專利名稱：德國小蠊kdr突變等位基因檢測試劑盒及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種德國小蠊kdr突變等位基因檢測試劑盒及其專用引物。
背景技術(shù)：
德國小蠊(Blattella germanica)是常見的室內(nèi)害蟲之一，能夠攜帶細菌、病毒、 寄生蟲卵等，導(dǎo)致多種疾病的傳播，同時德國小蠊分泌物或死亡蟲體能導(dǎo)致機體過敏。化學(xué)防制因?qū)嵤┓奖?、見效較快而得到廣泛應(yīng)用。在各類化學(xué)殺蟲劑中，擬除蟲菊酯因具有高效、快速、低潴留及低毒等優(yōu)點而被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲的防制，但不久就發(fā)現(xiàn)多種昆蟲對這類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。德國小蠊由于廣泛使用相對單一的化學(xué)藥物防制，用藥頻繁，生活世代又較短，其抗藥性問題日漸突出，引起廣泛關(guān)注。研究表明德國小蠊對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯等均產(chǎn)生了不同程度抗性?？剐缘漠a(chǎn)生嚴重地影響到媒介德國小蠊的防治。而抗性檢測和監(jiān)測是預(yù)防抗性發(fā)生和發(fā)展的前提，是抗性治理工作的基礎(chǔ)。目前，蚊類抗藥性的檢測方法，一直沿用1970世界衛(wèi)生組織推薦的生物測定法， 測出害蟲對藥劑的敏感毒力(LD-p)基線和LD5tl或LC5tl值。再從測試地區(qū)采集同種害蟲種群，采用與測定敏感品系相同的生測方法和控制條件，得出待測種群的LD-p線和LD5tl或 LC50 {t,以待測種群與敏感種品系的LD5tl或LC5tl值之間的比值(即抗性倍數(shù))來表示抗性水平。但該方法對所獲得資料有嚴格的統(tǒng)計要求，必須嚴格控制試驗條件，需反復(fù)多次試驗， 而且在實踐中亦顯示出較明顯的局限性。傳統(tǒng)的生物測定法比較繁瑣，從蟲源、飼養(yǎng)到測定難于做到真正的標(biāo)準(zhǔn)化，而且由LD-p線求出的LD5tl或LC5tl值的重復(fù)性和精確性較低，當(dāng)群體抗性較低和抗性種群多樣時很難準(zhǔn)確測定，因此測得的抗性水平往往具有滯后性，不適合早期抗性檢測，不利于制定相應(yīng)的防治對策。鑒于目前許多抗性對策依賴于抗性的早期檢測，因此抗性監(jiān)測與檢測技術(shù)的研究尤顯重要。隨著抗性監(jiān)測和檢測目的的多元化，抗性監(jiān)測手段和方法也朝著多元化方向發(fā)展。害蟲抗藥性分子檢測技術(shù)是基于對害蟲抗藥性機制了解的基礎(chǔ)上建立起來的，即利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測殺蟲劑作用靶標(biāo)的抗性位點或解毒代謝酶基因的增強表達?；诳刹僮餍?、實用性和經(jīng)濟等方面的原因，目前幾乎所有的抗性檢測研究都集中于靶標(biāo)抗性方面，即檢測靶標(biāo)基因的突變。對德國小蠊抗性機理的研究表明，電壓控制的鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶點，鈉離子通道的神經(jīng)敏感性降低而引起的抗性，稱為擊倒抗性 (knockdownresistance, kdr)，德國小蠊鈉離子通道 II S4-II S6 結(jié)構(gòu)域的 L993F(第 993 氨基酸Leu —(突變?yōu)?？&，第四79核苷酸G—(突變?yōu)?C)突變是導(dǎo)致kdr機制的分子基礎(chǔ)。Kdr型抗性機理的分子水平的研究推動了害蟲藥性的分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展。 kdr基因特異性等位基因聚合酶鏈反應(yīng)(PASA)技術(shù)就是其中一種比較簡單易行和準(zhǔn)確的方法。分別在一端設(shè)計兩條野生型或突變型引物，突變型引物的突變堿基設(shè)計在引物的3 ‘ 端，另一端設(shè)計一條共同引物。利用Taq酶缺乏3' v5'外切酶活性的特點，在以突變型引物擴增正常DNA模板時，在其3'端就形成了錯配，延伸反應(yīng)就會因磷酸酯鍵難于形成而不能進行，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變；如果PCR結(jié)果能得到特異長度擴增條帶，表明模板DNA上具有與引物3'堿基相對應(yīng)的突變。若將野生型和突變型引物分別用于同一 DNA模板的擴增，即可根據(jù)擴增片段的凝膠電泳直接診斷出有無某種基因突變。與限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)和單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析技術(shù) (SSCP)等其它分子生物學(xué)檢測方法相比，PASA技術(shù)省去了任何形式的DNA探針分子雜交或限制性內(nèi)切酶酶切，也不需要標(biāo)記引物。與傳統(tǒng)的生物測定相比，PASA技術(shù)能區(qū)分表現(xiàn)型相同而基因型不同的雜合子和敏感純合子，因而能檢測很低的抗性基因頻率，為抗性早期治理提供理論指導(dǎo)。但是，目前還沒有成型的針對德國小蠊的kdr突變等位基因檢測方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的引物。本發(fā)明提供的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4。所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。所述引物組A和所述引物組B為獨立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比為(3-5) (5-7) (8-10), 所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比具體為3 7 10 ；所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比為(3-5) (5-7) (8-10), 所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比具體為3 7 10 ；所述突變位點為L993F。