專利名稱：：HNF4α誘導分化治療人體惡性實體瘤的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學、細胞生物學以及醫(yī)學領域。具體地，本發(fā)明涉及利用肝細胞核因子4a(H印atocyteNuclearFactor-4a,HNF4a)誘導人體惡性實體瘤細胞發(fā)生分化，從而應用于實體腫瘤治療的方法和用途。
背景技術：
：腫瘤誘導分化治療(differentiationtherapy)是近20年來腫瘤臨床治療方面的重要突破。誘導分化治療是通過誘導分化方法促進腫瘤細胞向成熟階段分化，恢復正常的細胞表型和功能并抑制惡性腫瘤細胞的增殖。誘導分化治療打破了腫瘤發(fā)展不可逆的傳統(tǒng)認識，有力的推動了整個癌癥研究領域的發(fā)展。我國學者曾率先運用全反式維甲酸誘導分化治療急性早幼粒細胞性白血病，取得了較好的療效。然而，盡管白血病的分化治療取得了很大進展，但惡性實體瘤的分化治療仍然是腫瘤治療研究領域的難題。迄今為止，對于諸如肝癌、胃癌、腸癌、腎癌以及胰腺癌等人體惡性實體腫瘤的誘導分化治療仍未見明確報道。迄今實驗表明，全反式維甲酸對惡性實體瘤的分化無明顯作用。選擇合適的藥物或相關物質進行特異性靶向調控是腫瘤誘導分化治療的難點。有研究利用藥物或蛋白體外調控實體腫瘤的分化狀態(tài)，但效果有限。體內實驗大多提示上述方法在誘導腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤組織壞死方面有一定的作用，但是很難實現(xiàn)顯著調控或逆轉實體瘤低分化程度。在眾多候選物質中篩選出有效的誘導腫瘤分化的試劑是非常困難的，也是收效甚微的。因此，選擇出與腫瘤細胞誘導分化密切相關的關鍵蛋白、分子和基因進行特異性靶向調控是腫瘤誘導分化治療的核心問題之一。近年來，隨著人類基因組計劃研究的不斷深入，為人們利用基因技術手段調控甚至改變細胞重要基因的表達以改變其表型、分化狀態(tài)和生物學功能創(chuàng)造了條件。然而，雖然已經證實有一些物質或基因在體外實驗中可改善腫瘤細胞的某些生物性特性(如增殖及克隆形成能力降低、部分正常細胞功能基因表達上調)，一些物質甚至證實了可降低癌細胞在動物體內的成瘤作用，但是往往3發(fā)現(xiàn)這些物質對正常細胞也有影響(副作用)，并不能特異性地在體內誘導實體腫瘤發(fā)生分化。本發(fā)明人曾研究了全反式維甲酸、生長抑素、腫瘤壞死因子以及三氧化二砷等物質體外對肝癌細胞株分化的調控作用，均未篩選出有明確分化治療作用的藥物或蛋白，同時體內研究也發(fā)現(xiàn)這些物質不能有效地誘導實體腫瘤發(fā)生分化。因此，本領域迫切需要開發(fā)與惡性實體瘤細胞誘導分化密切相關的特定蛋白或基因，能夠作為特異性調控的靶標，從而有效地誘導分化實體瘤。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種與惡性實體瘤細胞誘導分化密切相關的特定的基因-HNF4a基因及其編碼產物HNF4a蛋白，以及HNF4a基因/蛋白在誘導分化實體瘤中的用途。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種通過HNF4a基因/蛋白分化誘導惡性實體瘤從而治療腫瘤的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種肝細胞核因子4a(H印atocyteNuclearFactor-4a，HNF4a)基因和/或蛋白的用途，它們被用于制備誘導惡性實體瘤細胞分化的誘導分化試劑或組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有(a)HNF4a蛋白、HNF4a編碼序列或含所述編碼序列的表達載體以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體包括病毒載體和非病毒載體。較佳地，所述的非病毒載體為脂質體。在另一優(yōu)選例中，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還用于體內抑制實體瘤的形成。在另一優(yōu)選例中，所述的肝細胞核因子4a是人的肝細胞核因子4a。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有化療劑。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種誘導或促進哺乳動物中實體瘤分化的方法，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細胞核因子4a蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達載體。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動物是人。圖1.RT-PCR檢測人肝腫瘤細胞株HNF4a基因和肝細胞相關功能基因的表達。圖2.RT-PCR獲得HNF4acDNA片段。圖3.體外連接獲得穿梭質粒pAdTrack-CMV-HNF4aBglII和EcoRV酶切鑒定。圖4.PacI酶切鑒定重組腺病毒質粒pAdHNF4a。圖5.酶切鑒定重組腺病毒質粒pAdHNF4a。圖6.AdHNF4a分別感染H印G2(A、B)和H印3B(C、D)細胞3天后GFP表達。圖7.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞3天后Westernblot檢測HNF4a蛋白表達。