物害蟲侵襲的分離和基本純化的核酸分子以及非天然存在的重組DNA構(gòu)建體的核苷酸序列，并且(b)展示對昆蟲侵襲的抗性和/或增強(qiáng)的耐受性。也描述了含有本發(fā)明的dsRNA核苷酸序列的組合物，用于表面施用到植物上或動物上或施用到動物的環(huán)境中，以實(shí)現(xiàn)害蟲侵襲的消除或減少。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反，使鞘翅目物種(由所述物種得到核苷酸序列)攝食含有由鞘翅目物種的一種或多種表達(dá)的核苷酸序列中存在的序列組成的雙鏈RNA 分子的組合物，導(dǎo)致鞘翅目物種中一種或多種生物功能的抑制。特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使農(nóng)作物害蟲物種如玉米根蟲攝食本文描述的雙鏈RNA分子，導(dǎo)致攝入這些組合物的昆蟲害蟲的死亡或發(fā)育和分化抑制。發(fā)明人鑒定了本文描述的核苷酸序列提供抗鞘翅目害蟲物種的保護(hù)作用。推導(dǎo)了 cDNA序列編碼的氨基酸序列，并且與已知氨基酸序列進(jìn)行比較。預(yù)測這些序列中的許多序列都編碼具有與其相關(guān)的一些注釋信息的蛋白。與特定核苷酸序列和由其編碼的蛋白序列相關(guān)的注釋信息是基于通過本文描述的編碼序列的翻譯推導(dǎo)的氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫中的本領(lǐng)域已知氨基酸序列之間的同源性或相似性。選擇編碼存活所必須的蛋白或蛋白部分的cDNA序列，用于制備在鞘翅目害蟲的食物中提供的雙鏈RNA分子，所述蛋白例如參與多種代謝或分解代謝生化途徑、細(xì)胞分裂、 繁殖、能量代謝、消化、神經(jīng)系統(tǒng)功能等的氨基酸。如本文的描述，靶害蟲攝入含有一種或多種dsRNA (其至少一個片段相應(yīng)于靶害蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的至少一個基本相同的RNA片段)的組合物，導(dǎo)致靶害蟲的死亡、發(fā)育遲緩或其它抑制。這些結(jié)果表明，由鞘翅目害蟲得到的核苷酸序列，即DNA或RNA，可以用于構(gòu)建抗害蟲侵襲的植物細(xì)胞。例如，可以轉(zhuǎn)化害蟲宿主， 使其含有一種或多種來源于鞘翅目害蟲的核苷酸序列。轉(zhuǎn)化到害蟲宿主或共生體中的核苷酸序列可以編碼在轉(zhuǎn)化的宿主或共生體中的細(xì)胞或生物流體中形成dsRNA的一種或多種 RNA，從而如果/當(dāng)害蟲在轉(zhuǎn)基因宿主或共生體上攝食時，害蟲的食物中可以存在dsRNA，導(dǎo)致害蟲細(xì)胞中的一種或多種基因的表達(dá)阻抑，并且最終導(dǎo)致害蟲死亡、生長遲緩或其它抑制。本發(fā)明一般涉及宿主生物中鞘翅目害蟲侵襲的遺傳控制。更具體地，本發(fā)明包括用于將害蟲控制劑送遞給鞘翅目害蟲的方法。所述害蟲控制劑直接或間接導(dǎo)致害蟲保持自身生長或以其它方式侵襲靶宿主或共生體的能力受損。本發(fā)明提供了用于在害蟲食物中采用穩(wěn)定化的dsRNA分子作為阻抑害蟲中靶基因的手段的方法，從而實(shí)現(xiàn)了害蟲靶定的宿主或共生體中或關(guān)于所述宿主或共生體的所需害蟲侵襲控制。在實(shí)現(xiàn)前述目的的過程中，本發(fā)明提供了抑制鞘翅目害蟲，包括例如玉米根蟲或其它鞘翅目昆蟲物種中靶基因表達(dá)的方法，導(dǎo)致害蟲的攝食、生長、發(fā)育、繁殖、感染力的停止，最終可以導(dǎo)致害蟲死亡。在一個實(shí)施方案中，該方法包括將部分或完全穩(wěn)定化的雙鏈 RNA(dsRNA)核苷酸分子引入作為害蟲食物來源的營養(yǎng)組合物，并且使害蟲能夠得到所述營養(yǎng)組合物用于攝食。攝入含有雙鏈或siRNA分子的營養(yǎng)組合物導(dǎo)致害蟲細(xì)胞攝取分子，導(dǎo)致害蟲細(xì)胞中至少一種靶基因表達(dá)的抑制。靶基因的抑制對害蟲施加有害作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dsRNA分子包含與SEQ ID NO :1-SEQ ID NO :906 中任意一個所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列，害蟲生物中SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :906中任意一個所示序列的抑制導(dǎo)致害蟲生長和發(fā)育或其它生物功能所必須的蛋白或核苷酸試劑的減少或去除。選擇的核苷酸序列可以與序列表中SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :906所示的核苷酸序列之一，包括其互補(bǔ)序列具有約80% -至少約100%的序列同一性。