專利名稱：基于環(huán)介導等溫擴增檢測甘薯腐爛莖線蟲的試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物寄生線蟲檢測技術領域，具體涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增檢測甘薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)的試劑盒及其應用。
背景技術：
甘薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)，又稱甘薯莖線蟲或腐爛莖線蟲， 最早被發(fā)現(xiàn)于馬鈴薯上，導致馬鈴薯腐爛，因此也被稱為馬鈴薯腐爛莖線蟲(Potato rot nematode)。甘薯腐爛莖線蟲是一種遷移性植物內寄生線蟲，主要危害植物地下部，尤其是塊莖和球莖等。甘薯腐爛莖線蟲寄主范圍非常廣，已知的寄主有120多種，受害最重的是馬鈴薯、甘薯等塊莖作物和一些球莖花卉。甘薯腐爛莖線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要的植物寄生線蟲，也是我國和許多其他國家和地區(qū)的檢疫性危險線蟲。我國是世界上甘薯的主產(chǎn)國，常年甘薯種植面積在600萬hm2左右，占世界總面積的70%左右。甘薯我國許多省區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構調整中的優(yōu)勢作物，正逐步向效益型經(jīng)濟作物轉變。目前，甘薯莖線蟲病已成為制約我國甘薯生產(chǎn)的三大嚴重病害之一，近年來業(yè)已上升為北方薯區(qū)最嚴重的病害，一般發(fā)病田塊減產(chǎn)20%-50%,重病田塊基本上絕產(chǎn)無收。如何控制腐爛莖線蟲的危害，提高甘薯種植效益，成為當前亟待解決的問題。對甘薯腐爛莖線蟲的快速檢測技術是防治此病的重要方法。有效的預防和控制甘薯莖線蟲病的傳播和蔓延對于確保我國農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的安全，保證我國農(nóng)產(chǎn)品出口符合進口國植物檢疫要求，以及保證進境種苗和農(nóng)產(chǎn)品的安全，有效抵御外來有害生物入侵都有著重要的作用。近年來一些依據(jù)形態(tài)學特征所進行的多歧分類和數(shù)值分類法提高了對某些線蟲類群鑒定的準確性。但是由于線蟲許多表型特征的保守性，再加上寄主及環(huán)境條件的差異， 因此線蟲在種內也存在著一定的變異范圍，而且有的線蟲種間的形態(tài)測量值又存在重疊的現(xiàn)象，因此以傳統(tǒng)的形態(tài)學和鑒別寄主反應為基礎的分類法不僅主觀、繁瑣，而且難以可靠地分析和鑒別近似種間、種內生理小種或致病型間存在的差異。而且鑒定所需時間很長，甚至還要經(jīng)過作物的一個生長季節(jié)才能得出結果，這對于現(xiàn)時的經(jīng)濟模式，尤其是檢驗檢疫來說是難以接受的。有鑒于此，近年來，植物線蟲學家嘗試發(fā)展了甘薯莖線蟲的分子檢測技術。如利用 PCR-RFLPs技術對莖線蟲屬里三個重要的相似種腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor), 食菌莖線蟲(D.myceliophagus)和鱗球莖線蟲(D. dipsaci) 7個不同寄主族進行了區(qū)分 (Karen, 1993)。如利用ITS-PCR區(qū)分甘薯腐爛莖線蟲的A型和B型群體。這些方法和傳統(tǒng)手段相比，更為迅速可靠，沒有季節(jié)、蟲態(tài)和數(shù)量的限制。然而，以常規(guī)PCR為基礎的分子檢測，需要相對高質量的線蟲DNA模板，擴增和檢測需要多個儀器設備，且整個過程需要數(shù)個小時，對于需要快速通關的植物檢疫部門和條件簡陋的基層農(nóng)技部門來說，這些分子檢測方法的實用性受到限制。因此，需要開發(fā)新型的、快速、簡便、可靠且低成本的甘薯腐爛莖線蟲檢測手段。已發(fā)現(xiàn)我國危害甘薯的馬鈴薯腐爛摹線蟲rDNA-ITS基因片段長度存在A型 (900bp)和B型(IlOObp) 2個類型，A型腐爛莖線蟲群體的ITS片段比B型群體少200bp。 這兩種類群的劃分，通過對^S rDNA-D2/D3區(qū)系統(tǒng)分析得到了證實(于海英，彭德良，胡先奇，黃文坤馬鈴薯腐爛莖線S^S rD NA-D2/D3區(qū)序列分析。植物病理學報，2009，39 (3) 254-261)。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification，簡稱 LAMP)技術是日本榮研公司開發(fā)的一種新的恒溫核酸擴增技術，利用能識別靶序列上6個位點的4個特殊設計的引物和一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶，在60-65°C恒溫條件下，對核酸進行等溫擴增，且在1小時內擴增效率可達到IO9-IOltl個數(shù)量級。擴增產(chǎn)物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。和常規(guī)擴增方法相比，該技術主要優(yōu)點體現(xiàn)在如下幾個方面1)該方法僅需水浴或金屬浴等恒溫裝置，以提供實現(xiàn)核酸擴增的條件，不需要熱循環(huán)儀；幻特異性高，采用4/6條特異引物識別目的基因上的6/8個區(qū)域；幻擴增速度快，效率高，1小時內擴增效率達到IO9-IOltl個數(shù)量級，可在30-60分鐘內獲得結果；4)結果判定簡單，擴增產(chǎn)生大量產(chǎn)物和焦磷酸鎂沉淀，無需電泳，結果可經(jīng)肉眼直接判斷，結合使用熒光染料或試紙條，檢測結果更為靈敏可靠，結合專門開發(fā)的濁度儀，可實時觀測擴增進程，可使檢測時間縮短至15分鐘。