專利名稱：乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、引物及其探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域、特別涉及一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法、弓I物及其探針。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)是一種高危險(xiǎn)性的病毒，乙型肝炎病毒感染在世界范圍廣泛流行，乙肝病毒感染不僅可導(dǎo)致急、慢性病毒性肝炎，而且還可發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌、每年導(dǎo)致大約100萬(wàn)人死亡、嚴(yán)重影響了人類的健康。乙肝病毒吸附并進(jìn)入肝細(xì)胞后脫去衣殼、在DNA聚合酶作用下、以負(fù)鏈DNA為模板修補(bǔ)正鏈空隙、從而形成共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈 DNA進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄。在乙肝病毒的復(fù)制過(guò)程中，由于RNA的反轉(zhuǎn)錄缺乏讀碼校正功能、 所以容易導(dǎo)致堿基錯(cuò)配的發(fā)生，因而病毒基因突變十分頻繁，乙肝病毒的變異率是其它DNA 病毒的10倍左右。病毒的變異導(dǎo)致病毒耐藥株的出現(xiàn)，耐藥株的出現(xiàn)是與病毒的高變異率和免疫壓力以及各種抗病毒治療藥物誘導(dǎo)變異等綜合因素的結(jié)果。隨著抗病毒藥物治療的廣泛開(kāi)展，病毒變異和耐藥株不斷出現(xiàn)，一個(gè)位點(diǎn)的突變甚至可以引起對(duì)多種藥物的交叉耐藥。拉米夫定(lamivudine、LAM)是一種雙脫氧核苷類似物，拉米夫定作用于乙肝病毒基因開(kāi)放閱讀框的P區(qū)后，能迅速抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制，使血清轉(zhuǎn)氨酶降至正常水平。長(zhǎng)期服用拉米夫定可顯著改善肝臟炎癥性壞死、減輕或阻止肝臟纖維化的進(jìn)程。然而由于乙肝病毒超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子的存在，短期用藥很難治愈乙型肝炎，拉米夫定的用藥必須在一年以上；拉米夫定的長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致病毒耐藥，患者在服用該藥后 6 8個(gè)月即可能出現(xiàn)耐藥的病毒株，隨著服藥時(shí)間的延長(zhǎng)，耐藥率明顯增加。研究表明，長(zhǎng)期服用拉米夫定藥物，乙肝病毒DNA的P區(qū)204位的YMDD基序的蛋氨酸會(huì)被纈氨酸、異亮氨酸或被絲氨酸所取代、分別生成YVDD、YIDD或YSDD、三者均對(duì)拉米夫定耐藥、YV/IDD是被廣泛報(bào)道和研究的突變類型；YSDD變異是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的變異類型，這種變異株是從 1例接受拉米夫定治療18個(gè)月患者的血清中發(fā)現(xiàn)的，體外轉(zhuǎn)染研究也證實(shí)了這種YSDD變異株對(duì)拉米夫定耐藥，大量測(cè)序研究表明，拉米夫定耐藥的病毒株在204位密碼子發(fā)生突變的同時(shí)常會(huì)出現(xiàn)180位密碼子的聯(lián)合突變，即180位的亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?，生成rtL180M。現(xiàn)有技術(shù)中拉米夫定的耐藥突變檢測(cè)的方法主要有直接測(cè)序法、錯(cuò)配PCR限制性片斷多態(tài)性分析法、基因芯片法、焦磷酸測(cè)序法、高效變性液相色譜法(DHPLC)和實(shí)時(shí)定量 PCR等。這些方法各有利弊、并且有些檢測(cè)方法的弊端暫時(shí)還沒(méi)有較好的解決辦法。1、直接測(cè)序法DNA直接測(cè)序法一直被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。很多學(xué)者都曾利用直接測(cè)序法或結(jié)合其他方法檢測(cè)乙肝病毒YMDD基序變異、但由于直接測(cè)序法在大多數(shù)情況會(huì)要求將目標(biāo)序列先進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接到載體，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且必須送到測(cè)序公司完成測(cè)序，顯然不適合于乙肝病毒的快速診斷和大規(guī)模的檢測(cè)。另外，直接測(cè)序法對(duì)于含量低的病毒以及混合突變的病毒檢測(cè)顯得不夠靈敏，對(duì)于野生、突變混合型或不同突變型混合存在的病毒，大多數(shù)情況下只能檢測(cè)到其中的一種DNA含量較高的優(yōu)勢(shì)病毒株；當(dāng)然、直接測(cè)序法能檢測(cè)新發(fā)突變位點(diǎn)是它的最大優(yōu)勢(shì)。2、錯(cuò)配PCR和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)錯(cuò)配PCR技術(shù)最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰島素基因缺陷的檢查、目前已廣泛應(yīng)用于基因點(diǎn)突變的檢測(cè)。根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的不同、可將錯(cuò)配PCR分為間接和直接錯(cuò)配PCR;間接錯(cuò)配PCR的引物與野生型完全互補(bǔ)，突變株不能PCR擴(kuò)增；直接錯(cuò)配PCR的引物與特定的點(diǎn)突變完全互補(bǔ)，野生株不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RFLP技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶專一性識(shí)別切割DNA序列的特點(diǎn)，不同的序列就會(huì)被切割成長(zhǎng)短不一的DNA片段， 再通過(guò)凝膠電泳觀察酶切結(jié)果，然后對(duì)酶切圖像進(jìn)行多態(tài)性分析找出差異。Allen等研究表明，錯(cuò)位PCR和RFLP聯(lián)合檢測(cè)YMDD的突變株是十分精確的，有人認(rèn)為在檢測(cè)野生型病毒和突變型病毒混合存在的樣本時(shí)RFLP比直接測(cè)序法更敏感。盡管如此，錯(cuò)位PCR-RFLP技術(shù)也是有缺陷的，該方法對(duì)于低濃度的突變和混合突變檢測(cè)敏感性不太高、且操作較復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)等。