所述抑制可以描述為特異性的，因?yàn)榘谢虻囊徊糠值暮塑账嵝蛄羞x自抑制性dsRNA或siRNA轉(zhuǎn)錄的序列。 該方法可以有效抑制至少一種靶基因的表達(dá)，并且可以用于抑制害蟲中的很多不同類型的靶基因。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以選自SEQ ID NO :697, SEQ IDNOs =813-819, SEQ ID NO 841和 SEQ ID NO :874。通過建立合適的表達(dá)構(gòu)建體，鑒定為具有害蟲防護(hù)作用的序列可以容易地表達(dá)為dsRNA分子。例如，通過以下步驟，所述序列可以表達(dá)為發(fā)夾以及莖和環(huán)結(jié)構(gòu)取出相應(yīng)于選自SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906的序列或其片段的第一片段，將該序列連接于不與第一片段同源或互補(bǔ)的第二片段間隔區(qū)，并且將其與轉(zhuǎn)錄RNA的第三片段連接，其中第三片段的至少一部分與第一片段基本互補(bǔ)。所述構(gòu)建體通過第一片段與第三片段的雜交形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)，形成包含第二片段的環(huán)結(jié)構(gòu)(W094/01550，W098/05770, US 2002/0048814A1，和US 2003/0018993A1)。A.核酸組合物和構(gòu)建體本發(fā)明提供了用于實(shí)現(xiàn)特定宿主或共生體害蟲靶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的重組DNA構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化的宿主或共生體害蟲靶可以表達(dá)殺蟲有效水平的來自所述重組DNA構(gòu)建體的優(yōu)選 dsRNA或siRNA分子，并且在害蟲的食物中提供所述分子?？梢詮腸DNA文庫和/或基因組文庫信息提供成對的分離和純化的核苷酸序列。核苷酸序列對可以來源于任何優(yōu)選的鞘翅目害蟲，用作熱擴(kuò)增對，以產(chǎn)生用于制備本發(fā)明的dsRNA和siRNA分子的DNA模板。本文中使用的術(shù)語“核酸”指從5’至3’末端讀碼的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單或雙鏈聚合物。任選地，“核酸”還可含有非天然存在的或被改變的核苷酸堿基， 其允許通過聚合酶的正確讀碼，不會減少該核酸編碼的多肽的表達(dá)。術(shù)語“核苷酸序列”或 “核酸序列”指作為單獨(dú)的單鏈存在或存在于雙鏈體中的核酸的有義和反義鏈。術(shù)語“核糖核酸”(RNA)包括 RNAi (抑制性 RNA)、dsRNA (雙鏈 RNA)、siRNA (小干擾 RNA)、mRNA (信使RNA)、miRNA(微RNA)、tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、被或未被相應(yīng)的?；被峒由想姾傻?以及 cRNA(互補(bǔ)RNA)，術(shù)語“脫氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因組DNA以及DNA-RNA雜交體。詞匯“核酸片段”、“核酸序列片段”或更常見的“片段”將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列和更小的工程化的核苷酸序列，所述序列表達(dá)或可適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽。根據(jù)本發(fā)明，提供了核苷酸序列，其表達(dá)得到與昆蟲中的靶基因的RNA分子顯著同源的RNA序列，所述昆蟲包含由昆蟲基因組中的核苷酸序列編碼的RNA序列。因此，在攝入穩(wěn)定化的RNA序列后，可以獲得對昆蟲細(xì)胞中靶基因的核苷酸序列的下調(diào)，導(dǎo)致對昆蟲的維持、存活力、增殖、繁殖和侵襲的有害作用。本文中使用的術(shù)語“顯著同源”或者“顯著同源性”，在提到核酸序列時，包括在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :906中任意一個所示的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906的任意序列或其互補(bǔ)序列雜交的序列是允許兩條序列間發(fā)生反向平行排列的序列，然后兩條序列能在嚴(yán)格條件下與相反鏈上的對應(yīng)堿基形成氫鍵，以形成雙鏈體分子，其在嚴(yán)格條件下是足夠穩(wěn)定的，使用本領(lǐng)域公知方法能檢測到。