圖8.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞3天后HNF4a蛋白表達定量分析。圖9.檢測人肝腫瘤細胞株HNF4a基因和肝細胞相關功能基因mRNA表達定量分析圖10.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞3天后氨代謝檢測。圖11和圖12.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞后CD133表達測定。圖13和圖14.外源導入HNF4a對人肝腫瘤細胞克隆形成的影響。圖15.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞后ICG吸收染色測定。圖16.AdHNF4a感染肝腫瘤細胞后體內接種成瘤實驗。圖17.HNF4a基因誘導分化治療實驗性肝腫瘤模型。具體實施例方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了一種可有效地在體內誘導或促進惡性實體瘤向正常細胞分化的關鍵基因/蛋白即HNF4a基因/蛋白。實驗表明，HNF4a不僅對腫瘤細胞凋亡有影響，更可對實體瘤細胞的分化產生誘導或促進作用(細胞形態(tài)變化、肝細胞相關功能基因表達明顯上調及體內對腫瘤的預防、干預和治療作用)。因此HNF4a作為首次被證實的可有效地在體內誘導或促進惡性實體瘤向正常細胞分化的關鍵基因/蛋白，具有潛在的應用前景。本發(fā)明人在此基礎上完成了本發(fā)明。如本文所用，術語"基因/蛋白"指基因和/或蛋白。如本文所用，術語"HNF4a蛋白"、"HNF4a多肽"、"本發(fā)明多肽"、"本發(fā)明蛋白"可互換使用，都指肝細胞核因子4a(H印atocyteNuclearFactor-4a)蛋白。它們可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNF4a。狹義上，所述術語指人的HNF4a;廣義上，所述術語不僅包括人的HNF4a，還包括其他哺乳動物的HNF4a，尤其是靈長類動物的HNF4ci，如猿或猴的HNF4a。該術語還包括HNF4a蛋白的活性片段、活性衍生物和類似物。本發(fā)明多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然HNF4a蛋白(如人HNF4a)相同的生物學功能或活性的多肽。這些多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。例如，在本發(fā)明中，術語"人HNF4a多肽"指具有野生型HNF4a序列的多肽。該術語還包括具有與人HNF4a蛋白相同的誘導實體瘤分化功能的、野生型序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-IO個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在c末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。同樣，該術語還包括人HNF4a蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明還包括人HNF4a蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HNF4a多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，"人HNF4a蛋白保守性變異多肽"指與野生型氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。表1最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val;LeulieValArg(R)Lys;GlnAsnLysAsn(N)Gin;HisLys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)ProAlaAlaH〗s(H)AsnGinLysArgArgIle(I)LeuValMetAla;PheLeuLeu(X)lieValMetAla;PhelieLys(K)ArgGinAsnArgMet(M)LeuPhelieLeuPhe(F)!LeuVallie;Ala;TyrLeu7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>如本文所用，術語"HNF4a基因"或"本發(fā)明基因"可互換使用，都指編碼HNF4a蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與野生型編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有野生型氨基酸序列的蛋白質，但與野生型編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，只要這些多核苷酸變異體編碼與本發(fā)明上述的HNF4a多肽或其的活性片段、活性類似物和活性衍生物。在本發(fā)明中，人HNF4ci核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)人HNF4a的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員己知的常規(guī)方法所制備的d)NA庫作為模板，擴增而得有關序列。