3、基因芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生物學(xué)研究中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生化分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列為分析對(duì)象的基因芯片，固體芯片表一定的陣列集成了大量的特異目標(biāo)探針，它能與待測(cè)的有熒光標(biāo)記的樣品核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)雜交反應(yīng)，通過(guò)激光共聚焦系統(tǒng)檢測(cè)到雜交信號(hào)、數(shù)據(jù)資料經(jīng)由計(jì)算機(jī)分析處理、最后獲取樣品的各種信息，完成對(duì)核酸序列的大規(guī)模高通量分析。基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因突變的檢測(cè)，且檢測(cè)精度很高，對(duì)于檢測(cè)耐藥乙肝病毒是可靠和有用的一種工具；生物芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法相比具有高通量、 微型化、自動(dòng)化、成本低、防污染等特點(diǎn)，其缺點(diǎn)是費(fèi)用很高、數(shù)據(jù)可能需要專業(yè)的生物信息學(xué)人員分析、只能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn)等。4、焦磷酸測(cè)序技術(shù)焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由Nyren等人于1987年發(fā)展起來(lái)的一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)、該技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，當(dāng)引物與模板DNA 退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、 測(cè)序引物和4種酶構(gòu)成。該技術(shù)可以用在研究單核苷酸多態(tài)性(SNP)、遺傳多態(tài)性、植物多態(tài)性分析、分子診斷細(xì)菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學(xué)等方面。該技術(shù)不需要凝膠電泳、也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。宋家武等，應(yīng)用該技術(shù)建立了高通量測(cè)定乙型肝炎病毒YMDD突變區(qū)的方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的YMDD突變質(zhì)粒及血清標(biāo)本的重復(fù)性及可靠性檢測(cè)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的突變檢出率及重復(fù)率均達(dá)100%，而血清標(biāo)本達(dá)98.8%。然而焦磷酸測(cè)序技術(shù)需要購(gòu)買(mǎi)專門(mén)的實(shí)驗(yàn)儀器、只能精確檢測(cè)大約40bp左右的堿基，而傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)可對(duì)500bp堿基進(jìn)行檢測(cè)。可見(jiàn)，焦磷酸測(cè)序技術(shù)更適于對(duì)已知突變位點(diǎn)的大規(guī)模檢測(cè)，而不適于對(duì)大范圍基因突
6變的篩選，這正好滿足臨床上對(duì)乙肝病毒YMDD突變檢測(cè)的需求。5、變性高效液相色譜(DHPLC)DHPLC技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的分析技術(shù)，DHPLC亦稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析，其利用在部分變性條件下同源、異源雙鏈DNA解鏈特征的差異進(jìn)行變異檢測(cè)。 另外在非變性條件或完全變性條件下，DHPLC還可用于分離、分析雙鏈或單鏈核酸片段，它是分離核苷酸片段及分析檢測(cè)已知未知基因突變和SNP的最佳技術(shù)平臺(tái)，其核心技術(shù)采用 Transgenomic公司專利技術(shù)的DNA Sepcartridge分離柱。柱溫是決定DHPLC敏感性的最關(guān)鍵因素，先把野生型和突變型PCR產(chǎn)物等比例混合，將柱溫升高使DNA片段開(kāi)始變性，在部分變性的溫度條件下，變異型和野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性復(fù)性過(guò)程，形成同源雙鏈，同時(shí)也錯(cuò)配形成異源雙鏈。由于異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，被色譜柱保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被較低濃度的乙腈洗脫下來(lái)，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，異源雙鏈將被測(cè)序以識(shí)別可能的突變位點(diǎn)；完全匹配的同源雙鏈在目標(biāo)產(chǎn)物處出現(xiàn)一個(gè)單峰。陳發(fā)林等，通過(guò)該方法檢測(cè)結(jié)果顯示野生型YMDD的圖形呈單峰，而變異型YIDD、YVDD的DHPLC圖形呈現(xiàn)3峰，且峰型低矮、寬大、與野生型YMDD的 DHPLC圖形明顯不同。DHPLC具有快速、高通量、靈敏性更高、特異性更強(qiáng)、廉價(jià)省時(shí)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但是、它對(duì)待檢樣本的PCR擴(kuò)增要求比較高，不但有PCR引物設(shè)計(jì)、PCR條件控制、擴(kuò)增片斷最適長(zhǎng)度的要求，還對(duì)PCR樣品的質(zhì)量和含量、擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性有較高要求。PCR擴(kuò)增特異性差時(shí)，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，以致檢測(cè)失敗。現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有一種熒光定量PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸試劑
