專利名稱：針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于乙肝防治領(lǐng)域，具體涉及一種特異性針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列及其用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴(yán)重的全球性健康問題。據(jù)估計，約有3. 5億人是慢性乙肝病毒攜帶者，易發(fā)展為肝衰竭，肝硬化和/或肝細(xì)胞癌(HCC) [1-3]。最近的研究表明，HBV復(fù)制活躍與疾病進展密切相關(guān)，尤其血清HBV DNA持續(xù)高水平增加了發(fā)生肝硬化和HCC的風(fēng)險[4-7]。目前，已有兩類認(rèn)可的抗乙肝病毒藥物，包括干擾素和核苷/核苷酸類似物，觀察到用抗病毒藥物控制HBV復(fù)制降低了發(fā)展為肝硬化和肝癌的風(fēng)險。然而，對于大多數(shù)病人需要長期治療，而且這些抗病毒治療只對有限的患者有效。此外，干擾素有很多副作用，而核苷或核苷酸類似物在長期治療后可能會導(dǎo)致病毒耐藥性突變[8-12]。因此，目前還沒有有效的藥物根除乙肝病毒，其中一個原因是HBV持續(xù)感染和調(diào)控HBV復(fù)制的機制尚未完全闡明。因此，對HBV復(fù)制生命周期進行更多的研究是必要的。乙型肝炎病毒是一種包膜嗜肝病毒，在其核衣殼中包含一個3. 2kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA基因組。該病毒基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3. 5kb，2. 4kb，2. Ikb和0. 7kb的病毒mRNAs，在核衣殼內(nèi)以3. 5kb前基因組mRNA為模版，利用病毒聚合酶逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA復(fù)制中間體 [13]。因此，HBV 3. 5kb前基因組mRNA轉(zhuǎn)錄在HBV生命周期中有著關(guān)鍵作用。然而，病毒的復(fù)制和表達(dá)不僅受病毒本身調(diào)控，還受宿主各種因素的制約。以往的研究均表明，核激素受體(NRs)，特別是一些肝富集轉(zhuǎn)錄因子(LETFs)，如肝細(xì)胞核因子(HNF) 1，HNF3, HNF4，維甲酸X受體α (RXR α)，過氧化物酶體增殖物激活受體α (PPARa的)等，在HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起關(guān)鍵作用[13-26]。NRs屬于轉(zhuǎn)錄因子的一個超家族，具有相似的結(jié)構(gòu)域，在其DNA結(jié)合區(qū)域具有高相似性序列，在調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和不同細(xì)胞功能中起重要作用[27-29]。HNF4是屬于 NRs 2Α1亞家族，其中有三個亞型，HNF4 a , HNF4 β和HNF4 γ，也是核激素受體進化最保守的成員之一。HNF4ci在肝臟中含量豐富，不僅對于宿主而且對于許多嗜肝病原體的一系列肝臟特異性基因表達(dá)至關(guān)重要[13-14，19-21，30-31]。已發(fā)現(xiàn)HNF4a在HBV生命周期中起重要作用[14-19]。目前體外研究顯示，HNF4ci能夠在一系列非肝源細(xì)胞系中支持HBV前基因組RNA合成和病毒轉(zhuǎn)錄。這表明HNF4ci可能是乙肝病毒嗜肝性的決定性因素之一，并在調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起關(guān)鍵作用[14]。其他一些研究表明，HNF4ci通過結(jié)合并反式激活三個核受體反應(yīng)元件(NRREs)來調(diào)控HBV復(fù)制，這三個核受體反應(yīng)元件已確定為HBV基因組的增強子 I (NRREenhI)、增強子 II (NRREenhII)和前 C 啟動子(NRREpreC) [18，20-26]。 然而，這些結(jié)果都來自于體外研究。HNF4ci在體內(nèi)調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的作用仍需要進一步的研究。由于HBV是一種嗜肝病毒，HNF4 α主要在肝臟中表達(dá)且在HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制中起關(guān)鍵作用，因此，如果在肝臟中抑制甚至敲除HNF4 α可能極大地抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。由此，我們可以驗證HNF4ci在調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的重要作用，也可以找到一個抗HBV持續(xù)感染的藥物新靶點。然而，以往有研究報道敲除HNF4 α可導(dǎo)致動物在胚胎早期死亡[32]。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種在體內(nèi)體外廣泛應(yīng)用的特異性序列轉(zhuǎn)錄后基因沉默的新技術(shù)，在近年來發(fā)展迅速[33-36]。