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。本發(fā)明也涉及包含HNF4a編碼序列的載體(尤其是病毒載體)，以及用本發(fā)明的載體或HNF4a編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術，可利用HNF4a多核苷酸序列可用來表達或生產重組的HNF4a多肽。一般來說有以下步驟(1).用編碼人HNF4a多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。本發(fā)明中，人麗F4a多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括(Q不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,etal.Gene，1987，56:125);在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(LeeandNathans,JBioChem.263:3521,1988)。總之，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人HNF4a編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；A噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細胞如酵母；動物細胞如CH0、C0S、293細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，可用CaCl2法或電穿孔方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達冊F4a多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。重組的HNF4a多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的HNF4a多肽可直接做為誘導分化試劑誘導或促進惡性實體瘤發(fā)生分化。此外，編碼HNF4a蛋白的多核苷酸或攜帶HNF4a編碼序列的載體也可用于誘導或促進實體瘤分化。將多核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達野生型的HNF4ct蛋白，以增加實體瘤中服F4a蛋白的數(shù)量和活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將HNF4a基因轉移至細胞內。構建攜帶HNF4a基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，etal.)。另外重組人HNF4a基因可包裝到脂質體中，然后再轉入細胞內。本發(fā)明隨F4a蛋白、HNF4a多核苷酸及載體，當施用(給藥)于哺乳動物對象(如人)時，可誘導或促進惡性實體瘤發(fā)生分化。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的載體介質(包括水性載體介質)，形成藥物組合物。水性載體介質的pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。本發(fā)明的藥物組合物可直接用于誘導實體瘤的分化(治療)，代表性的例子包括(但并不限于)肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌及生殖腺腫瘤等。在使用本發(fā)明服F4a基因/蛋白或藥物組合物時，還可同時或輔助使用其他治療劑，如順鉑、TNF等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有(a)安全有效量(如O.0001-90wt%)的本發(fā)明服F4a蛋白、HNF4a多核苷酸或載體以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發(fā)明藥物組合物中還可含有其他治療劑，如化療藥物。使用藥物組合物時，是將安全有效量的HNF4a蛋白、HNF4a多核苷酸或載體施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約l微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。本發(fā)明還提供了一種誘導和/或促進惡性實體瘤分化的方法，該方法包括給需要的哺乳動物對象(如人)施用本發(fā)明的HNF4a蛋白、HNF4a多核苷酸或載體，從而在該對象體內誘導和/或促進實體瘤分化。本發(fā)明還提供了一種腫瘤細胞(尤其是惡性實體瘤)基因治療的方法，它包括將HNF4a基因導入腫瘤細胞，使之表達，其中所述將HNF4a基因導入腫瘤細胞的方法包括用質粒轉染、腺病毒或腺相關病毒介導。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)利用多種基因工程技術方法研究并首次證實了惡性實體瘤的分化治療。(b)篩選并證實重要轉錄因子HNF4a對惡性實體瘤分化的調控作用。(c)在體內外證實惡性實體瘤分化治療的可行性及其對臨床研究的潛在意義。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1RT-PCR檢測人肝腫瘤細胞株HNF4a基因以及肝細胞相關功能基因的表達1.