品.ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有高度的特異性、 靈敏度與準(zhǔn)確性、且技術(shù)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應(yīng)液其中包括DEPC處理水、具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX熒光定量 PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、rtM204I/V(YM/I/VDD)檢測(cè)特有的rt204位點(diǎn)正向引物、 rt204位點(diǎn)反向引物和rt204M/rt204I/rt204V位點(diǎn)探針以及rtL180M檢測(cè)特有的rtl80位點(diǎn)正向引物、rt 180位點(diǎn)反向引物和rtl80L/rtl80M位點(diǎn)探針；①rt204位點(diǎn)正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3'；rt204位點(diǎn)反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3'；rt204M 位點(diǎn)探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示5' CATCATCCATATAACTG 3'；
rt204I 位點(diǎn)探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 4 所示5' CACATCATCAATATAACT 3'；rt204V 位點(diǎn)探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 5 所示5' TCATCCACATAACTG 3'；②rtl80位點(diǎn)正向引物如序列表中SEQ ID NO. 6所示 5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA3‘；rtl80位點(diǎn)反向引物如序列表中SEQ ID NO. 7所示 5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA3‘；rtl80L 位點(diǎn)探針序列如序列表中 SEQ ID NO. 8 所示5 ‘ CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M 位點(diǎn)探針序列如序列表中 SEQ ID N0. 9 所示5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；其中，以上所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中， Y = (C/T)、R = A/G ；O) DNA 提取液①溶液A，為聚乙二醇6000 ；②溶液B，其中包括EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris_HCl、 NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA片段；②陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為 1. 0X 106copy/mL 的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應(yīng)基因組的 DNA 片段，檢測(cè) rtL180M 時(shí)，為 1. 0 X 106copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；③臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為1. 0X 104copy/mL的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應(yīng)基因組的 DNA 片段，檢測(cè) rtL180M 時(shí)，為 1. 0 X 104copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；(4)工作標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為 PSG-TS rt204 的質(zhì)粒 DNA，該質(zhì)粒是在 PSG-TS 載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)rtL180M時(shí)，為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在 PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖，具體包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品 1，為 1. OX 107copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X107copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標(biāo)準(zhǔn)品 2，為 1. OX 106copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；c、工作標(biāo)準(zhǔn)品 3，為 1. OX 105copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標(biāo)準(zhǔn)品 4，為 1. OX 104copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液。所述具有5，一 3，外切活性的DNA聚合酶為T(mén)aq酶。
所述熒光定量PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5 μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動(dòng)Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為lOmmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10X熒光定量PCR Buffer用量5 μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L、濃度為10 μ mol/L的正向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的反向引物用量1.6yL、濃度為10 μ mol/L的探針用量lyL。