近來許多研究將HBV特異性小分子干擾RNA(siRNA)在HBV復(fù)制細(xì)胞或動物模型中直接靶向HBV基因來有效地抑制了 HBV的復(fù)制和表達(dá)[37-41]。但目前未見針對HNF4ci的RNAi的報道，且本領(lǐng)域目前需要開發(fā)HBV 治療的新的有效藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為抗HBV防治提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列。該針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列針對的是由SEQ ID No. 1所示的靶點。其中，上述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列的為SEQ ID No. 2所示。SEQ ID No. 2是正義鏈，其反義鏈由SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體。該表達(dá)載體能表達(dá)針對肝細(xì)胞核因子4a上的由 SEQ ID No. 1所示的靶點的RNA干擾序列。其中，所述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列是短發(fā)夾shRNA序列。其中，上述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列具有SEQ ID No. 2或其反義鏈 SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。進一步的，上述針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列的表達(dá)是在體內(nèi)進行。其中，上述的表達(dá)載體為質(zhì)粒。進一步的，上述的表達(dá)載體中表達(dá)針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列的表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID No. 4或其反義鏈SEQ ID No. 5所示。SEQ ID No. 4是正義鏈 (Top Strand Oligonucleotide Template)5' -GATCCCCACATGTACTCCTGCAGATTCA AGAGATCTGCAGGAGTACATGTGGTT A~3'表達(dá)框架的反義鏈(Bottom Strand Oligonucleotide Template)為 SEQ ID No. 5 所示5' -AGCTTAACCACATGTACTCCTGCAGATCTCTTGAATCTGCAGGAGTACATGTGGG-3'本發(fā)明上述載體可選擇本領(lǐng)域常用的各種載體，只要能實現(xiàn)在體內(nèi)表達(dá)上述的 RNA干擾序列的要求即可。本發(fā)明的實例主要是選用表達(dá)載體pSilenCer4. I-CMV puro質(zhì)粒。其全長為 4781bp，可將本發(fā)明siRNA序列的表達(dá)框架接入位于pSilencer4. I-CMV puro的463-515 位點，即接入在BamH I及HindIII位點之間，由而CMV啟動子啟動表達(dá)。本發(fā)明還提供了上述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列或者上述的表達(dá)載體在制備抗乙肝病毒的藥物中的用途。本發(fā)明也還提供了一種抗乙肝病毒的藥物。該抗乙肝病毒的藥物含有上述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列或者上述的表達(dá)載體。以其作為主要的活性活性成分。所述藥物的能夠通過現(xiàn)有的公知技術(shù)制備得到。本發(fā)明首次對HNF4ci在體內(nèi)調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的作用和抑制HNF4 α的效果都用RNAi技術(shù)進行研究。本發(fā)明設(shè)計了 4個shRNA序列(參見表1)，并構(gòu)建了四個HNF4 α特異性短發(fā)夾RNAs (shRNAs)表達(dá)質(zhì)粒，但是其中只有一個(shRNAl)證明能有效抑制HNF4a 的表達(dá)且具有較好的安全性。在接下來的實驗中顯示HNF4a shRNAl降低HNF4a的表達(dá)與體內(nèi)體外HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制密切相關(guān)，HNF4 α可能在調(diào)控體內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和表達(dá)中起關(guān)鍵作用，HNF4 α可能被用作抗HBV藥物研究的靶標(biāo)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明shRNA序列及其表達(dá)載體證明能有效地抑制體內(nèi) HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制且在實驗期內(nèi)沒有明顯的副作用，為抗HBV提供了一種新的有效選擇，在制備抗HBV藥物中有很好的應(yīng)用前景。