目前已經(jīng)應用于食品安全、環(huán)境微生物、農(nóng)業(yè)病害及醫(yī)學診斷等領域。目前尚未見采用環(huán)介導等溫擴增方法檢測甘薯腐爛莖線蟲的試劑盒及方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導等溫擴增檢測甘薯腐爛莖線蟲 (Ditylenchus destructor)的試劑盒及其應用。本發(fā)明提供了輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的專用引物，由三組引物組成；第一組引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；第二組引物由序列表的序列5所示DNA、序列表的序列6所示DNA、 序列表的序列7所示DNA、序列表的序列8所示DNA、序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA組成；第三組引物由序列表的序列11所示DNA、序列表的序列12所示DNA、 序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA組成。所述專用引物可用于制備試劑盒；所述試劑盒用于輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲和/ 或檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲。本發(fā)明還保護一種含有所述專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲和/或檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲。所述試劑盒還可含有Bst DNA聚合酶。所述試劑盒還可含有5倍LAMP反應液和/或樣品預處理液。所述5倍LAMP反應液具體可由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述5倍LAMP反應液中的濃度如下5mM dNTPUOOmM Tris-鹽酸(pH8. 8)、50mM氯化鉀、50mM硫酸銨、20mM硫酸鎂、IOmM氯化鎂、0.5mM氯化錳、25 μ M鈣黃綠素、0.5% (體積比)曲拉通Χ-100和2Μ甜菜堿。所述樣品預處理液具體可由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述樣品預處理液中的濃度如下50mM氯化鉀、IOmM Tris (pH8. 2)、2. 5mM氯化鎂、60 μ g/mL蛋白酶K、0. 45% (體積比)吐溫20和0.01% (g/100mL)明膠。所述試劑盒還可包括陽性對照質粒丙和/或陽性對照質粒甲和/或陽性對照質粒乙。所述陽性對照質粒丙具體可為將序列表的序列17所示的DNA插入PGEM-T easy質粒的NcoI和NotI酶切位點之間得到的重組質粒。所述陽性對照質粒甲具體可為將序列表的序列15所示的DNA插入PGEM-T easy質粒的NcoI和NotI酶切位點之間得到的重組質粒。所述陽性對照質粒乙具體可為將序列表的序列16所示的DNA插入PGEM-T easy質粒的NcoI和NotI酶切位點之間得到的重組質粒。所述專用弓I物可用于輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲。所述專用弓I物可用于檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的方法，是分別用所述專用引物中的三組引物對待測線蟲的基因組DNA進行環(huán)介導等溫擴增，然后進行如下(1)和/或(2)和 /或⑶(1)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲；(2)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲；(3)采用所述第一組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶， 待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲。所述待測線蟲具體可為象耳豆根結線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、A型甘薯腐爛莖線蟲或B型甘薯腐爛莖線蟲。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定待測植物樣本中是否感染甘薯腐爛莖線蟲的方法，是分別用所述專用引物中的三組引物對待測植物樣本的基因組DNA進行環(huán)介導等溫擴增，然后進行如下⑴和/或⑵和/或(3)(1)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲；(2)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲；(3)采用所述第一組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶， 待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似含有B型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲。以上任一所述的方法中，所述環(huán)介導等溫擴增的反應體系具體可為所述基因組 DNA 5 μ 1，引物母液1 μ 1，所述5倍LAMP反應液5 μ 1，所述Bst DNA聚合酶(8υ/μ1)1μ1， 雙蒸水13 μ 1。所述引物母液為DdU-LAMP引物母液、DdA-LAMP引物母液或DdB-LAMP引物母液。所述DdU-LAMP引物母液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下:DdU-F3 5 μ Μ、DdU-B3 5 μ Μ、DdU-FIP 40 μ M 禾口 DdU-BIP 40 μ Μ。所述 DdA-LAMP 引物母液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下DdA-F3 5 μ Μ、DdA-B3 5 μ Μ、DdA-FIP 40 μ Μ、DdA-BIP 40 μ Μ、DdA-LP 20 μ M 禾口 DdA-BP 20 μ Μ。所述DdB-LAMP引物母液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下:DdB-F3 5 μ Μ、DdB_B3 5 μ Μ、DdB-FIP 40 μ M 禾口 DdB-BIP 40 μ Μ。以上任一所述的方法中，所述環(huán)介導等溫擴增的條件具體可為63°C水浴50分鐘，然后80°C加熱5分鐘終止反應。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，優(yōu)點如下(1)操作簡單LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需要水浴鍋或金屬模塊即可，產(chǎn)物檢測用肉眼觀察、瓊脂糖凝膠電泳或濁度儀檢測即可判斷，不需要特殊的試劑及儀器。
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(2)快速高效因為不需要預先的雙鏈DNA熱變性，避免了溫度循環(huán)而造成的時間損失。樣品檢測全程可在1. 5小時內均可完成，本發(fā)明添加了環(huán)狀引物后時間可以節(jié)省1/2，多數(shù)情況在 20-30分鐘均可檢測到擴增產(chǎn)物，且產(chǎn)物可以擴增至IO9倍，達0.5mg/ml。應用專門的濁度儀可以達到實時定量檢測。(3)高特異性由于本發(fā)明是針對靶序列6個區(qū)域設計的4種特異性引物，引物的延伸端有著高度的序列選擇性，與其他近緣線蟲相應序列不匹配，不能進行核酸擴增。故其特異性極高。(4)高靈敏度擴增模板可達fg級，比PCR高出數(shù)量級的差異，加上本發(fā)明針對基因組中存在多拷貝的rDNA-ITS區(qū)，擴增靈敏度進一步提高。(5)假陽性率低LAMP反應常用的STOR Green在有DNA雙鏈存在的條件下即可染色，無法證明實驗結果為LAMP擴增，本發(fā)明使用鈣黃綠素取代STOR Green熒光劑成分，只有在發(fā)生LAMP反應的前提下才會產(chǎn)生顏色變化，陽性率更高，且無需反應后加入，減少了檢測操作環(huán)節(jié)。(6)適用性強，成本低、技術依賴性小本試劑盒可采用不同方法進行結果判讀，各使用單位可以根據(jù)自身條件，靈活選擇一種或結合使用，特別適合基層農(nóng)技人員使用。本發(fā)明設計特異性的引物并優(yōu)化反應條件，提供了一種輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的試劑盒，應用該試劑盒可使檢測達到種間和種下水平，解決常規(guī)分子檢測成本高、效率低、速度慢，不能滿足當前植物檢疫和植物保護需要的難題。


圖1為實施例2的步驟二的反應液顏色觀察圖片。圖2為實施例2的步驟三的反應液顏色觀察圖片。圖3為實施例2的步驟四的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4為實施例3的瓊脂糖凝膠電泳圖；A 采用DdU-F3、DdU-B3、DdU-FIP和DdU-BIP 組成的引物組合物；B 采用DdA-F3、DdA-B3、DdA-FIP、DdA-BIP、DdA-LP和DdA-BP組成的引物組合物；C 采用DdB-F3、DdB-B3、DdB-FIP和DdB-BIP組成的引物組合物。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實驗樣本為如下7種根結線蟲象耳豆根結線蟲(M. enterolobii，簡稱Me)公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得；參考文獻Tiganoa M, de Siqueiraa K, Castagnone-Serenob P, Muletb K, Queiroza P, dos Santosa M,Teixeiraa C,Almeidaa M,Silvaa J,Carneiroa R. Genetic diversity of theroot-knot nematode Meloidogyne enterolobii and development of a SCAR marker for this guava-damaging species. Plant Pathology,2010,59 (6) : 1054—1061。南方根結線蟲(Meloidogyne incognita，簡稱Mi):公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲 U :Zijlstra C, Donkers-Venne DTHM, Fargette Μ, 2000. Identification of Meloidogyne incognita. M. javanica and M. arenaria using sequence characterised amplified region(SCAR)based PCR assays. Nematology 2,847-53.。