將市售的常規(guī)肝腫瘤細胞株Huh-7、H印3B、H印G2均以8X107皿接種于六孔板，以含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，第二天抽提細胞RNA，分光光度計測定0D，值，配成工作濃度(lyg/ul及0.1yg/y1)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。2.RT-PCR:取4ugRNA、2u1隨機引物、DEPC水加至33ul于7(TC置5min、(TC置5min后，加入10ul5XBuffer、3uldNTP、2ulRNA逆轉錄酶和1RNA酶抑制劑混勻后，37。C置1.5h，即可得到逆轉錄產物。將逆轉錄產物稀釋后取lul為模版進行PCR擴增，檢測的基因引物序列、反應條件、和反應體系見表2和3。各組RT-PCR產物于1.5%瓊脂糖膠電泳鑒定、掃描圖象后，用市售的Multy-Analasyst圖象分析軟件進行光密度掃描并測序分析。表2反應體系人引物序列以及反應條件成分_體積U1)正義引物0.3y1~~反義引物0.3ul逆轉錄產物lylTaq酶0力110XTaq緩沖液1.5yldNTP0.4y1d,11.3ul表3人引物序列以及反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>G-6-P止義鏈5:GGCTCCATGACTGTGGGATC-3'反義鏈5'-TTCAGCTGCACAGCCCAGAA-3'56475bp49。C32ALB正義鏈5'-AGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3'反義鏈5'-CTCGATGAACTTCGGGATGA-3'781212bp55°C29GS正義鏈5'-CCTGCTTGTATGCTGGAGTC-3'反義鏈5'-GAAAAGTCGTTGATGTTGGA-3'9103恥bp55°C35CYPla2止義鏈5'-CTGGCCTCTGCCATCTTCTG-3'反義鏈5'-TTAGCCTCCTTGCTCACATGC-3'1112464bp49°C35PEPCK止義鏈5'-GTGTCCCTCTAGTCTATGAAGC-3'反義鏈5'-ATTGACTTGATCCTCCAGATAC-3'1314485bp49。C35TTR正義鏈5GCGGGACTGGTATTTGTGTCTG-3'反義鏈5'-TTAGTGACGACAGCCGTGGTG-3'1516398bp55°C27AFP正義鏈5'-AGCTTGGTGGTGGATGAAAC-3'反義鏈5'-CCCTCTTCAGCAAAGCAGAC-3'1718248bp55°C35b-a.ctin正義鏈5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'反義鏈5'-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'1920499bp55°C25月干細胞核因子4a(h印atocytenuclearfactor4a，HNF4a);葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-P);白蛋白(albumin,ALB):谷胺酰氨合成酶(glutaminesynthetase,GS);細胞色素P450家族la2(cytochromeP450la2,CYPla2);磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK);甲狀腺激素結合蛋白(transthyretin,TTR);甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP);載脂蛋白CIII(apolipoproteincIII，APOCIII)結果表明肝腫瘤細胞株Huh-7、H印3B以及H印G2的HNF4a表達均明顯下調，HNF4a基因的表達與肝細胞相關的重要功能基因表達呈正相關(圖1和圖9)。實施例2構建表達HNF4a的重組復制缺陷型腺病毒AdHNF4a1.獲取HNF4a1425bpcDNA片段根據(jù)人HNF4acDNA序列設計、合成引物。正義引物(在5'端加入BglII酶切位點)5'-CCGAGATCTAGAATGCGACTCTCCAAAACC-3'(SEQIDNO:21)。反義引物(在5'端加入EcoRV酶切位點)5'-CGCGATATCGGCTTGCTAGATAACTTCCTGCT-3'(SEQIDNO:22)。PCR擴增HNF4acDNA片段，產物1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定片段大小，并割膠回收置入E卯endorf管內，稱取膠重量。E卯endorf管中加入NT液200ml/100mg膠，50。C5-10min至膠烙化，將液體過柱，13,000rpra離心1min，加入600u1NT3緩沖液，13，000rpm離心2min。30ul雙蒸水過柱洗脫DNA片段，靜放1min，13，000rpm離心1min,小心移取洗脫液于干凈的E卯endorf管內。分光光度計測定OD，值，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小(圖2)。成分體積("l)正義引物5ti1反義引物5n1正常的人肝細胞cDNA1pfu酶2ii1lOXpfu緩沖液10y1dNTPlOy1ddH2066ii1反應條件94°C30s，60°C30s，72°C90s，35個循環(huán)。