本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的PCR試劑。本發(fā)明提供的試劑，由試劑A和試劑B組成；所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成；所述各引物組中各引物在對應(yīng)的所述PCR試劑中的濃度均為所述引物1的終濃度為0. 12-0. 2uM,所述引物1的終濃度具體為0. 12uM ；所述引物2的終濃度為0. 28-0. 2uM, 所述引物2的終濃度具體為0. 28uM ；所述引物3、4終濃度均為0. 32-0. 4uM，所述引物3、引物4的終濃度均具體為0. 4uM。所述突變位點為L993F。PCR緩沖液為試劑T，購自寶生物工程有限公司，產(chǎn)品號DR011。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的試劑的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)分別將所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A和獨立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A和步驟1)得到的獨立包裝引物組B進行包裝，得到試劑；所述突變位點為L993F。由所述方法制備得到的試劑也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒；所述試劑盒B為含有所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有所述的試劑的試劑盒；所述突變位點為L993F。所述引物或所述試劑或所述試劑盒在檢測德國小蠊中kdr基因突變位點、檢測德國小蠊抗藥性或制備檢測德國小蠊抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述突變位點為L993F，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測待測德國小蠊中kdr基因突變位點的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述的引物或所述試劑或所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測德國小蠊進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；檢測各組引物擴增得到的產(chǎn)物，若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，則所述待測德國小蠊的kdr基因的突變位點為L993F ；所述139bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列8。本發(fā)明的第六個目的是提供一種檢測待測德國小蠊中kdr基因型的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述的引物或所述試劑或所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測德國小鐮進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；檢測各組引物擴增得到的產(chǎn)物，若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A未擴增得到大小為 139bp產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為含有突變位點L993F的純合型基因；若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A擴增得到大小為 139bp產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為含有突變位點L993F的雜合型基因；若所述引物對B未擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A擴增得到大小為 139bp產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為不含突變位點L993F的純合型基因；
所述139bp產(chǎn)物1的核苷酸序列為序列表中的序列7所述139bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述PCR擴增中，以待測德國小鐮的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴增的退火溫度具體為65°C ；所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。以上PCR擴增中，所述引物組A或B中的引物1和引物2進行PCR擴增，得到擴增大小為275bp產(chǎn)物；所述275bp產(chǎn)物的核苷酸序列為序列表中的序列6 ；該產(chǎn)物可以用來檢測PCR反應(yīng)體系是否正確，如果有275bp產(chǎn)物，說明該體系正確。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的德國小蠊kdr突變等位基因檢測試劑盒，用來掌握德國小蠊與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的kdr等位基因的狀況。本發(fā)明的kdr突變等位基因檢測試劑盒針對德國小蠊kdr等位基因的基因型，分別設(shè)計了 2組特異性引物，經(jīng)過一定的配比合成，可以檢測德國小蠊的kdr基因型。采用本發(fā)明的kdr突變等位基因檢測試劑盒，只需提取單只德國小蠊的DNA，因此對待測德國小蠊的數(shù)量沒有特殊的要求，另外還無需德國小蠊的飼養(yǎng)場所和設(shè)施，也不需要投入長時間的人力物力來觀察。獨立1人2小時內(nèi)即可完成50份樣本的檢驗，被檢樣本能夠準(zhǔn)確、有效、直接地檢測出點突變，能夠鑒定個體基因型。判斷kdr相關(guān)的基因型為研究德國小鐮對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性奠定基礎(chǔ)。