圖1為用HNF4 a shRNA抑制H印G2細(xì)胞中HNF4 α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將構(gòu)建的4 種HNF4 a shRNA表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到H印G2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后3天從H印G2細(xì)胞中提取總RNA 和準(zhǔn)備細(xì)胞裂解物。(A) RT-PCR分析H印G2細(xì)胞的HNF4 a mRNA。用β -actin作為RNA內(nèi)參，M 標(biāo)準(zhǔn)品 Maker ；泳道 1 :HNF4 α shRNAl ；泳道 2 :HNF4 α shRNA2 ；泳道 3 :HNF4 α shRNA3 ； 泳道4 :HNF4 α shRNA4 ；泳道5 陰性shRNA ；泳道6 無shRNA對照。(B)檢測H印G2細(xì)胞的 HNF4a蛋白表達(dá)。用SDS-PAGE分離總細(xì)胞細(xì)胞裂解液并用抗HNF4 α抗體進行Western印跡分析。泳道1-6與㈧相同。(C和D)定量分析HepG2細(xì)胞的HNF4 a mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。HNF4 a mRNA和蛋白水平分別用β-actin mRNA和蛋白進行修正，且報道其相對于未轉(zhuǎn)染shRNA的!fepG2細(xì)胞的結(jié)果(A和B，泳道6)。圖2為HNF4 α shRNAl抑制HepG2細(xì)胞中HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。僅瞬時轉(zhuǎn)染了 PHBV4. 1 (泳道1)的!fepG2細(xì)胞作為HBV復(fù)制的陽性對照，未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的IfepG2 細(xì)胞作為空白對照(泳道2)，分別對!fepG2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pHBV4. l+pHNF4 α shRNAl、 pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4、pHBV4. 1+pNegative control shRNA (泳道 3-5)。轉(zhuǎn)染后 3 天，收集H印G2細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和HBV復(fù)制中間體DNA。(A) Northern印跡分析HBV 3. 5和 2. 4/2. Ikb轉(zhuǎn)錄子。用GAPDH mRNA作為內(nèi)參。(B) Southern印跡分析HBV復(fù)制中間體DNA0 (C)定量分析 3. 5-kb HBV RNA 和總 HBV DNA 復(fù)制中間體。3. 5_kb HBV mRNA 由 GAPDH mRNA 條帶強度作為內(nèi)參修正。3. 5-kb HBV mRNA和HBV DNA復(fù)制中間體均報道其相對于僅轉(zhuǎn)染了 pHBV4. 1的H印G2細(xì)胞(A和B，泳道1)的結(jié)果。圖3為HNF4 α shRNAl抑制小鼠肝臟中HBV復(fù)制。僅注射pHBV4. 1的BALB/ c小鼠(泳道1 3)作為HBV復(fù)制的陽性對照，用尾靜脈高壓注射法分別注射 pHBV4. l+pHNF4 α shRNAl、pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4 及 pHBV4. 1+pNegative control shRNA 泳道7 9、10 12和13 15)到小鼠體內(nèi)，僅注射正常生理鹽水的小鼠作為空白對照(泳道4 6)。在共注射3天后處死小鼠，收集小鼠肝組織，提取組織總RNA和HBV復(fù)制中間體 DNA0 (A)Northern印跡分析小鼠肝組織中HBV 3. 5和2. 4/2. Ikb轉(zhuǎn)錄子。用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)mRNA作為內(nèi)參對每個泳道的RNA進行修正。(B) Southern印跡分析小鼠肝組織中HBV復(fù)制中間體DNA、HBV RC DNA (HBV環(huán)狀DNA)、HBV SS DNA (HBV單鏈DNA)。 (C)定量分析 3. 5-kb HBV RNA 和 HBV DNA 復(fù)制中間體。3. 5_kb HBV mRNA 由 GAPDH mRNA 條帶強度作為內(nèi)參修正。3. 5-kb HBV mRNA和HBV DNA復(fù)制中間體均報道其相對于僅注射 T PHBV4. 1的小鼠(A和B，泳道1-3)的結(jié)果。圖4表示HNF4 α shRNAl抑制小鼠肝組織中HNF4 α和HBcAg的表達(dá)。僅注射pHBV4. 1的BALB/c小鼠(圖3，泳道1 3)作為HBV復(fù)制的陽性對照。