2.構建表達HNF4a的腺病毒質粒pAdHNF4a:EcoRV、BglII酶切穿梭質粒pAdTrack-CMV(購自霍華德-休斯醫(yī)學研究所，美國)和HNF4acDNA4h后并純化，取O.1"g質粒pAdTrack-CMV、0.4yg,4acDNA、10X丁4緩沖液2"1、T4DNA連接酶lul(2U)以及ddH20，總體積20yl，16'C連接過夜。將連接產物加入常規(guī)的感受態(tài)大腸桿菌DH5a轉化，用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基平皿鋪板，37。C恒溫過夜，選擇單菌落克隆，將擴增出HNF4cicDNA片段的菌落克隆用Qiagen-tipIOO試劑盒中抽，獲取質粒pAdTrack-CMV-HNF4a并鑒定(圖3)。PmeI內切酶酶切線性化pAdTrack-CMV-HNF4a，分別取0.4ug線性pAdTrack-CMV-HNF4a和0.1ug超螺旋pAdEasy-1質粒2，000V、200Ohms、25uFD電穿孔共轉化20u1感受態(tài)BJ5183細菌，卡那霉素LB培養(yǎng)基平板篩選，選擇病毒質粒pAdHNF4a鑒定(圖4和圖5)。3.包裝、擴增腺病毒AdHNF4a:復蘇常規(guī)的293細胞，以4.8X107皿接種于10-cm的組織培養(yǎng)皿，加入DMEM37°C、5%(;02培養(yǎng)，24h后細胞密度生長至60%80%。PacI酶切線性化pAdHNF4a，與不含血清的DMEM培液250y1混勻，配成A液；取Lipofectamin20ul，加入不含血清的DMEM培液250y1混勻，配成B液，A液與B液充分混勻，室溫放置30min后加入待轉染的293細胞中，4h后更換培液。7d后收集293細胞以及上清，于液氮和37'C水浴中反復凍融4次，5,000rpm離心5min，收集病毒上清，病毒上清再次感染293細胞進行擴增，23d后收集病毒；重復感染、收集步驟，將最終收集的病毒上清分裝，測定病毒上清滴度，最終得到滴度約為1X10'°efu/ml的14AdHNF4a，置于-8(TC保存?zhèn)溆?。實施?RT-PCR和Westernblot檢測AdHNF4a感染人肝腫瘤細胞株后HNF4a的表達1.人肝腫瘤細胞株H印G2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，將病毒AdHNF4a分別以MOI40、100感染細胞，24h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM培液，3d后觀察GFP表達(圖6)。以Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄反應2h，取lyl稀釋的逆轉錄產物為模板進行HNF4aPCR擴增，反應條件同前，同時以f3ictin在相同反應條件進行PCR反應作為內參照，反應體系如下。成分體積U1)正義引物0.3u1反義引物0.3y1逆轉錄產物lii1Taq酶0.2y110XTaq緩沖液1.1dNTP0.4u1ddH2011.3u1反應條件為95°C30s，55°C30s，72°C90s，27個循環(huán)。RT-PCR產物于1.5%瓊脂糖膠電泳鑒定、掃描圖象后，用Multy-Analasyst圖象分析軟件進行光密度掃描并測序分析。結果表明AdHNF4a感染人肝腫瘤細胞株后HNF4amRNA在腫瘤細胞中表達明顯上調(圖7和8)。2.AdHNF4a分別感染H印G2和H印3B，細胞裂解液收取全細胞蛋白，蛋白標準定量后，各取10ug于10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)ddH20沖洗，將電泳膠、PVDF膜、濾紙放于轉移緩沖液(TransferringBuffer)中平衡后，置于電轉移槽中，18V，40min。用5%BSA/PBST20ml室溫封閉膜2h后，HNF4a多抗(1:500)4"C孵育過夜，次日PBST洗滌后，與驢抗羊熒光二抗(1:2000)室溫孵育30min，PBST洗滌2次后，經Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)檢測熒光并進行灰度掃描。結果顯示，AdHNF4a感染人肝腫瘤細胞株后HNF4a蛋白表達分別增加約3.4倍(H印G2)和5.2倍(H印3B)(圖7，8)。實施例4外源導入隨F4a對人肝腫瘤細胞生物學特性影響1.RT-PCR檢測肝細胞相關功能基因的表達將常規(guī)的人肝腫瘤細胞株HepG2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，將病毒AdHNF4a分別以M0140、100感染細胞，24h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM培液，3d后觀察GFP表達；以Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄反應2h，取lU1稀釋的逆轉錄產物為模板進行PCR擴增，檢測的基因引物序列以及反應條件同實施例1,反應體系如下。成分體積U1)正義引物0.3u1反義引物0.3u1逆轉錄產物lu1Taq酶0.1lOXTaq緩沖液1,5u1dNTP0.4u1d歸11.1各組RT-PCR產物于1.5%瓊脂糖膠電泳鑒定、掃描圖象后，用Multy-Analasyst圖象分析軟件進行光密度掃描并測序分析。結果表明AdHNF4a感染組中肝細胞相關功能基因表達較對照組明顯上調，其中G-6-PmRNA表達上調近50倍；ALB、TTR表達未見明顯變化，AFP表達則明顯下調(表3-1)。