專利名稱：焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，尤其涉及一種使用焦磷酸測(cè)序方法從痰標(biāo)本中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥突變的引物和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
異煙肼(NH)作為一種高效特異的抗結(jié)核藥物，它主要通過(guò)結(jié)核桿菌內(nèi)過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶(由KatG基因編碼)的作用下才能轉(zhuǎn)化為活性形式作用于enoyl-ACP還原酶，抑制桿菌酸和細(xì)胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活異煙肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然會(huì)造成結(jié)核菌異煙肼耐藥性，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)造成臨床異煙肼耐藥性的主要原因不僅是KatG基因的完全缺失、點(diǎn)位突變、堿基的插入和缺失同樣重要。目前，前期建立的焦磷酸測(cè)序結(jié)核桿菌異煙肼耐藥性檢測(cè)方法是從結(jié)核分枝桿菌痰標(biāo)本培養(yǎng)物中進(jìn)行檢測(cè)，但結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)的過(guò)程至少需時(shí)I月，嚴(yán)重制約了分子生物學(xué)檢測(cè)手段快速的優(yōu)越性，如果能從痰標(biāo)本中直接進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，則可以大大縮短藥敏結(jié)果的時(shí)間，對(duì)臨床指導(dǎo)價(jià)值更大。但由于痰標(biāo)本中所含菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于痰標(biāo)本純培養(yǎng)物，用以前的方法僅進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物濃度過(guò)低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到焦磷酸測(cè)序檢測(cè)的要求，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在痰標(biāo)本中的檢測(cè)。中國(guó)專利CN1311435披露了一種結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片，其中在一經(jīng)修飾的載玻片上，固定有一系列寡核苷酸點(diǎn)陣探針。在檢測(cè)芯片中所說(shuō)的探針是針對(duì)rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因，每個(gè)探針長(zhǎng)度至少為10個(gè)堿基，并且各個(gè)探針長(zhǎng)度相同；突變點(diǎn)盡可能位于探針中間。在《中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》2011年第2期中刊登了“焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌四種藥物耐藥 性”一文，其中利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)以10株已知藥敏結(jié)果和經(jīng)直接測(cè)序已知耐藥基因突變情況的MTB為試驗(yàn)菌株，摸索焦磷酸測(cè)序檢測(cè)MTB rpoB、katG、gyrA、rrs耐藥基因的最佳模式，并用該條件檢測(cè)89株MTB臨床分離株，并將檢測(cè)結(jié)果與BACTEC960藥敏法進(jìn)行比較，以便得到最佳的檢測(cè)方法。在現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法中，都不可以避免需要事先對(duì)患者痰標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，這就使得檢測(cè)時(shí)間增長(zhǎng)，檢測(cè)中需要進(jìn)行反應(yīng)的次數(shù)也比較多，使得不能快速得出耐藥性的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用焦磷酸測(cè)序方法從痰標(biāo)本中直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥突變的引物和檢測(cè)條件。為了實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明提供一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，包括以下順序步驟
步驟I，對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
步驟2，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷KatG基因是否具有突變位點(diǎn)；其中焦磷酸測(cè)序采用SNP模式、核苷酸加樣順序?yàn)镚TCACAGTCTG。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中針對(duì)KatG基因315位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序并設(shè)計(jì)引物。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，所述對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，其中第一次擴(kuò)增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴(kuò)增以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為模板。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中第一次擴(kuò)增使用的第一 PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴(kuò)增使用的第二 PCR引物具有SEQ ID NO. 3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中所述第一 PCR引物和第二 PCR引物的濃度為O. 4 μ ml/L。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中在焦磷酸測(cè)序中用的測(cè)序引物具有SEQ ID NO. 4所示序列。在上述提供的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法中，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程包括下列順序步驟
步驟1:在94°C下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘；
步驟2 :在95°C下保持30秒進(jìn)行變性、61°C下保持30秒進(jìn)行退火、72°C下保持30秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，循環(huán)退火過(guò)程40次；