優(yōu)選地，顯著同源的序列與序列表中的SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :906中任意一個所示的參照核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有大約70% -大約80%的序列同一性，或者更優(yōu)選地，大約80% -大約85%的序列同一性，或者最優(yōu)選地， 大約90% -大約95%的序列同一性，至大約99%的序列同一性。本文中使用的術(shù)語“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”被用于描述兩條或多條核苷酸序列之間的關(guān)系。兩條序列之間“序列同一性”的百分比是通過下述方法來測定的在比較窗上比較兩條最優(yōu)比對的序列，其中，較之參照序列(不包含添加或缺失)，比較窗中序列的一部分可以包含添加或缺失(即，空位)，用于最優(yōu)比對兩條序列。通過下述方法來計算百分比測定兩條序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以比較窗中的位置總數(shù)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。與參照序列比較時每個位置都相同的序列被認(rèn)為與對照序列相同，反之亦然。如果第一條核苷酸序列展示出與第二條或參照序列的完全互補(bǔ)性，以5’至3’方向來觀察時，第一條核苷酸序列被認(rèn)為是以3’至5’方向來觀察的第二條或參照核苷酸序列的互補(bǔ)序列或與其互補(bǔ)。在本文中，以5’至3’方向讀碼的序列之一中的每個核苷酸與以3’至5’方向讀碼的其它序列的每個核苷酸都互補(bǔ)的時候，我們說核酸序列分子展示出 “完全互補(bǔ)性”。與參照核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將展示出與參照核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列相同的序列。這些術(shù)語和描述在本領(lǐng)域中有明確的定義，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于理解的。本文中使用的“比較窗”指，至少6個連續(xù)位置的概念上的片段，通常大約50至大約100，更常見地，大約100至大約150個連續(xù)位置，其中，兩條序列被最優(yōu)比對之后，將一條序列與具有同樣數(shù)量連續(xù)位置的參照序列相比。較之參照序列(不包含添加或缺失)， 比較窗可以包含大約20%或更少的添加或缺失(即，空位)，用于兩條序列的最優(yōu)比對。 本令頁域技術(shù)人員將參考 Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis.，USA)中用于序列比對的詳細(xì)方法或參考Ausubel等人(1998)中關(guān)于序列分析的詳細(xì)討論。本發(fā)明還提供了 DNA序列，其能在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為RNA，以便抑制昆蟲細(xì)胞、組織或器官中靶基因的表達(dá)，該序列包含編碼一種或多種不同核苷酸序列的DNA分子， 其中，不同核苷酸序列中的每一種都包含間隔序列所連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，所述序列編碼本發(fā)明的dsRNA分子。間隔序列構(gòu)成了有義核苷酸序列或反義核苷酸序列的部分，并且形成于有義和反義序列之間的dsRNA分子內(nèi)。有義核苷酸序列和反義核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互補(bǔ)序列基本相同。dsDNA分子被可操作地置于啟動子序列的控制下，所述啟動子序列在宿主的細(xì)胞、組織或器官中發(fā)揮作用，表達(dá)dsDNA，產(chǎn)生dsRNA分子。在一種實(shí)施方案中，DNA序列可以來源于序列表中SEQ ID N0: I-SEQ ID NO :906所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了 DNA序列，用于在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且，隨著DNA表達(dá)為RNA以及被靶害蟲攝取，能獲得對有害昆蟲細(xì)胞、組織或器官中靶基因的表達(dá)的阻抑。dsRNA至少包含一種或多種結(jié)構(gòu)基因序列，其中，每種結(jié)構(gòu)基因序列都包含間隔序列所連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，所述序列在互補(bǔ)和反義序列中形成環(huán)。有義核苷酸序列和反義核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互補(bǔ)序列基本相同。