用尾靜脈脈高壓注射法分別注射PHBV4. l+pHNF4 α shRNAl (圖3，泳道7 9 ；圖4A、C)、 pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4 (圖 3，泳道 10 12)及 pHBV4. 1+pNegative control shRNA (圖 3，泳道13 15，圖4A、C)到小鼠體內(nèi)，僅注射正常生理鹽水的小鼠作為空白對照(圖3，泳道4 6)。HNF4ci和HBcAg的表達(dá)分別用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測。A D:小鼠肝組織中 HNF4 α的免疫組化染色，HNF4 α表達(dá)著色弱陽性⑴㈧，強陽性(+++) (B D)。E H 小鼠肝組織中HBcAg的免疫組化染色，HBcAg表達(dá)著色弱陽性⑴(E)，強陽性(+++) (F G)， 及陰性(H)。HNF4ci和HBcAg的黃色或棕色信號定位在細(xì)胞核或胞漿(放大倍數(shù)X 400)
具體實施例方式以下通過具體實施方式
對本發(fā)明內(nèi)容進行詳細(xì)的說明。實施例一本發(fā)明干擾RNA序列的獲得及其抗HBV的功效材料和方法1、質(zhì)粒構(gòu)建本發(fā)明用人類HNF4 α mRNA(GenBank登錄號X87870)作為模版來設(shè)計shRNA目標(biāo)序列。設(shè)計得到了四對靶向HNF4a (shRNAl、shRNA2、shRNA3、shRNA4，參見表一)的干擾序列，并設(shè)計得到了開放閱讀框保守序列的片段(每個55bp，由Invitrogen公司合成，其設(shè)計均參見SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5)并分別克隆到pSilencer 4. 1-CMV puro載體的 BamHI和HindIII位點之間。 表一設(shè)計的肝細(xì)胞核因子4a RNA干擾序列
權(quán)利要求
1.針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列，其特征在于所述的肝細(xì)胞核因子4aRNA干擾序列針對的是由SEQ ID No. 1所示的靶點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列，其特征在于所述的肝細(xì)胞核因子4a RNA干擾序列具有SEQ ID No. 2或其反義鏈SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
3.表達(dá)載體，其特征在于能表達(dá)針對肝細(xì)胞核因子4a上的由SEQID No. 1所示的靶點的RNA干擾序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA 干擾序列具有SEQ ID No. 2或其反義鏈SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的質(zhì)粒中表達(dá)針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列的表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID No. 4或其反義鏈SEQ ID No. 5 所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為 pSilencer4. I-CMV puro。
8.權(quán)利要求1或2所述的針對肝細(xì)胞核因子4a的RNA干擾序列或者權(quán)利要求3 7 任一項所述的表達(dá)載體在制備抗乙肝病毒的藥物中的用途。
9.抗乙肝病毒的藥物，其特征在于含有權(quán)利要求1或2所述的針對肝細(xì)胞核因子4a 的RNA干擾序列或者權(quán)利要求3 7任一項所述的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明屬于乙肝防治領(lǐng)域，具體涉及一種對乙肝病毒復(fù)制具有抑制作用的肝細(xì)胞核因子4a特異性短發(fā)夾RNA及其用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為抗HBV治療提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種針對肝細(xì)胞核因子4a特異性短發(fā)夾RNA及能表達(dá)該序列的載體。本發(fā)明shRNA序列及其表達(dá)載體證明能有效地抑制體內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制且沒有明顯的副作用，為抗HBV提供了一種新的有效選擇，在制備抗HBV藥物中有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/113GK102304515SQ201110231219
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者何芳, 劉麗, 劉聰, 周陶友, 唐紅, 白浪, 程星, 陳恩強 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院