爪哇根結線蟲(Μ. javanica簡稱Mj)公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得；參考文獻 Zijlstra C, Donkers-Venne DTHM, Fargette M,2000. Identification of Meloidogyne incognita, Μ. javanica and Μ. arenaria using sequence characterised amplified region (SCAR)based PCR assays. Nematology 2,847-53.。花生根結線蟲(Μ. arenaria，簡稱Ma)公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得；參考文獻 Zijlstra C, Donkers-Venne DTHM, Fargette M,2000. Identification of Meloidogyne incognita, Μ. javanica and Μ. arenaria using sequence characterised amplified region (SCAR)based PCR assays. Nematology 2,847-53.。北方根結線蟲(M.hapla，簡稱Mh):公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得；參考文獻 Zijlstra C,2000. Identification of Meloidogyne chitwoodi, Μ. fallax and Μ. hapla based on SCAR-PCR a powerful way of enabling reliable identification of populations or individuals that share common traits. European Journal of Plant Pathology 106，283-90.。A型甘薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)和B型甘薯腐爛莖線蟲 (Ditylenchus destructor)公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得；參考文獻黃健等，2009.腐爛莖線蟲種內不同群體形態(tài)及遺傳分析.39(2) :125-131.。實施例1、試劑盒的組成一、試劑盒各組分的制備1、引物的制備根據(jù)甘薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)，存在種間多態(tài)性的區(qū)段，設計特異性寡核苷酸引物。合成3組引物，第一組引物由通用外側引物(DdU-F3和DdU-BIB)和通用內側引物(DdU-FIP和DdU-BIP)組成，第二組引物由A型甘薯莖線蟲特異外側引物(DdA_F3和 DdA-B3)、A型甘薯莖線蟲特異內側引物(DdA-FIP和DdA-BIP)和A型甘薯莖線蟲特異環(huán)引物(DdA-LP和DdA-BP)組成，第三組引物由B型甘薯莖線蟲特異外側引物(DdB_F3和 DdB-B3)和B型甘薯莖線蟲特異內側引物(DdB-FIP和DdB-BIP)組成。DdU-F3 :5，-AGTTGTATGCTTCTTTGTCC-3，(序列表的序列 1)；DdU-B3 :5，-CGTTCTTCATCGATCTACGAG-3，(序列表的序列 2)；DdU-FIP 5 ’ -CAGTGCTCATTAACTCTCGCGGTGGCTGTGATGAAGGAA-3 ’(序列表的序列
3)； DdU-BIP 5’ -CGCCAACACAAAACCCCAGTGATCCACCGATAAGACTAA-3’(序列表的序列
4)；DdA-F3 :5，-CGGGTTGCTTTTTGGTGAGA-3，(序列表的序列幻；DdA-B3 :5，-AACAAAGCCGTTTTTCGCC-3，(序列表的序列 6)；DdA-LP :5，-TCACCTACAGCCACCTTGTT-3，(序列表的序列 9)；
DdA-BP :5，-ATGCAGGCACAGGGTAGT-3，(序列表的序列 10)；
DdB-F3 :5，-TCTCTTTGGCCTAGCACGT-3，(序列表的序列 11)；
DdB-B3 :5，-TCAGGTCGAAAAATCGACTG-3，(序列表的序列 12)；
DdB-FIP :5’ -TTCTCGAGTGAGAGCGATGTCTGCAGCCTCTTGGCCAATG-3’(序列表的序列DdA-FIP 5，-CGTTAATGATCCGGCAGCAGGTCTTGAACCGGGCAAAAGTCG-3，(序列表的序列7)；DdA-BIP :5，-TCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTAATTAGCCAGGCACAGAGC-3，(序列表的序列 8)； 13)； DdB-BIP 5’ -CGCTGTCCAGTGTTTGGTGACTTCAAAGCCTTACGTCCATAG-3’(序列表的序列 14)。第一組引物的25倍母液(DdU-LAMP引物母液)由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下DdU-F3 5 μ Μ, DdU-B3 5 μ Μ、DdU-FIP 40 μ M和 DdU-BIP 40 μ M0第二組引物的25倍母液(DdA-LAMP引物母液)由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下DdA-F3 5 μ Μ、DdA-B3 5 μ Μ、DdA-FIP 40 μ Μ、 DdA-BIP 40 μ Μ、DdA-LP 20 μ M 禾口 DdA-BP 20 μ Μ。