一種或多種結(jié)構(gòu)基因序列被可操作地置于一種或多種啟動子序列的控制下，其中至少一種在原核或真核生物，特別是植物的細(xì)胞、組織或器官中是可操作的。本發(fā)明的用于控制害蟲的基因序列或片段可被克隆到在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中可操作的兩種組織特異性啟動子，例如兩種根特異性啟動子之間，所述基因序列或其片段可在此處表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中產(chǎn)生mRNA，其形成dsRNA分子。植物組織中含有的dsRNA分子被昆蟲攝取，從而獲得對靶基因表達(dá)的預(yù)期阻抑。本發(fā)明提供的核苷酸序列可以包含被“間隔序列，，分離開的反向重復(fù)序列。間隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的區(qū)域，如果需要，所述核苷酸序列能促進(jìn)每個重復(fù)序列之間二級結(jié)構(gòu)形成。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，間隔序列是mRNA的有義或反義編碼序列的一部分?；蛘?，間隔序列可以包含能與核酸分子共價連接的核苷酸或其同源物的任何組合。間隔序列可包含長度為至少大約10-100個核苷酸的核苷酸序列，或者長度為至少大約100-200個核苷酸，長度為至少大約200-400個核苷酸，或者長度為至少大約400-500 個核苷酸。序列表中的核酸分子或核酸分子的片段或其它核酸分子能在某些條件下特異性地與其它核酸分子雜交。本文中，如果兩個分子能形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就說兩個核酸分子能互相特異性雜交。如果兩個核酸分子展示出完全互補(bǔ)性，我們就說一個核酸分子是另一個核酸分子的互補(bǔ)序列。如果在至少傳統(tǒng)的“低嚴(yán)格性”條件下，兩個分子能以足夠的穩(wěn)定性互相雜交，允許它們保持為互相退火的狀態(tài)，我們就說這兩個分子是“最小互補(bǔ)的”。類似地，如果在傳統(tǒng)的“高嚴(yán)格性”條件下，兩個分子能以足夠的穩(wěn)定性互相雜交，允許它們保持為互相退火的狀態(tài)，我們就說這兩個分子是互補(bǔ)的。傳統(tǒng)的嚴(yán)格條件在Sambrook 等人和Haymes等人的文獻(xiàn)中有所描述。因此，與完全互補(bǔ)有背離是允許的，只要這種背離不會使分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力完全消失即可。因此，為使核酸分子或核酸分子的片段被用作為引物或探針，僅需要序列足夠互補(bǔ)，能在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)即可。能促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格條件是，例如，大約45°C下，6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50°C用2. OxSSC洗滌，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可在Current Protocols in Molecular Biology(1989)中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自:50°C 下大約2. OxSSC的低嚴(yán)格性，至50°C下大約0. 2xSSc的高嚴(yán)格性。此外，洗滌步驟的溫度可以從室溫，即約22°C下的低嚴(yán)格性條件至約65°C下的高嚴(yán)格性條件。溫度和鹽可都改變， 或者，溫度或者鹽濃度可以保持恒定，其它變量改變。用于本發(fā)明的核酸可以在所述條件下可以與來自WCR的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列特異性雜交。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的核酸將與序列表中SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906所示的一種或多種核酸分子具有至少大約80 %，或者至少大約90 %，或者至少大約95 %，或者至少大約98 %，或者甚至大約100 % 的序列同一性。本發(fā)明的核酸還可以是通過本領(lǐng)域已知的方法完全或部分合成的。因此本發(fā)明核酸的全部或部分可以是使用選則的宿主偏好的密碼子來合成的。物種偏好的密碼子可以通過，例如，從在特定宿主物種中表達(dá)的蛋白中使用最頻繁的密碼子來確定。對核苷酸序列的其它修飾可以得到具有輕微改變的活性的突變體。