本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及油菜bnaspt3基因在促進(jìn)雙子葉植物角果生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

油菜是我國(guó)主要的油料作物之一，油菜的種植及產(chǎn)量直接影響到我國(guó)的油料食品安全。而且在世界范圍內(nèi)，油菜在油料作物中的地位也是重中之重。目前我國(guó)油菜的產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)的需求，提高油菜的產(chǎn)量是當(dāng)務(wù)之急。角果是油菜產(chǎn)量構(gòu)成因素中重要的組成部分，角果及角果相關(guān)性狀對(duì)油菜產(chǎn)量具有直接或者間接的作用。油菜角果作為油菜的結(jié)實(shí)器官，不僅是重要的貯藏器官，也是重要的光合器官，具有“庫(kù)”和“源”的雙重作用。角果的生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，角果長(zhǎng)度是影響油菜產(chǎn)量的重要因素，培養(yǎng)長(zhǎng)角果可以提高油菜的產(chǎn)量潛力。因此，研究和開(kāi)發(fā)關(guān)于油菜角果發(fā)育控制的遺傳資源，提高油菜的生產(chǎn)水平，對(duì)于增加國(guó)家和地方財(cái)政收入，解決“三農(nóng)”問(wèn)題和新農(nóng)村建設(shè)具有十分重要的意義。

雌蕊是種子植物的雌性繁殖器官，由心皮、花柱和子房組成并最終發(fā)育成果實(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育情況對(duì)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量有決定性的影響。spatula(spt)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在植物花器官發(fā)育過(guò)程中起到重要作用的基因。近年來(lái)，spt在模式植物擬南芥中已有深入的研究。

擬南芥spatula基因除了可以調(diào)控雌蕊的發(fā)育外，在子葉、葉片、根、果實(shí)等器官中都有作用，同時(shí)對(duì)種子的萌發(fā)也起到了一定的作用。所以可以說(shuō)spt的功能貫穿了植物的整個(gè)生命周期，但是spt的主要功能是在雌蕊受精之前影響雌性器官的發(fā)育。在擬南芥spt突變體中，spt功能缺失會(huì)導(dǎo)致隔膜和頂端心皮融合缺陷，以及傳輸束喪失和柱頭組織發(fā)育的減少，角果發(fā)育缺陷、短小、結(jié)實(shí)率低。

趙燕等(2009)從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中克隆到了與spt相關(guān)的同樣影響心皮發(fā)育的crc基因，轉(zhuǎn)化到具有心形外型心皮形態(tài)的薺菜，篩選到轉(zhuǎn)crc基因的薺菜植株，crc基因在薺菜中的組成型表達(dá)對(duì)薺菜心皮形態(tài)和大小都產(chǎn)生一定影響。

楊樸麗等(2013)以結(jié)球甘藍(lán)為材料，提取花蕾總rna，反轉(zhuǎn)錄cdna。根據(jù)擬南芥spt基因設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆的方法從中克隆spt基因，序列1085bp，開(kāi)放閱讀框1062bp。原核表達(dá)該蛋白，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其具有bhlh家族結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)表明結(jié)球甘藍(lán)bospt與擬南芥atspt和筷子芥alspt的親緣關(guān)系較近。

許俊強(qiáng)等(2014)以結(jié)球甘藍(lán)自交不親和系e1為材料，提取雌蕊總rna，根據(jù)擬南芥中spt和hec1基因設(shè)計(jì)引物，采用同源克隆方法克隆spt基因和hec1基因。兩基因在各器 官中均表達(dá)，但spt在果實(shí)和雌蕊中表達(dá)量最高，而hec1在根和花蕾中的表達(dá)量最高。運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證spt和hec1蛋白能夠相互作用，可能形成異源二聚體共同調(diào)控雌蕊發(fā)育。

目前有關(guān)油菜中spatula基因的功能研究未見(jiàn)報(bào)道，鑒于spatula基因在其他植物中調(diào)控雌蕊發(fā)育的作用，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段研究油菜spatula基因與角果發(fā)育的潛在聯(lián)系，對(duì)于提高作物產(chǎn)量具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種油菜bnaspt3基因在促進(jìn)雙子葉植物角果生長(zhǎng)中的應(yīng)用，在擬南芥等雙子葉植物中表達(dá)外源基因油菜bnaspt3，能夠促進(jìn)擬南芥角果生長(zhǎng)發(fā)育。

油菜bnaspt3基因在促進(jìn)雙子葉植物角果生長(zhǎng)中的應(yīng)用，所述油菜bnaspt3基因的堿基序列如seqidno.1所示。

角果是十字花科植物特有的果實(shí)類型，因此，所述雙子葉植物為十字花科植物。作為優(yōu)選，所述雙子葉植物為油菜、亞麻薺、薺菜、甘藍(lán)、山崳菜或擬南芥。