其中檢測(cè)rtM204I/V時(shí)，PCR反應(yīng)液中包含的引物為rt204位點(diǎn)正向引物和rt204位點(diǎn)反向引物，探針為rt204M位點(diǎn)探針、rt204I位點(diǎn)探針和rt204V位點(diǎn)探針；檢測(cè)rtL180M 時(shí)，PCR反應(yīng)液中包含的引物為rtl80位點(diǎn)正向引物和rtl80位點(diǎn)反向引物，探針為rtl80L 位點(diǎn)探針、和rtl80M位點(diǎn)探針；所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述乙二胺四乙酸(SDS)濃度為0. 5% ；所述 Tris-HCl的pH值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。本發(fā)明實(shí)施例還提供利用所述的試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測(cè)血清100 μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心 1011^11，去上清，加入5(^1^裂解溶液8充分混勻后，在1001加熱lOmin，再次13000rpm離心lOmin，取上清液待測(cè)；(3)加樣向裝有45 μ L熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品5 μ L，蓋好管蓋，5000rpm離心10秒；(4)熒光定量PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類、樣品名稱及類型，按下列條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；94 "C 5 分鐘；94 °C 30 秒、58 °C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；95°C 30秒、58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)，在反應(yīng)程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽(yáng)性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于等于觀且小于等于32的為臨界陽(yáng)性。進(jìn)一步地，當(dāng)需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，另取4個(gè)反應(yīng)管，直接加入不同濃度梯度的工作標(biāo)準(zhǔn)品5 μ L，5000rpm離心10秒，放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。本發(fā)明還提供一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針，
包括下述正向引物、反向引物和熒光探針的一組序列①204位點(diǎn)引物和探針rt204位點(diǎn)正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3'；rt204位點(diǎn)反向引物序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3'；rt204M位點(diǎn)探針序列如序列表中SEQ ID N0. 3所示5' CATCATCCATATAACTG 3'；
rt204I位點(diǎn)探針序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示5' CACATCATCAATATAACT 3'；rt204V位點(diǎn)探針序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示5' TCATCCACATAACTG 3'；②180位點(diǎn)引物和探針rtl80位點(diǎn)正向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示5' TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3'；rtl80位點(diǎn)反向引物序列如序列表中SEQ ID NO. 7所示5' AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3'；rtl80L位點(diǎn)探針序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M位點(diǎn)探針序列如序列表中SEQ ID N0. 9所示5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長(zhǎng)的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用、或以所有序列組之間的任意組合形式而使用；其中，所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光染料修飾。其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU, NEP ；3，端修飾的熒光染料可選自TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是本發(fā)明試劑盒利用特異性的 TaqMan探針來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒，檢測(cè)完成后無(wú)需開(kāi)蓋電泳，避免了產(chǎn)物污染及對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的傷害。本發(fā)明可用LNA探針、MGB探針、AllGlo 探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)檢測(cè)克服了擴(kuò)增產(chǎn)物終點(diǎn)檢測(cè)所存在的“平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)產(chǎn)物定量的影響；本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥毒株，試劑盒可以單用和多重檢測(cè)乙肝病人的拉米夫定耐藥情況，熒光定量PCR方法改進(jìn)為“2步法”，避免了 PCR延伸的步驟、探針可以標(biāo)記多種熒光標(biāo)記，同時(shí)還具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。且技術(shù)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高；由于采用閉管操作，不需要PCR產(chǎn)物后處理，有效解決PCR污染問(wèn)題等特點(diǎn)，結(jié)果可靠。