dsRNA或SiRNA核苷酸序列包含聚合的核糖核苷酸的雙鏈，并且可以包含對磷酸-糖主鏈或核苷的修飾。RNA結(jié)構(gòu)的修飾可以進(jìn)行調(diào)整，以允許特異性遺傳抑制。在一種實(shí)施方式中，可通過酶方法對dsRNA分子進(jìn)行修飾，從而可以產(chǎn)生siRNA分子。siRNA可有效介導(dǎo)針對一些昆蟲中的一些靶基因的下調(diào)作用。這種酶方法可通過在真核RNAi途徑中利用昆蟲、脊椎動物、真菌或植物細(xì)胞中存在的RNAse III酶或DICER酶來完成(Elkishir 等人，2002 ；Hamilton和Baulcombe，1999)。該方法還可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解的通過重組DNA技術(shù)引入到靶昆蟲細(xì)胞中的重組DICER或RNAse III來進(jìn)行。天然存在于昆蟲中的或通過重組DNA技術(shù)制造的DICER酶和RNAse III能將較大的dsRNA鏈切割為較小的寡核苷酸。DICER酶能特異性地將dsRNA分子切割為siRNA片段，其中，每個siRNA片段的長度為大約19-25個核苷酸，而RNAse III酶通常將dsRNA分子切割為12-15個堿基對的 siRNA。通過上述任何酶產(chǎn)生的siRNA分子具有2至3個核苷酸的3’突出端和5’磷酸和 3’羥基末端。通過RNAse III酶產(chǎn)生的siRNA與在真核RNAi途徑中通過Dicer酶產(chǎn)生的那些相同，因此，然后可被靶定，并在隨后松散之后被內(nèi)在的細(xì)胞RNA降解機(jī)制降解，分離為單鏈RNA，并且與靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA序列雜交。這種方法導(dǎo)致對昆蟲中靶基因的核苷酸序列編碼的RNA序列進(jìn)行有效降解或除去。結(jié)果就是昆蟲中被特別靶定的核苷酸序列的沉默。對酶方法的細(xì)節(jié)描述可在Harmon(2002)中找到。本發(fā)明的核苷酸序列可被記錄到計算機(jī)可讀介質(zhì)上。本文中使用的“計算機(jī)可讀介質(zhì)”指可通過計算機(jī)直接閱讀和存取的有形表達(dá)介質(zhì)。此類介質(zhì)包括但不限于磁性存儲介質(zhì)，例如軟盤，硬盤，存儲介質(zhì)和磁帶；光學(xué)存儲介質(zhì)，例如CD-ROM ；電子存儲介質(zhì)，例如RAM和ROM ；光學(xué)字符識別格式的計算機(jī)文檔，以及上述種類的雜合體，例如，磁性/光學(xué)存儲介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識到，目前任何已知的計算機(jī)可讀介質(zhì)可被用于制造下述產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含記錄本發(fā)明的核苷酸序列的計算機(jī)可讀介質(zhì)。本文中使用的“記錄”指，用于在計算機(jī)可讀介質(zhì)上存貯信息的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地采用任何目前已知的方法來在計算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄信息，以產(chǎn)生包含本發(fā)明核苷酸序列信息的介質(zhì)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，多種不同的數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)是可獲得的，用于制造記錄本發(fā)明核苷酸序列的計算機(jī)可讀介質(zhì)。對數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)的選擇通常將基于選用來存取被存儲信息的手段。此外，多種不同的數(shù)據(jù)處理器程序和格式可用于將本發(fā)明核苷酸序列存儲到計算機(jī)可讀介質(zhì)上。序列信息可展示于字處理文本文檔中，以可通過商業(yè)途徑獲得的軟件，例如WordPerfect和Microsoft Word的格式，或者其可展示為 ASCII文本文檔的形式，存儲于數(shù)據(jù)庫應(yīng)用中，例如DB2、Sybase、0racle等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改編任何數(shù)量的數(shù)據(jù)處理器結(jié)構(gòu)化格式(例如，文本文檔或數(shù)據(jù)庫)，以獲得記錄有本發(fā)明核苷酸序列信息的計算機(jī)可讀介質(zhì)。允許本領(lǐng)域技術(shù)人員存取計算機(jī)可讀介質(zhì)中提供的序列信息的計算機(jī)軟件是公眾可獲得的。