步驟3 :在72°C下保持10分鐘。`本發(fā)明提供的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，無(wú)需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分歧桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測(cè)方法可以縮短檢測(cè)時(shí)間，減少焦磷酸序列測(cè)定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測(cè)試劑用量。


圖1是本發(fā)明中用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)痰標(biāo)本焦磷酸測(cè)序結(jié)果。圖2是本發(fā)明中用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)痰標(biāo)本焦磷酸測(cè)序另一結(jié)果。圖3是本發(fā)明中用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)株焦磷酸測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式由于KatG基因的突變主要集中于315位點(diǎn)，在本發(fā)明主要針對(duì)異煙肼KatG耐藥基因315位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的方法，先對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷KatG基因是否具有突變位點(diǎn)；其中焦磷酸測(cè)序采用SNP模式、核苷酸加樣順序?yàn)镚TCACAGTCTG。焦磷酸測(cè)序技術(shù)
焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)是全新的一種DNA序列分析技術(shù),可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定一段較短的目標(biāo)片段。該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。
焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，基本原理如下將I個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase)和底物混合物(包括 APS 和Luciferin)。向反應(yīng)體系中加入I種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì),貝U會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP ;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP,使第2 4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。焦磷酸測(cè)序操作系統(tǒng)中共有2個(gè)模式能進(jìn)行堿基突變的檢測(cè)，即序列分析模式(Sequence Analysis, SQA)和單核苷酸多態(tài)性模式(Single Nucleotide polymorphism,SNP)ο其中SQA模式的核苷酸加樣順序?yàn)檠h(huán)順序加樣法，即通過(guò)循環(huán)反復(fù)的加入A、G、C、T四種核苷酸以檢測(cè)出·待檢樣品的序列，該法一次能準(zhǔn)確判讀40bp左右的堿基，將所測(cè)定序列與已知序列比對(duì)后自行判讀突變情況。SNP模式的核苷酸加樣順序?yàn)樘囟樞蚣訕臃?，即系統(tǒng)根據(jù)設(shè)定的待檢位點(diǎn)及·位點(diǎn)周圍的序列自動(dòng)生成核苷酸的加樣順序，僅對(duì)單個(gè)位點(diǎn)的堿基變化進(jìn)行檢測(cè)，不對(duì)整個(gè)序列進(jìn)行測(cè)定。針對(duì)不同的檢測(cè)對(duì)象，需要摸索不同的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法。由于焦磷酸測(cè)序技術(shù)操作簡(jiǎn)單，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于SNP位點(diǎn)檢測(cè)、等位基因頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒分型等領(lǐng)域。以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。采集檢測(cè)物
收集病人晨痰并存放在無(wú)菌樣本保存管內(nèi)，痰量以3 5mL為宜，密封后送檢。檢測(cè)物預(yù)處理和DNA提取
取適量被檢標(biāo)本，加等量N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液，震蕩30秒，置于室溫放置15分鐘，如果標(biāo)本粘稠可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。檢測(cè)物中加入PBS緩沖液20mL，混勻并離心，離心條件為20分鐘3000g。去除上層清液，加入PBS緩沖液20mL用于洗滌沉淀。洗滌2次后，將沉淀重懸于50 μ I TB裂解液中(TB裂解液為含有O. 04%Na0H, O. 1% SDS和15%ChelexlOO的溶液)，在50°C下水浴I小時(shí)，后沸水浴10分鐘。再次離心分離，取上層清液并在_20°C環(huán)境下保存?zhèn)溆茫吹玫降浇Y(jié)核桿菌DNA提取物。異煙肼KatG耐藥基因的PCR擴(kuò)增
用具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，模板為病人痰檢測(cè)物的結(jié)核桿菌DNA提取物。在50 μ L反應(yīng)體系中，第一引物最佳的濃度為O. 4μ mol/L。PCR反應(yīng)過(guò)程如下先在94°C下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘；在95°C下保持30秒進(jìn)行變性、61°C下保持30秒進(jìn)行退火、72°C下保持30秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，并循環(huán)該過(guò)程40次；最后在72°C下保持10分鐘。用具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物和帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ IDNO. 2所示序列的PCR第二引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，模板為第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。在50 μ L反應(yīng)體系中，第二引物最佳的濃度為0.4 μ mol/L。PCR反應(yīng)過(guò)程如下先在94°C下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘；在95°C下保持30秒進(jìn)行變性、61°C下保持30秒進(jìn)行退火、72°C下保持30秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，并循環(huán)該過(guò)程40次；最后在72°C下保持10分鐘。取2 μ L的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在12V/cm電位梯度下電泳20分鐘，后在紫外燈下檢查擴(kuò)增效果。具有SEQ ID NO.1所示序列擴(kuò)增引物、具有SEQ ID NO. 2所示序列擴(kuò)增引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列擴(kuò)增引物的序列如下所示。SEQ ID NO.1 ATGAGGTCTATTGGGGCAAGGAAGCSEQ ID NO. 2 CCCGCAGCGAGAGGTCAGTGG