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rt204三重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rtl80 二重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E和圖3F是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rt204重組質(zhì)粒倍比稀釋擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果圖4A、圖4B、圖4C和圖4D本發(fā)明實(shí)施例1中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rtl80重組質(zhì)粒倍比稀釋擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果圖；圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E和圖5F是本發(fā)明實(shí)施例2中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rt204位點(diǎn)YMDD/YIDD/YVDD分別檢測(cè)樣本的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6A、圖6B、圖6C和圖6D是本發(fā)明實(shí)施例2中提供的拉米夫定耐藥位點(diǎn)rtl80 位點(diǎn)180L/180M分別檢測(cè)樣本的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖1、圖2、圖3A、圖3C、圖3E、圖4A、圖4C、圖5A、圖5C、圖5E、圖6A和圖6C中的橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)(Cycle number)、縱坐標(biāo)表示熒光值(Delta Rn)；圖3B、圖3D、圖3F、圖4B、圖4D、圖5B、圖5D、圖5F、圖6B和圖6D中橫坐標(biāo)表示 LogCo (乙肝病毒起始濃度的對(duì)數(shù)值)、縱坐標(biāo)表示Ct值。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚、下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有熒光定量PCR反應(yīng)液、其中包括DEPC處理水、Taq酶、dNTPs、10X熒光定量PCR Buffer、 含有Mg2+離子的溶液、正向引物、反向引物、探針；溶液A，為聚乙二醇6000 ；溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tri s-HCl、NP-40 ；陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS質(zhì)粒DNA片段；陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè) rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為 1. O X 106copy/mL 的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rtL180M時(shí)，為1. O X 106copy/mL的含有rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為1. OX 104copy/mL 的含有rt204M/rt204I/rt204V相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rtL180M時(shí)，為1. O X IO4Copy/ mL的含有rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；工作標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)rtM204I/V (YM/I/VDD) 的工作標(biāo)準(zhǔn)品為PSG-TS rt204的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)rtL180M的工作標(biāo)準(zhǔn)品為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。試劑盒的制造1.試劑本試劑盒制造過(guò)程中所用的試劑主要購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。2.熒光定量PCR反應(yīng)液制備(1)引物及探針設(shè)計(jì)與合成選擇乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的P基因的特異突變位點(diǎn)區(qū)域片段作為目標(biāo)檢測(cè)基因，通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，獲得乙型肝炎病毒目前已有的8個(gè)基因型的乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)的基因序列，并通過(guò) VectorNTIAdvance 11軟件分別對(duì)8個(gè)基因型的相應(yīng)耐藥突變位點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行序列比對(duì)，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針。rt204M序列如序列表中SEQ ID NO. 10所示
CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrt204I序列如序列表中SEQ ID NO. 11所示CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATATTGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrt204V序列如序列表中SEQ ID NO. 12所示CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TTATGTGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTrtl80L序列如序列表中SEQ ID NO. 13所示GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAA TTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGC TTTCCCCrtl80M序列如序列表中SEQ ID NO. 14所示GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAA TTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCT TTCCCC。