在Syl^ase系統(tǒng)上執(zhí)行BLAST (Altschul等人，1990)和BU^E (Brutlag等人， 1993)檢索算法的軟件可被用于鑒定序列中的讀碼框(ORF)，例如，本文提供的、含有與來自其它生物的ORF或蛋白的同源性的Unigene和EST。此類ORF是本發(fā)明序列中編碼蛋白質(zhì)的片段，可用于生產(chǎn)商業(yè)上重要的蛋白，例如，用于氨基酸生物合成、代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、 RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白質(zhì)修飾和DNA復(fù)制、限制、修飾、重組和修復(fù)的酶。本發(fā)明還提供了含有本文所述的序列信息的系統(tǒng)，特別是基于計算機(jī)的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)被設(shè)計為能鑒定出本發(fā)明的核酸分子中的商業(yè)上重要的片段。本文中使用的“基于計算機(jī)的系統(tǒng)”指用于分析本發(fā)明核苷酸信息的硬件設(shè)備、軟件設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲設(shè)備。本發(fā)明的基于計算機(jī)的系統(tǒng)的最小硬件設(shè)備包含中央處理器單元(CPU)、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲設(shè)備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地指導(dǎo)，目前可獲得的基于計算機(jī)的系統(tǒng)中任何一種都適合用于本發(fā)明。本文中使用的“靶結(jié)構(gòu)基序”或“靶基序”指，合理選出的任何序列或序列組合，其中，基于靶基序折疊時形成的三維構(gòu)型來選擇一種或多種序列。本領(lǐng)域已知多種靶基序。蛋白靶基序包括但不限于，酶活性位點(diǎn)和信號序列。核酸靶基序包括但不限于，啟動子序列、 順式作用元件、發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及誘導(dǎo)型表達(dá)元件(蛋白結(jié)合序列)。
B.重組載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化重組DNA載體可以是例如線性的或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或兩種或多種載體或質(zhì)粒，它們一起含有將被引入細(xì)菌宿主基因組中的總DNA。此外， 細(xì)菌載體可以是表達(dá)載體。序列表中的SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :906所示的核酸分子或其片段或其互補(bǔ)序列可以，例如，合適地插入到載體中，所述載體處于合適啟動子的控制之下，所述啟動子在一種或多種微生物宿主中發(fā)揮作用，以驅(qū)動所連接的編碼序列或其它DNA 序列的表達(dá)。為此目的，很多載體都是可獲得的，對合適載體的選擇將主要取決于要插入到載體中的核酸的大小以及將用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。每種載體都含有多種組分，這取決于其功能(擴(kuò)增DNA或表達(dá)DNA)以及與其相容的特定宿主細(xì)胞。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體組分通常包括但不限于下述組分中的一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種選擇標(biāo)記基因以及允許外源DNA表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子。表達(dá)和克隆載體通常含有選擇基因，其也被稱為選擇標(biāo)記。該基因編碼在選擇性培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長所必需的蛋白。典型的選擇基因編碼下述蛋白，所述蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如，氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)足營養(yǎng)缺陷，或(c)提供無法從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如，編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。這些被異源蛋白或其片段成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能產(chǎn)生賦予對藥物抗性的蛋白，由此能在選擇方案中存活。