圖1為特異性等位基因PCR法方法檢測德國小鐮Kdr基因型
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、德國小鐮kdr突變等位基因檢測一、PCR 擴增1、引物的設(shè)計 針對德國小蠊鈉離子通道的基因序列kdr (未突變，Accession number U73583. 1)設(shè)計特異性引物CD1 5，-GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3，(序列 1，下游引物)CD2 5，-AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3，(序列 2，上游引物)CD3 5，-CCACTGTCGTCATTGGAAACTTG-3，(序列 3，下游引物)根據(jù)kdr 的突變體 kdr L993F 型突變基因(Accession number :U73584. 1)設(shè)計的特異性引物CD1 5，-GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3，(序列 1，下游引物)CD2 :5，-AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3，(序列 2，上游引物)CD4 5 ‘-CCACTGT CGT CAT TGG AAA CTT C-3，(序列 4，下游引物)2、基因組DNA獲得分別提取野外捕獲的編號為1-3的德國小蠊的基因組DNA，備用，得到編號為1_3的待測樣本的DNA。3、待測樣本的DNA的PCR擴增(擴增體系如表1)(1)分別取12uL試劑T(寶生物工程有限公司，產(chǎn)品號DR011，具體組成見表2)加入到2個PCR管中，標(biāo)記為管A (試劑A)和管B (試劑B)。(2)在管A中加入2uL試劑P1，在管B中加入2uL試劑P2。(3)取 9uLddH20 至管 A 和管 B 中。(多個樣本檢測時，根據(jù)以上的配比，分A和B管將試劑混合后分裝，效果更好)(4)每種待測樣品的DNA分別取2uL加入到管A和管B中。(5)將以上的管A和管B蓋好后，放入PCR儀中，按以下條件設(shè)置反應(yīng)條件(為了使試劑混勻，稍微離心效果更好)。表1為PCR擴增體系
試劑T 試劑P CMH2O 模板(DNA)
A管 12uL 2uLP! 9uL 2uL
B管 12uL 2uL P2 9uL 2uL
Bggggga^wwwwww .................................................................................................................................................................................. 表2為T試劑的配方
mssmmsmsmsummmmmm^mxmx^mifmifmifmmmmm...................................................................布 0. 28uM
成如下
TaKaRa Taq dNTP Mixture
Taq Buffer 色素Marker
比重增加物穩(wěn)定劑
所述試劑P1為針對德國小蠊未突變基因特異性引物混合物，組成如下
1.25U/25UL 2xconc.;各 0.4mM 2xconc.; 3mMMg2+ Tartrazine/Xylene Cyanol FF
CDl :5’ -GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3’ CD2 5' -AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3' CD3 5' -CCACTGTCGTCATTGGAAACTTG-3'
所有引物溶解稀釋成10uM，CDl的終濃度具體為0. 12uM ；CD2的終濃度具體為 ⑶3的終濃度具體為0. 4uM。
P1 由CD1，CD2和CD3混合而成，配制體積比例為CD1 CD2 CD3 = 3 7 10 (CDl，CD2和CD3在試劑Pl中的質(zhì)量比為3 7 10)。
所述試劑P2為針對德國小蠊kdr L993F型突變基因設(shè)計的特異性引物混合物，組
CDl :5’ -GATATGCCGAGATGGAACTTTACG-3’ CD2 5' -AATATCCCTGACCAACCTGTGAA-3‘
CD4 :5’ -CCACTGTCGTCATTGGAAACTTC-3’所有引物溶解稀釋成10uM，引物終濃度為⑶1的終濃度具體為0. 12uM ；⑶2的終濃度具體為0. 28uM ；⑶3的終濃度具體為0. 4uM。P2 由⑶1，⑶2和⑶4混合而成，配制體積比例為⑶1 ⑶2 ⑶4 = 3 7 10(⑶1，⑶2和⑶4在試劑Pl中的質(zhì)量比為 3 7 10)。。所述ddH20為滅菌蒸餾水。3、PCR擴增條件
權(quán)利要求
1.一種檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的引物，由引物組A和引物組B組成 所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和所述引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于所述引物組A還包括引物1，所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述引物組A和所述引物組B為獨立包裝；所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比為(3-5) (5-7) (10_8)，所述引物組A中所述引物1、引物2和引物3的質(zhì)量比具體為3 7 10 ；所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比為(3-5) (5-7) (10_8)，所述引物組B中所述引物1、引物2和引物4的質(zhì)量比具體為3 7 10 ； 所述突變位點為L993F。