第三組引物的25倍母液(DdB-LAMP引物母液)由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在母液中的濃度如下DdB-F3 5 μ Μ, DdB-B3 5 μ Μ、DdB-FIP 40 μ M和 DdB-BIP 40 μ M02、5倍LAMP反應液的制備5倍LAMP反應液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述5倍 LAMP反應液中的濃度如下5mM dNTP、IOOmM Tris-鹽酸(pH8. 8)、50mM氯化鉀、50mM硫酸銨、20mM硫酸鎂、IOmM氯化鎂、0. 5mM氯化錳、25 μ M鈣黃綠素、0. 5% (體積比)曲拉通Χ-100 和2Μ甜菜堿。3、樣品預處理液的制備樣品預處理液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述樣品預處理液中的濃度如下50mM氯化鉀、IOmM Tris (pH8. 2),2. 5mM氯化鎂、60 μ g/mL蛋白酶K、 0. 45% (體積比)吐溫20和0.01% (g/100mL)明膠。4、陽性對照液的制備將序列表的序列15所示的DNA插入PGEM-T easy質粒(Progema，Cat# :A1360) 的NcoI和NotI酶切位點之間，得到陽性對照質粒甲。將陽性對照質粒甲用ddH20稀釋至 IOng/ μ 1，得到陽性對照液甲。將序列表的序列16所示的DNA插入PGEM-T easy質粒(Progema，Cat# :A1360) 的NcoI和NotI酶切位點之間，得到陽性對照質粒乙。將陽性對照質粒乙用ddH20稀釋至 lOng/μΙ，得到陽性對照液乙。將序列表的序列17所示的DNA插入PGEM-T easy質粒(Progema，Cat# :A1360) 的NcoI和NotI酶切位點之間，得到陽性對照質粒丙。將陽性對照質粒丙用ddH20稀釋至IOng/μ 1，得到陽性對照液丙。二、試劑盒的組成試劑盒由步驟一制備的DdU-LAMP引物母液、DdA-LAMP引物母液、DdB-LAMP引物母液、5倍LAMP反應液、Bst DNA聚合酶(活性單位為8U/ μ 1)、樣品預處理液、陽性對照液甲、陽性對照液乙和陽性對照液丙組成。各組分均單獨包裝。三、試劑盒使用方法應用步驟二的試劑盒時，采用如下步驟對待測樣本進行檢測1、提取樣本的基因組DNA當待測樣本為單個卵、幼蟲或成蟲時，采用如下方法提取基因組DNA 加20μ 1樣品預處理液于蓋玻片上，挑取待測樣本于樣品預處理液中，擠壓蓋玻片使蟲體破裂，得到體液混合物；轉移 ο μ 1體液混合物于預先裝有10 μ 1滅菌水的1. 5ml離心管中，液氮中速凍至少1分鐘，65°C水浴20分鐘，95°C水浴5min, 12000rpm離心5分鐘，取1_5μ 1上清用作反應模板(基因組DNA)。當待測樣本為疑似被線蟲感染的薯塊時，采用如下方法提取基因組DNA:取待測樣本，在疑似感染部位切取數(shù)個薄片，浸沒于無菌水中約20分鐘；離心收集無菌水中的線蟲于1. 5ml離心管中，液氮中速凍至少1分鐘，用錐子或尖頭玻璃棒等銳器迅速研磨，加入 50 μ 1樣品預處理液成勻漿，65°C水浴20分鐘，95°C水浴5min，12000rpm離心5分鐘，取 5 μ 1上清用作反應模板(基因組DNA)。2、配制反應體系在200 μ 1 PCR管中配制LAMP反應體系05“1)，見表1。表1 LAMP反應體系
權利要求
1.輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的專用引物，由三組引物組成；第一組引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示 DNA組成；第二組引物由序列表的序列5所示DNA、序列表的序列6所示DNA、序列表的序列 7所示DNA、序列表的序列8所示DNA、序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA 組成；第三組引物由序列表的序列11所示DNA、序列表的序列12所示DNA、序列表的序列13 所示DNA和序列表的序列14所示DNA組成。
2.權利要求1所述專用引物在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒用于輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲和/或檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲。
3.一種含有權利要求1所述專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲和/或檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有BstDNA聚合酶。
5.如權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有5倍LAMP反應液和/或樣品預處理液；所述5倍LAMP反應液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述5倍 LAMP反應液中的濃度如下5mM dNTP、pH8. 8 IOOmM Tris-鹽酸、50mM氯化鉀、50mM硫酸銨、 20mM硫酸鎂、IOmM氯化鎂、0. 5mM氯化錳、25 μ M鈣黃綠素、0. 5% (體積比)曲拉通Χ-100 和2Μ甜菜堿；所述樣品預處理液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為水；所述溶質及其在所述樣品預處理液中的濃度如下50mM氯化鉀、pH8. 2 IOmM Tris,2. 5mM氯化鎂、60 μ g/mL蛋白酶K、 0. 45% (體積比)吐溫20、0.01%明膠。