用于生產(chǎn)mRNA的表達(dá)載體還可含有下述誘導(dǎo)型啟動子，所述啟動子能被宿主細(xì)菌生物識別，并與下述核酸可操作地連接，所述核酸例如，編碼D. v. virgifera mRNA或其感興趣的片段的核酸。適合用于細(xì)菌宿主的誘導(dǎo)型啟動子包括內(nèi)酰胺酶啟動子，大腸桿菌λ噬菌體PL和ra啟動子，以及大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子以及乳糖操縱子啟動子及其變體和雜交啟動子，例如，tac啟動子。但是，其它已知的細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動子也是合適的。在提到調(diào)節(jié)序列和結(jié)構(gòu)核苷酸序列時，術(shù)語“可操作地連接”指，調(diào)節(jié)序列導(dǎo)致相連的結(jié)構(gòu)核苷酸序列的受調(diào)節(jié)的表達(dá)?！罢{(diào)節(jié)序列”或“控制元件”指位于結(jié)構(gòu)核苷酸序列上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3’非翻譯序列)的核苷酸序列，其能影響到相關(guān)結(jié)構(gòu)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的時機(jī)和水平或數(shù)量。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、阻遏物結(jié)合序列以及聚腺苷化識別序列寸?；蛘?，表達(dá)構(gòu)建體可隨整合載體被整合進(jìn)細(xì)菌基因組。典型地，整合載體含有與允許載體整合的細(xì)菌染色體同源的至少一種序列。整合看起來是載體DNA和細(xì)菌染色體中同源DNA之間的重組導(dǎo)致的。例如，用來自多種芽孢桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體能整合進(jìn)芽孢桿菌染色體(EP 0，127，328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。自殺載體也是本領(lǐng)域已知的。對含有一種或多種上面列出的組分的合適載體的構(gòu)建利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來進(jìn)行。對經(jīng)過分離的質(zhì)粒或DNA片段加以切割，剪切，并重新連接為產(chǎn)生所需質(zhì)粒想要的形式?？色@得的細(xì)菌表達(dá)載體的例子包括但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，例如，Bluescript (Stratagene, La Jolla，CA)，其中，例如，D. v. virgifera 蛋白或其片段能被連接進(jìn)載體，所述連接是以符合用于β -半乳糖苷酶氨基末端Met和隨后七個殘基的讀碼框的方式進(jìn)行的，由此產(chǎn)生雜合蛋白；PlN載體(Van Heeke和khuster，1989)等。典型地，酵母重組構(gòu)建體包括下述組分中的一種或多種啟動子序列、融合配偶體序列、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、選擇標(biāo)記。這些元件可以組合進(jìn)表達(dá)盒，表達(dá)盒可被保持于復(fù)制子中，例如染色體外元件(例如，質(zhì)粒)，其能穩(wěn)定保持于宿主(例如酵母或細(xì)菌)中。 復(fù)制子可以具有兩套復(fù)制系統(tǒng)，由此允許其被保持于例如，酵母中用于表達(dá)，以及保持于原核生物宿主中用于克隆和擴(kuò)增。此類酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括YEpM(Botstein等人，1979)、pCl/1 (Brake 等人，1984)和 YRpl7 (Stinchcomb 等人，1982)。此外，復(fù)制子可以是高或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒將通常具有大約5至大約200范圍內(nèi)的拷貝數(shù)，典型地，大約10至大約150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主將優(yōu)選具有至少大約10，更優(yōu)選至少大約20個拷貝。有用的酵母啟動序列可從編碼代謝途徑中酶的基因獲得。