4.一種制備檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的PCR試劑，由試劑A和試劑B組成； 所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成；所述各引物組中各引物在對應(yīng)的所述PCR試劑中的濃度均為所述引物1的終濃度為 0. 12-0. 2uM，所述引物1的終濃度具體為0. 12uM ；所述引物2的終濃度為0. 28-0. 2uM，所述引物2的終濃度具體為0. 28uM ；所述引物3、4終濃度均為0. 32-0. 4uM，所述引物3、引物4 的終濃度均具體為0. 4uM ； 所述突變位點為L993F。
5.一種制備檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的試劑的方法，包括如下步驟1)分別將權(quán)利要求1或2所述的引物中的所述引物組A和所述引物組B進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A和獨立包裝引物組B ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A和步驟1)得到的獨立包裝引物組B進行包裝，得到試劑；所述突變位點為L993F。
6.由權(quán)利要求5所述方法制備得到的試劑。
7.—種檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A和試劑盒B組成；所述試劑盒A為含有權(quán)利要求4所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒； 所述試劑盒B為含有權(quán)利要求4所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有權(quán)利要求6所述的試劑的試劑盒； 所述突變位點為L993F。
8.權(quán)利要求1-3中任一所述引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒在檢測德國小蠊中kdr基因突變位點、檢測德國小蠊抗藥性或制備檢測德國小蠊抗藥性產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一種檢測待測德國小蠊中kdr基因突變位點的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測德國小蠊進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物； 檢測各組引物擴增得到的產(chǎn)物，若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，則所述待測德國小蠊的kdr基因的突變位點為L993F ；所述139bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列8。
10.一種檢測待測德國小蠊中kdr基因型的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物或權(quán)利要求4或6所述試劑或權(quán)利要求7所述試劑盒中的所述引物組A中的所述引物2和所述引物3作為引物對A和用所述引物組B中的所述引物2、所述引物4作為引物對B分別對待測德國小鐮進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物； 檢測各組引物擴增得到的產(chǎn)物，若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A未擴增得到大小為 139bp產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為含有突變位點L993F的純合型基因；若所述引物對B擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A擴增得到大小為139bp 產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為含有突變位點L993F的雜合型基因；若所述引物對B未擴增得到大小為139bp產(chǎn)物2，且所述引物對A擴增得到大小為 139bp產(chǎn)物1，則所述待測德國小鐮的kdr基因為不含突變位點L993F的純合型基因； 所述139bp產(chǎn)物1的核苷酸序列為序列表中的序列6 所述139bp產(chǎn)物2的核苷酸序列為序列表中的序列7 ； 所述PCR擴增中，以待測德國小鐮的基因組DNA為模板； 所述PCR擴增的退火溫度為62-65°C，所述PCR擴增的退火溫度具體為65°C ； 所述檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種德國小蠊kdr突變等位基因檢測試劑盒及其專用引物。本發(fā)明提供了檢測德國小蠊中kdr基因突變位點的引物，由引物組A和引物組B組成所述引物組A包括引物2和引物3組成，所述引物組B包括引物2和引物4組成；本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的德國小蠊抗藥性檢測試劑盒，用來掌握德國小蠊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性狀況。
文檔編號C12N15/11GK102251040SQ20111020249
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者劉美德, 張映梅, 李春曉, 汪中明, 董言德, 趙彤言, 邢丹, 郭曉霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所