6.權利要求1所述專用引物在輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲中的應用。
7.權利要求1所述專用引物在檢測待測樣本是否含有甘薯腐爛莖線蟲中的應用。
8.一種輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的方法，是分別用權利要求1所述專用引物中的三組引物對待測線蟲的基因組DNA進行環(huán)介導等溫擴增，然后進行如下(1)和/或(2)和/或 ⑶(1)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非A 型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲；(2)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲；(3)采用所述第一組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的A型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的B型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測線蟲為候選的非B型甘薯腐爛莖線蟲。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述待測線蟲為象耳豆根結線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、A型甘薯腐爛莖線蟲或B型甘薯腐爛莖線蟲。
10.一種輔助鑒定待測植物樣本中是否感染甘薯腐爛莖線蟲的方法，是分別用權利要求1所述專用引物中的三組引物對待測植物樣本的基因組DNA進行環(huán)介導等溫擴增，然后進行如下⑴和/或⑵和/或(3)(1)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色， 待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為綠色，待測植物樣本中疑似含有B型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系顯示為橙色，待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲；(2)采用所述第一組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果環(huán)介導等溫擴增體系中生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似含有B 型甘薯腐爛莖線蟲，如果環(huán)介導等溫擴增體系中沒有生成白色沉淀，待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲；(3)采用所述第一組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似含有甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶， 待測植物樣本中疑似不含有甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第二組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似含有A型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似不含有A型甘薯腐爛莖線蟲；采用所述第三組引物反應后，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶，待測植物樣本中疑似含有B型甘薯腐爛莖線蟲，如果反應產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示梯狀條帶， 待測植物樣本中疑似不含有B型甘薯腐爛莖線蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于環(huán)介導等溫擴增檢測甘薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)的試劑盒及其應用。本發(fā)明提供了輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的專用引物，由序列表的序列1至14所示DNA組成。本發(fā)明提供的試劑盒含有所述專用引物。本發(fā)明設計特異性的引物并優(yōu)化反應條件，提供了一種輔助鑒定甘薯腐爛莖線蟲的試劑盒，應用該試劑盒可使檢測達到種間和種下水平，解決常規(guī)分子檢測成本高、效率低、速度慢，不能滿足當前植物檢疫和植物保護需要的難題。
文檔編號C12N15/11GK102260746SQ20111022819
公開日2011年11月30日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權日2011年8月10日
發(fā)明者劉倩, ?？『? 簡恒, 郭全新, 陳昌龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學