所述應(yīng)用，包括：

(1)將油菜bnaspt3基因連入植物表達(dá)載體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體；

(2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體植物中。

重組表達(dá)載體的構(gòu)建可采用常規(guī)方法，如采用gateway系統(tǒng)(invitrogen公司)將油菜基因bnaspt3連入植物表達(dá)載體中。

所述植物表達(dá)載體為ph2gw7或pk2gw7。

所述的重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述油菜bnaspt3基因表達(dá)的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子。強(qiáng)啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)油菜bnaspt3基因過(guò)表達(dá)。作為優(yōu)選，所述的強(qiáng)啟動(dòng)子為35s。

轉(zhuǎn)化受體植物時(shí)，可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，所述的農(nóng)桿菌具體可以為農(nóng)桿菌lab4404、gv3101或eha105等。

所述受體植物為油菜、亞麻薺、薺菜、甘藍(lán)、山崳菜或擬南芥。所述擬南芥的品種可以為columbia及l(fā)andsbergerecta，但不僅限于columbia及l(fā)andsbergerecta。更為優(yōu)選，受體植物為擬南芥野生型或擬南芥spt2、spt12突變體。

利用所述的油菜bnaspt3基因?qū)M南芥spt突變體等雙子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，bnaspt3的過(guò)量表達(dá)不僅能夠恢復(fù)擬南芥突變體的短小角果表型，而且其在野生型中的過(guò)量表達(dá)也能夠顯著促進(jìn)擬南芥角果生長(zhǎng)。

本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，包括原始載體和插入所述原始載體的目的基因，所述目的基因的堿基序列如seqidno.1所示。

所述重組表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子。作為優(yōu)選，所述強(qiáng) 啟動(dòng)子為35s。

所述原始載體為ph2gw7或pk2gw7。

本發(fā)明還提供了一種包含所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。

所述的轉(zhuǎn)化子中，宿主菌為農(nóng)桿菌gv3101、lab4404或eha105。

利用所述轉(zhuǎn)化子侵染受體植物，即可實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)載體對(duì)受體植物的轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明具備的有益效果：本發(fā)明通過(guò)克隆油菜bnaspt3基因，并在擬南芥中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，過(guò)量表達(dá)外源油菜bnaspt3基因，能夠顯著提高擬南芥spt突變體角果的大小，恢復(fù)種子數(shù)量。借助基因工程技術(shù)使油菜bnaspt3基因在受體中超表達(dá)，改善角果大小，有助于高產(chǎn)研究。

基于模式植物擬南芥與其他雙子葉植物的密切關(guān)系，本發(fā)明在擬南芥的促進(jìn)角果生長(zhǎng)中得到很好應(yīng)用，證明本發(fā)明的油菜bnaspt3基因也可以應(yīng)用到其他雙子葉植物中促進(jìn)其角果的發(fā)育。

附圖說(shuō)明

圖1為野生型(col、ler)和擬南芥突變體(spt12、spt2)及轉(zhuǎn)基因植株(35s::bn3spt12、35s::bn3spt2)不同株系角果表型照片。

圖2為實(shí)施例3中油菜bnaspt3基因轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株得到的角果的長(zhǎng)度對(duì)比圖，其中col-0為擬南芥野生型，bnaspt3oe-1、bnaspt3oe-2和bnaspt3oe-3為轉(zhuǎn)基因擬南芥。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。

實(shí)施例1油菜bhlh轉(zhuǎn)錄因子bnaspt3基因過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建和擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

(1)取油菜(brassicanapus)葉片，液氮研磨，加入rnaiso試劑(takara公司)，提取rna。取1μgrna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cdna。

(2)根據(jù)genbank上的bnaspt3(bnaa08g15580d)基因序列設(shè)計(jì)特異引物，分別在引物5’端加上salⅰ和notⅰ限制性酶切位點(diǎn)，序列如下：

引物1：5’-gcgtcgacatggctgataagaaattgatttcatct-3’；

引物2：5’-ttgcggccgctcaactaagtcgatcttttaggtcaggt-3’。

(3)以全長(zhǎng)cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

采用高保真酶hsdnapolymerase(takaracode：dr010a)體系：

5×primestarbuffer(mg²⁺plus)10μl，

dntpmixture(各2.5mm)4μl，

引物1(10μm)1μl，

引物2(10μm)1μl，

模板cdna1μl，

hsdnapolymerase0.5μl，

滅菌蒸餾水加至總體積50μl。

pcr循環(huán)條件為：98℃預(yù)變性5分鐘，98℃變性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸90秒，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，結(jié)束反應(yīng)。