此類基因的例子包括醇脫氫酶(ADH) (EP 0觀4044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶和丙酮酸激酶(PyK) (ΕΡ0 3215447) 0編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也提供了有用的啟動子序列(Myanohara等人，1983)。此外，天然不存在的合成啟動子也可作為酵母啟動子發(fā)揮作用。此類雜交啟動子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域相連的ADH調(diào)節(jié)序列(美國專利號 4，876，197和4，880，734)。轉(zhuǎn)錄終止子序列和其它酵母識別的終止序列，如編碼編碼糖酵解酶的那些的例子，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；蛘撸磉_(dá)構(gòu)建體可隨整合載體被整合進(jìn)酵母基因組。典型地，整合載體含有與允許載體整合的酵母染色體同源的至少一種序列，并且優(yōu)選含有側(cè)翼于表構(gòu)建體的兩種同源序列。整合看起來是載體和酵母染色體中同源DNA之間的重組導(dǎo)致的(Orr-Weaver等人， 1983)。整合載體可以針對酵母中的特定基因座，這是通過選擇合適的同源序列包括進(jìn)載體來實(shí)現(xiàn)的。見上文所述的Orr-Weaver等人的文獻(xiàn)。一種或多種表達(dá)構(gòu)建體可以整合，可能影響產(chǎn)生的重組蛋白的水平(Rine等人，1983)。本發(fā)明還考慮將本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化進(jìn)植物，使得一種或多種dsRNA分子能以害蟲抑制水平表達(dá)。使用本領(lǐng)域可獲得的方法，可以容易地制備轉(zhuǎn)化載體。轉(zhuǎn)化載體包含一種或多種下述核苷酸序列，所述序列能被轉(zhuǎn)錄為RNA分子，并且與昆蟲基因組編碼的一種或多種核苷酸序列顯著同源和/或互補(bǔ)，使得攝取RNA時，會對昆蟲基因組中各個核苷酸序列中的至少一種的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)。轉(zhuǎn)化載體還可稱作dsDNA構(gòu)建體，其還可被定義為重組分子、昆蟲控制劑、遺傳分子或嵌合遺傳構(gòu)建體。本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體可包含，例如，編碼一種或多種反義轉(zhuǎn)錄物、一種或多種有義轉(zhuǎn)錄物、上述一種或多種物質(zhì)的核苷酸序列，其中，來自其的轉(zhuǎn)錄物的全部或部分與下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆蟲基因組中核苷酸序列編碼的RNA序列。在一種實(shí)施方式中，植物轉(zhuǎn)化載體包含分離和純化的DNA分子，其中包含與本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可操作地相連的啟動子。核苷酸序列選自序列表中的SEQ ID NO=I-SEQ ID N0:906。核苷酸序列包括下述片段，其編碼靶害蟲RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的RNA 的全部或部分，還包含靶害蟲RNA全部或部分的反向重復(fù)序列。包含表達(dá)載體的DNA分子還可含有功能性內(nèi)含子序列(其定位于編碼序列的上游或者甚至在編碼序列之中)，所述分子還可以含有五撇(5’ )非翻譯前導(dǎo)序列(即，UTR或5’ -UTR)，其定位于啟動子和翻譯起始位點(diǎn)之間。植物轉(zhuǎn)化載體可以含有來自一種以上基因的序列，由此允許一種以上的dsRNA產(chǎn)生，用于抑制靶害蟲細(xì)胞中兩種或多種基因的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，具有相應(yīng)于不同基因中存在的序列的序列的DNA片段可組合成單一的復(fù)合DNA片段，用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。或者，可對已含有至少一種DNA片段的本發(fā)明質(zhì)粒加以修飾，這是通過將額外DNA片段順序插入到增強(qiáng)子和啟動子和終止子序列之間來進(jìn)行的。在設(shè)計用來抑制多種基因的本發(fā)明昆蟲控制劑中，待抑制基因可從同一昆蟲物種中獲得，以增強(qiáng)昆蟲控制劑的效率。在某些實(shí)施方式中，基因可從不同的昆蟲獲得，以拓寬試劑的有效昆蟲范圍。當(dāng)為了阻抑或針對表達(dá)和阻抑的組合而靶定多種基因時，可以按照Fillatti，申請
發(fā)明者C·A·卡亞科布, G·R·赫克, G·普萊丁克, I·努倫, J·A·鮑姆, P·費(fèi)爾德曼, T·T·沃恩, W·馬德萊因 申請人:孟山都技術(shù)有限公司