利用實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR的專業(yè)設(shè)計(jì)軟件I^rimer Express 3.0設(shè)計(jì)引物、探針序列。引物、探針序列不僅要滿足軟件中各項(xiàng)指標(biāo)，而且要確保引物、探針序列能檢測(cè)全部8個(gè)基因型序列。在本發(fā)明中，探針的5，端修飾的熒光染料可選自FAM、HEX、TET、J0E、 VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP, SAT、PLU, NEP 或 URA ;3’ 端修飾的熒光染料可選自TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL 等。設(shè)計(jì)結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(1)熒光定量PCR反應(yīng)液其中包括DEPC處理水、具有5，一3，外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOX熒光定量 PCRBuffer、含有Mg2+離子的溶液、rt204位點(diǎn)正向引物、rt204位點(diǎn)反向引物、rt204M位點(diǎn)探針、rt204I位點(diǎn)探針、rt204V位點(diǎn)探針、rtl80位點(diǎn)正向引物、rtl80位點(diǎn)反向引物和 rtl80L位點(diǎn)探針、rtl80M位點(diǎn)探針；①204位點(diǎn)引物和探針rt204 位點(diǎn)正向引物序列為5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3‘； rt204 位點(diǎn)反向引物序列為5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3‘； rt204M 位點(diǎn)探針序列為5, CATCATCCATATAACTG 3'； rt204I 位點(diǎn)探針序列為5, CACATCATCAATATAACT 3'； rt204V 位點(diǎn)探針序列為5, TCATCCACATAACTG 3'；②180位點(diǎn)引物和探針r1180 位點(diǎn)正向引物為5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘； r1180 位點(diǎn)反向引物為5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘； rtl80L 位點(diǎn)探針序列為5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'； rtl80M 位點(diǎn)探針序列為5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；其中，上述探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中，Y = (C/T), R = A/G；O) DNA提取液①溶液A，為聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl和乙基苯基聚乙二醇；(3)質(zhì)控品①陰性質(zhì)控品，為不含外源片段的PSG-TS載體質(zhì)粒DNA；②陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為 1. 0X 106copy/mL 的含有 rt204M/ rt204I/rt204V相應(yīng)基因組的DNA片段，檢測(cè)rtL180M時(shí)，為1. 0X 106copy/mL的含有 rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；③臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為1.0X 104copy/mL的含有 rt204M/rt204I/rt204V 相應(yīng)基因組的 DNA 片段，檢測(cè) rtL180M 時(shí)，為 1. 0 X 104copy/mL 的含有rtl80L/rtl80M相應(yīng)基因組的DNA片段；(4)工作標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)rtM204I/V(YM/I/VDD)時(shí)，為PSG-TS rt204的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rt204M/rt204I/rt204V區(qū)間的133個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；檢測(cè)rtL180M時(shí)，為PSG-TS rtl80的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒是在PSG-TS 載體中插入了乙型肝炎病毒基因組中含有rtl80L/rtl80M區(qū)間的151個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段所得的重組質(zhì)粒；該2個(gè)重組質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5 α中增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其中熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、VIC、ROX, Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3’ 端修飾的熒光染料選自TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B組成；所述溶液A，為聚乙二醇6000 ；所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括a、工作標(biāo)準(zhǔn)品1，為 1.0X107copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. 0 X IO7Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；b、工作標(biāo)準(zhǔn)品2，為 1. 0X106copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO6Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；C、工作標(biāo)準(zhǔn)品 3，為 1. 0X105copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO5Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液；d、工作標(biāo)準(zhǔn)品 4，為 1. 0X104copy/mL 的 PSG-TS rt204 質(zhì)粒 DNA 溶液或 1. OX IO4Copy/ mL 的 PSG-TS rtl80 質(zhì)粒 DNA 溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶為T(mén)aq酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)液各組分含量的配比為DEPC處理水用量27. 5μ L ；濃度為5U/ μ L的熱啟動(dòng)Taq酶用量0. 3 μ L ；濃度為lOmmol/L的dNIPs用量1 μ L ;10X熒光定量PCR Buffer用量5μ L ；濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量7 μ L，濃度為ΙΟμπιοΙ/L的正向引物用量1.6yL、濃度為lOymol/L的反向引物用量1.6yL、濃度為lOymol/L的探針用量 IyL0