表3-1半定量分析HNF4a基因導入后肝細胞相關功能基因表達細胞株基因Hep3B光密設比值HepG2光密度比伍AdHNF4a組P值AdHNF4a組P值AdGFP組AdGFP組GS2.9倍P<0.0i12.6倍P<0.0PEPCK16.7倍P<0.015.0倍P<0.01G-6-P52.3倍P<0.012.3倍P<0.05CYPla6.1倍P<0.0118.6倍P<0.01APOCin4.9倍P<0.015.7倍P<0.01AFP9.3%P<0.0124.7%P<0.012.流式細胞儀測定人肝腫瘤細胞凋亡率將常規(guī)的肝癌細胞株H印G2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，分別將病毒AdHNF4a以MOI40、100感染細胞，24h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM培液，第3天收集細胞，于EPICSXL流式細胞儀(Coulter)測定細胞凋亡率并進行統(tǒng)計學分析。各組復設2盤，重復3次。結果表明上調肝腫瘤細胞HNF4a表達后細胞的凋亡率有一定影響。3.流式細胞儀測定人肝腫瘤細胞細胞周期變化將肝癌細胞株H印G2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，分別將病毒AdHNF4a以MOI40、100感染細胞，24h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM培液，第3天收集細胞，于EPICSXL流式細胞儀(Coulter)測定細胞周期變化并進行統(tǒng)計學分析。結果表明在病毒感染后72h、96h，H印G2表現(xiàn)為S期減少。4.用常規(guī)試劑盒檢測細胞上清的氨濃度。結果表明，與對照組(不加病毒或空病毒)相比，試驗組的氨代謝能力明顯增強(圖10)。實施例5外源導入HNF4a對人實體腫瘤細胞增殖的影響人肝腫瘤細胞株、胃癌細胞株和結腸癌細胞株分別以5XIOV孔接種于1796孔板，24h后感染病毒AdHNF4a，此后每天用CCK8試劑檢測450nm波長的吸光度以判斷有活性細胞的數(shù)量。結果表明HNF4a表達對實體腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用，最早從感染病毒后第3天，AdHNF4a感染組腫瘤細胞的增殖開始下降，至第5天細胞數(shù)量明顯減少，抑制率高達50%-68%。同時研究發(fā)現(xiàn)，隨著病毒感染滴度的增高，HNF4a上調對部分實體腫瘤細胞增殖抑制作用表現(xiàn)為時間和劑量的依賴性。實施例6外源導入HNF4a對人肝腫瘤細胞CD133表達的影響將人肝腫瘤細胞H印G2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，分別將病毒AdHNF4a以MOI40、IOO感染細胞，24h后更換含10%胎牛血清的新鮮DMEM培液，第3天收集細胞，CD133/1-PE(MiltenyiBiotec，Aubum，CA)作為一抗孵育，流式細胞儀CD133+細胞的比例。結果表明，AdHNF4a感染后肝腫瘤細胞中CD133+的細胞比例明顯減少(圖11和圖12)。CD133+是腫瘤干細胞的特異性標志物，CD133+的細胞比例明顯減少表明AdHNF4a促進誘導腫瘤干細胞發(fā)生分化，比例明顯下降。另外，未對全反式維甲酸或三氧化二砷對腫瘤干細胞的有明顯誘導分化作用(數(shù)據(jù)未示出)。實施例7外源導入HNF4ct對人實體腫瘤細胞克隆形成的影響人肝腫瘤細胞株、胃癌細胞株和結腸癌細胞株分別以2X105接種于35固培養(yǎng)皿，病毒AdHNF4a感染24h后，各取8X103細胞接種于10cm培養(yǎng)皿，每3天換液，培養(yǎng)3-4周，直至可見明顯克隆，4。/。PFA固定，結晶紫染色，計數(shù)克隆。結果表明，AdHNF4a感染后人實體腫瘤細胞株形成的克隆均較對照組減少，HNF4a上調可明顯降低實體腫瘤細胞株的克隆形成能力(圖13和14)。實施例8外源導入HNF4a對人肝腫瘤細胞衰老相關的0-gal染色將H印3B和H印G2分別以2X105接種于六孔板，分別于感染后72h、96h，4%PFA固定細胞，然后用新配置的衰老相關的e-gal溶液染色，37°C，46h，PBS洗滌，光學顯微鏡下拍照。溶液配方1mg/m.5-bromo-4-chloro-3_indolylP-D-galactoside(X-Gal)，40mMcitricacid/sodiumphosphate(pH6.0)，5mMK,Fe(CN)6(亞鐵氰化鉀)，5mMK3Fe(CN)6(鐵氰化鉀)，150mMNaCl，and2tnMMgCl2。結果表明HNF4a基因導入后，在H印G2細胞中{3-gal染色陽性的細胞較對照組明顯增多，提示上調HNF4a對部分肝腫瘤細胞的抑制作用是通過誘導衰老來實現(xiàn)的(圖15)。實施例9上調人肝腫瘤細胞株H印G2和H印3B中HNF4a表達對體內成瘤的影響分別取AdHNF4a感染24h后的H印3B5X106和H印G21X107接種于裸鼠腋下，觀察體內成瘤情況，同時用游標卡尺測量新生腫瘤的大小。結果表明H印3B對照組早在接種后第2周檢測出腫瘤生長，第3周所有裸鼠均有腫瘤生成；H印G2對照組在接種后第3周檢測出腫瘤生長，到第5周75%的裸鼠均有腫瘤生成。在觀察的5周中，AdHNF4a感染后的肝腫瘤細胞接種的裸鼠體內沒有明確的腫瘤生成(圖16和17)。