(4)將pcr產(chǎn)物回收后通過(guò)酶切連接到gateway克隆系統(tǒng)入門載體pentr1a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，測(cè)序并分析，bnaspt3基因序列如seqidno.1所示。

(5)將測(cè)序正確的含bnaspt3全長(zhǎng)cds的pentr1a質(zhì)粒與過(guò)量表達(dá)載體ph2gw7進(jìn)行l(wèi)r交換反應(yīng)。

使用gatewaylrclonasetmenzymemix(invitrogen公司，cat.no.11791-019)，體系如下：entryclone(入門載體)50-150ng，destinationvector(目的載體)150ng，5×lrclonasereactionbuffer2μl，ddh2oupto8μl，加入2μllrclonaseenzymemix，短暫渦旋兩次混勻，輕微離心，于25℃水浴8h，然后加入1μlproteinaseksolution(蛋白酶k溶液)混勻，37℃放置10分鐘結(jié)束反應(yīng)。

取5μl反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，挑取pcr驗(yàn)證陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

(6)從-80℃冰箱中取出gv3101感受態(tài)細(xì)胞，利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101。

感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，取2μl左右的目的質(zhì)粒加到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后置于冰上30min，再將離心管內(nèi)的所有混合物加到預(yù)冷的電擊杯內(nèi)，冰上放置。打開(kāi)伯樂(lè)電轉(zhuǎn)儀，程序調(diào)至agr，吸取1ml的lb液體營(yíng)養(yǎng)基，將電擊杯凸點(diǎn)朝內(nèi)推入電轉(zhuǎn)儀，按一下plus鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲，迅速拿出電擊杯，并向電擊杯杯加入1ml的lb液體營(yíng)養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管內(nèi)，放在eppendorf混合儀內(nèi)28℃，700rpm搖2.5h以上，涂布于抗性yep平板上(rif(利福平)50mg/l，spec(鹽酸大觀霉素)100mg/l)，28℃倒置培養(yǎng)2個(gè)晚上以至長(zhǎng)出單菌落。

(7)挑取長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌單克隆，到含有相應(yīng)抗生素的5mlyep液體培養(yǎng)基中(相應(yīng)抗生素為rif50mg/lspec100mg/l)，28℃150rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。將搖的菌按體積比1:10加入yep液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素)28℃，培養(yǎng)至od600>1。

(8)用擬南芥花浸法轉(zhuǎn)化擬南芥。

1)將果莢去除干凈、僅剩下花序的擬南芥整株與穴盤一起倒扣于已轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌液里，浸苗5min，期間不斷地?fù)u晃菌液；

2)侵染完后，取出植株，側(cè)放于托盤內(nèi)，覆蓋避光的黑色塑料布，放置在生長(zhǎng)室內(nèi)，24h 后揭開(kāi)；

3)將擬南芥植株置于自然光照的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每周澆1-2次水，待種子成熟后，收獲t0代種子；

4)將收獲的t0代種子殺菌消毒后，種植在ms+50mg/lkanamycin的固體培養(yǎng)基內(nèi)，4℃黑暗春化3d后，將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察擬南芥植株的生長(zhǎng)狀況。具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因種子將會(huì)在篩選培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)基因的種子萌發(fā)后不久就白化死去。

實(shí)施例2擬南芥角果的性狀觀察

擬南芥spt2、spt12突變體的角果比野生型要短小，在中間靠近頂端部分比較扁平，我們選擇spt2、spt12突變體作為轉(zhuǎn)基因受體。

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行角果長(zhǎng)度測(cè)量記錄，如圖1所示，在擬南芥角果發(fā)育不良的突變體中過(guò)量表達(dá)油菜bnaspt3基因(如seqidno.1所示的序列)，使突變體的角果長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)，恢復(fù)到野生型水平。

借助基因工程技術(shù)使功能基因在受體中超表達(dá)，改善角果大小，有助于高產(chǎn)研究。

實(shí)施例3

為了檢測(cè)油菜基因bnaspt3的過(guò)量表達(dá)是否能夠促進(jìn)擬南芥野生型角果生長(zhǎng)，我們也以擬南芥野生型植株columbia為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因受體進(jìn)行了功能驗(yàn)證。

對(duì)收獲的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行角果長(zhǎng)度測(cè)量記錄，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示。在擬南芥野生型中過(guò)量表達(dá)油菜bnaspt3基因，可以促進(jìn)角果生長(zhǎng)，顯著大于未轉(zhuǎn)化的擬南芥野生型植株。

我們的實(shí)驗(yàn)成果以模式植物擬南芥為背景，證明油菜bnaspt3基因可以促進(jìn)雙子葉植物角果的生長(zhǎng)。