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述聚乙二醇6000的濃度為15% ；所述乙二胺四乙酸濃度為0.5% ；所述Tris-HCl的 PH值為8. 0 ；所述乙基苯基聚乙二醇的濃度為0. 1%。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下列步驟(1)采集樣品采集人血漿樣品，離心分離，上清即為血清樣品；(2)樣品處理取待測(cè)血清100μ L，加入等量15%溶液Α，混勻，13000rpm離心IOmin, 去上清，加入50 μ L裂解溶液B，充分混勻后，在100°C加熱10min，13000rpm再離心IOmin, 取上清液待測(cè)；(3)加樣向裝有45μ L熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的樣品、 陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品各5 μ L，蓋好管蓋，5，OOOrpm離心 10秒；(4)熒光定量PCR擴(kuò)增將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置標(biāo)記熒光基團(tuán)種類、樣品名稱及類型，按下列條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增； 94 0C 5分鐘；(94 0C 30 秒，58 °C 45 秒，5 個(gè)循環(huán)；(940C 30秒，58°C 45秒，35個(gè)循環(huán)；收集熒光信號(hào)，在反應(yīng)程序的第二步的終了讀取熒光Ct值；(5)分析判斷Ct值小于觀的為陽(yáng)性；Ct值大于32的為陰性；Ct值大于或等于觀且小于或等于32的為臨界陽(yáng)性。
9.一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針，包括下述正向引物、反向引物和熒光探針的一組序列①204位點(diǎn)引物和探針rt204 位點(diǎn)正向引物序列為5' GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3‘； rt204 位點(diǎn)反向引物序列為5' TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3 ‘； rt204M 位點(diǎn)探針序列為5, CATCATCCATATAACTG 3'； rt204I 位點(diǎn)探針序列為5, CACATCATCAATATAACT 3'； rt204V 位點(diǎn)探針序列為5, TCATCCACATAACTG 3'；②180位點(diǎn)引物和探針r1180 位點(diǎn)正向引物為5 ‘ TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3 ‘；r1180 位點(diǎn)反向引物為5 ‘ AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3 ‘；rtl80L 位點(diǎn)探針序列為5' CGTTTCTCYTGGCTCA 3'；rtl80M 位點(diǎn)探針序列為5' CGTTTCTCATGGCTC 3'；或者在上述序列的5’端和/或3’端有延長(zhǎng)的核苷酸片段的一組序列；或者與上述序列的同源性大于85%的一組序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)的一組序列；上述的任意一組序列可單獨(dú)使用、或以所有序列組之間的任意組合形式而使用； 其中，所述探針的5’端和3’端分別用熒光基團(tuán)修飾；所述引物序列中Y = (C/T)、R = (A/G)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)引物和探針、其特征在于，其中，熒光探針的5，端修飾的熒光染料選自FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、 Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU 或 NEP ；3，端修飾的熒光染料選自=TAMRA, Eclipse、BHQU BHQ2、 BHQ3 或 DABCYL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥核酸定量檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、引物及其探針。本試劑盒包括熒光定量PCR反應(yīng)液，其中包括DEPC處理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×熒光定量PCR Buffer、含有Mg2+離子的溶液、rt204位點(diǎn)正向引物、rt204位點(diǎn)反向引物、rt204M位點(diǎn)探針、rt204I位點(diǎn)探針、rt204V位點(diǎn)探針、rt180位點(diǎn)正向引物、rt180位點(diǎn)反向引物和rt180L位點(diǎn)探針、rt180M位點(diǎn)探針；試劑盒中還包括DNA提取液、陰性質(zhì)控品、工作標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性質(zhì)控品和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥毒株，熒光定量PCR方法改進(jìn)為“2步法”，避免了PCR延伸的步驟；探針可以標(biāo)記多種熒光標(biāo)記，同時(shí)還具有特異、靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102251059SQ20111019423
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉緒, 唐景峰, 王業(yè)富 申請(qǐng)人:武漢百泰基因工程有限公司