實施例10HNF4a基因誘導分化治療實驗性肝腫瘤模型(l)5X106Hep3B重懸于200ul的無血清的MEM中，通過脾臟注射裸鼠體內，同時于細胞注射后0d和2d，將5X109pfu的AdHNF4a通過尾靜脈注射導入動物體內。8周后處死裸鼠，取出肝臟，冰凍切片并作HE染色和病理分析。結果表明病毒通過尾靜脈注射3天后，取出肝臟，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察80。/。肝細胞有GFP表達。8周后，對照組肝臟中均發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤生長，HNF4a基因治療組中有2只裸鼠無腫瘤生長，一只僅出現(xiàn)較小腫瘤。迸一步HE染色分析，HNF4a基因治療組中2只肉眼無腫瘤的裸鼠肝臟HE染色為正常的肝臟組織結構，對照組均可見惡性細胞。實施例11HNF4a基因誘導分化治療實驗性肝腫瘤模型(2)利用頸部皮下接種肝癌細胞株構建形成實驗性肝腫瘤裸鼠模型后，將lX10'°pfu的AdHNF4a通過頸靜脈注射導入動物體內。結果顯示病毒注射3天后，熒光顯微鏡下觀察80%以上的腫瘤細胞有GFP表達。治療1周后，定期測定腫瘤大小，HNF4a基因治療組中8只裸鼠腫瘤大小平均值在不同時間節(jié)點均顯著小于對照組；生存時間比較，HNF4a基因治療組明顯長于對照組。免疫組化結果顯示，治療組腫瘤細胞異型性有明顯改變(形態(tài)相對規(guī)則，胞核小，核畸形及核分裂增多少見)；與凋亡相關的蛋白如Ikl-2、Bax等表達未見明顯變化。該結果表明，HNF4a基因/蛋白可有效地在體內誘導或促進實體瘤向正常細胞分化。實施例12全反式維甲酸、生長抑素(Somatostatin),腫瘤壞死因子以及三氧化二砷等對肝癌細胞株H印G2和H印3B的體外作用人肝腫瘤細胞株H印G2和H印3B均以5X107皿接種于六孔板，分別加入全反式維甲酸、生長抑素、腫瘤壞死因子以及三氧化二砷；以Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄反應2h，取1u1稀釋的逆轉錄產物為模板進行PCR擴增，檢測肝細胞相關功能基因威NA表達，免疫組化測定Cycliri、Bax、Bcl-2等增殖及凋亡相關蛋白表達。結果表明各組肝細胞相關功能基因表達未見明顯差別，與腫瘤分化相關的部分基因表達(HNF4a、HNFla、C/EBP)表達未見明顯上調，細胞形態(tài)學無明顯改變；腫瘤壞死因子和三氧化二砷組細胞凋亡明顯增多、增殖下調。這提示這些物質對照物質對肝癌細胞沒有誘導分化作用(因為細胞形態(tài)無變化)。討論肝細胞核因子4(hepatocytenuclearfactor,HNF4)是一種細胞核激素受體家族的轉錄因子，是調控肝細胞分化和維護肝細胞生物學功能的重要轉錄蛋白，在分化成熟的肝細胞中高表達，其中HNF4a是HNF4的重要亞型。野生型的人HNF4a序列的登錄號為(GeneID:419198)。對HNF4a基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的肝細胞中都出現(xiàn)大量功能基因表達下調，這些基因不僅影響肝細胞分化表型，還影響肝細胞中參與20脂肪代謝、白蛋白合成以及藥物解毒等重要基因表達。HNF4a以二聚體的形式與順式作用元件結合，當HNF4a的DNA及配體結合域和孕垸X受體a形成二聚體時，其利用鋅指DNA結合域識別DNA序列，并可通過乙?；?、磷酸化以及與SMADS3或4結合調節(jié)自身活性，與一些轉錄激活蛋白如SRC-1、GRIP-1和G3P/p300等相互作用來改變啟動子或增強子附近的染色體結構，從而在轉錄水平實現(xiàn)對分化和功能基因表達的調控。由于絕大多數(shù)物質或基因雖然在體外實驗中可改善腫瘤細胞的某些生物性特性或可降低癌細胞在動物體內的成瘤作用，但是幾乎都是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)，并不能特異性地在體內誘導實體腫瘤發(fā)生分化。因此早先的研究雖認為上調肝癌細胞株HNF4a的表達可改善腫瘤細胞的某些生物性特性，但并不相信也未證實HNF4a居然具有誘導分化惡性實體瘤，進而逆轉腫瘤低分化狀態(tài)的能力；HNF4a對其它惡性實體腫瘤的分化調控作用亦不明確；更未將上調HNF4a表達作為誘導分化治療手段加以研究。本發(fā)明的創(chuàng)新研究的表明利用基因工程技術調控實體腫瘤細胞HNF4a基因表達，可有效地對腫瘤細胞的產生誘導分化作用。HNF4a調控眾多細胞分化基因和功能基因的表達，如通過上調胚胎干細胞HNF4a表達，可明顯增強一些重要功能基因如載脂蛋白、醛縮酶B、苯丙氨酸羥化酶、TFN和視黃醇結合蛋白等表達。更為重要的是，上調HNF4a表達還可逆轉肝癌細胞的去分化狀態(tài)。因此，這提示，HNF4a可能還在不同類型腫瘤的分化轉錄調控中發(fā)揮重要作用。因此，本發(fā)明通過體內HNF4a腺病毒載體注射明確HNF4a表達上調對人體惡性實體瘤動物模型的誘導分化治療作用，從而提供了一種腫瘤誘導分化治療的新手段。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉屮國人民解放軍第二軍醫(yī)大學<120>HNF4a誘導分化治療人體惡性實體瘤<130〉081083<160〉22<170〉Patentlnversion3.2<210>1<211>22<212〉DNA〈213〉Primer<400〉1!:tga.aa.atgtgcaggtgttgac<210〉2<211>22<212〉DNA<213〉Primer<400>2cagaga.tgggaga,ggtgatctg<210>3〈211>19<212>DNA<213〉Primer<柳>3gggtactccttgttgttgc<210〉4<211>21〈212〉DNA<213〉Primer<400〉4aaatcccagaactcagagaac<210〉5<211〉20<212>DNA<213〉Primer<400>522221921ggctccatgactgtgggatc〈210〉622<211>20<212〉DNA<213>Primer<400>6ttcagctgcacagcccagaa<210〉7〈211〉20〈212〉DNA<213〉Primer<400>7agcctaaggcagcttgactt<210〉8〈211〉20〈212〉DNA<213〉Primer<400〉8ctcgatgaacttcgggatga<210〉9<211〉20<212>DNA〈213〉Primer〈400>9cctgcttgtatgctggagtc<210〉10<211>20<212〉DNA<213〉Primer<400>10ga.a,a鄰tcgttga,tgttgga<210〉11<211〉20<212〉DNA<213〉Primer<400〉11ctggcctctgccatcttctg<210〉12<211>21<212>DNA<213〉Primer說明書第21/23頁202020202023<柳〉12ttagcctccttgctca,catgc21<210〉13<211〉22<212〉DNA<213〉Primer<400>13gtgtccctctagtctatgaagc22<210>14<211〉22DNAPrimer<400〉14attga.cttga.tcctccagatac22<210〉15<211〉22<212〉DNA<213〉Primer<400〉15gcgggactggtatttgtgtctg"<210>16〈211>21<212〉DNA〈213〉Primer<400〉16ttagtgacgacagccgtggtg21<210〉17<211>20<212>DNAPrimer<400>17agcUggtggtggatgaaac20<210〉18<211〉20〈212〉DNA<213〉Primer<400〉18ccctcttcagcaaagcagac2024〈210>19<211>18<212>DNA<213>Primer<400>19catcctgcgtctggacct<210〉20<211〉20<212>DNA<213>Primer<400〉20gta.cttgcgctcaggagga.g<210>21<211>30<212〉DNA<213〉Primer<400〉21ccgaga.tcta.gaatgcgactctccaaaa.cc<210>22<211>32<212>DNA<213〉Primer<400>22cgcgatatcggcttgctagataacttcctgct3權利要求1.一種肝細胞核因子4α(HepatocyteNuclearFactor-4α，HNF4α)基因和/或蛋白的用途，其特征在于，用于制備誘導惡性實體瘤細胞分化的誘導分化試劑或組合物。2.如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物。3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物含有(a)HNF4a蛋白、HNF4a編碼序列或含所述編碼序列的表達載體以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的表達載體包括病毒載體和非病毒載體。5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。6.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還用于體內抑制實體瘤的形成。7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細胞核因子4a是人的肝細胞核因子4a。8.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。9.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還含有化療劑。10.—種誘導或促進哺乳動物中實體瘤分化的方法，其特征在于，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細胞核因子4a蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達載體。全文摘要本發(fā)明涉及HNF4α誘導分化治療人體惡性實體瘤。具體地，本發(fā)明涉及利用肝細胞核因子4α(HepatocyteNuclearFactor-4α，HNF4α)誘導人體惡性實體瘤細胞發(fā)生分化，從而應用于惡性實體腫瘤治療的方法和用途。本發(fā)明的研究表明，通過調控惡性實體腫瘤細胞HNF4α基因表達，可有效地對腫瘤細胞的產生誘導分化作用，從而提供了一種腫瘤誘導分化治療的新手段。文檔編號A61K9/08GK101524529SQ200810034200公開日2009年9月9日申請日期2008年3月4日優(yōu)先權日2008年3月4日發(fā)明者川尹,欣曾,勇林,謝渭芬,陳岳祥申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學