SEQ ID NO. 3 AGATGGGCTTGGGCTGGA
具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO. 3所示序列的PCR第二引物為兩條正向引物，具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第一引物和帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列的PCR第二引物為共同的反向引物。由此具有相同的退火溫度，因此可以共用同樣的PCR擴(kuò)增條件。帶有生物素標(biāo)記的引物在檢測(cè)中起到標(biāo)記作用。焦磷酸測(cè)序1.檢測(cè)試劑配制
結(jié)合緩沖液將 IOmmoI/L Tris_HCl、2mol/L NaClUmmol/L EDTA 和 O. 1% Tween20 去離子水溶解，用I mol/L HCl調(diào)pH至7. 6。變性緩沖液(denatureationbuffer) :O. 5 mol/L NaOH。退火緩沖液將 20 mmol /T, Tris_Acetate、2mmol/L MgAc2 溶液混合,用 4mol/L 乙酸調(diào)pH至7. 6。洗漆緩沖液(washingbuffer):用 4mol/L 乙酸將 10 mmol/L Tris-Acetate 溶液調(diào)pH至7. 6。70%乙醇在70mL無(wú)水乙醇中加入高純水20mL,充分混勻后定容至100mL。2.檢測(cè)儀器及配套試劑
(I) PSQ 96全自動(dòng)焦磷酸測(cè)序儀、PSQ96單鏈制備工具臺(tái)(Vacuum prepworkstation)、真空樣品轉(zhuǎn)移器(Vacuum prep tool)、真空泵、潤(rùn)旋振蕩器、PCR儀。(2)瑞典PYROSEQUENCING AB公司生產(chǎn)的焦磷酸微測(cè)序試劑盒(PSQ 96MA SQAUpgrade Kit)和鏈親和素包被的磁珠(Sepharose beads)。3.焦磷酸測(cè)序檢測(cè)步驟
(I)PCR產(chǎn)物固定在PCR板中放入40 μ L的具有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再分別加入36 μ L的結(jié)合緩沖液和4 μ L鏈親和素包被的磁珠。將PCR板放在渦旋振蕩器上常溫振蕩20分鐘，使PCR產(chǎn)物固定在磁珠上。(2)單鏈模板的純化打開(kāi)真空泵，將真空樣品轉(zhuǎn)移器移到PCR板中，抓取結(jié)合PCR產(chǎn)物的磁珠，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空樣品轉(zhuǎn)移器上。再將真空樣品轉(zhuǎn)移器放入70%乙醇中輕微振蕩5秒，然后移到變性緩沖液中抽吸5秒，使DNA變性以得到純化的單鏈DNA模板，最后移到洗滌緩沖液中清洗5 10秒，洗滌未固定的單鏈DNA，從而得到作為測(cè)序模板的單鏈DNA。
(3)引物雜交先在焦磷酸測(cè)序微孔板各孔中加入退火緩沖液50 μ L，再加入具有SEQ ID NO. 4所示序列測(cè)序引物。測(cè)序引物的最低要求濃度為I μ mol/L，最高濃度為
O.2mmol/L。再將真空樣品轉(zhuǎn)移器從PCR板移入焦磷酸測(cè)序微孔板，關(guān)閉真空泵，將已純化好的單鏈DNA模板與具有SEQ ID NO. 4所示序列測(cè)序引物混和，在80°C下變性2分鐘，然后冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。具有SEQ ID NO. 4所示序列測(cè)序引物的序列如下所示。SEQ ID NO. 4 CCGGTAAGGACGCGA
(4)焦磷酸測(cè)序利用由瑞典Pyrosequencing AB公司生產(chǎn)的PSQ96MA測(cè)序儀和試劑盒，依次在試劑倉(cāng)中加入酶、底物和4種dNTPs，選用SNP檢測(cè)模式、以GTCACAGTCTG的核苷酸加樣順序加入順序進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)對(duì)每次加樣后產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以獲得特異的檢測(cè)峰，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。圖1是用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)痰標(biāo)本焦磷酸測(cè)序的結(jié)果，檢測(cè)得出的序列為TCACG^aiG。圖2是另外一個(gè)用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)痰標(biāo)本焦磷酸測(cè)序的結(jié)果，檢測(cè)得出的序列為TCACCA^GG。將其與圖3的用SNP模式對(duì)異煙肼KatG基因315位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)株焦磷酸測(cè)序結(jié)果得到序列為TCACG^CGG的結(jié)果相比，可得出圖中方框內(nèi)為突變的基因序列。根據(jù)多次檢驗(yàn)結(jié)果與異煙肼KatG基因315位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)株焦磷酸測(cè)序結(jié)果相比較，具有SEQ ID NO. 4所示序列的測(cè)試引物能準(zhǔn)確的檢測(cè)出異煙肼耐藥突變位點(diǎn)，由此在臨床研究中可以方便將其應(yīng)用在檢測(cè)之中。由于通常痰標(biāo)本中所含菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于痰標(biāo)本純培養(yǎng)物，得到的PCR產(chǎn)物濃度過(guò)低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到焦磷酸測(cè)序檢測(cè)的要求，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在痰標(biāo)本中的檢測(cè)。在本發(fā)明中利用三條引物進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，使 得約95%的痰標(biāo)本均能獲得高質(zhì)量的耐藥基因目的片段，滿足焦磷酸測(cè)序檢測(cè)的需求，實(shí)現(xiàn)從痰標(biāo)本直接進(jìn)行結(jié)核桿菌耐藥性測(cè)定，滿足臨床快速診斷耐藥結(jié)核病的需求，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本發(fā)明提出的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)耐藥性的方法，同樣也可以應(yīng)用在胸水、腦脊液血液等體液標(biāo)本的檢測(cè)中、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。SEQUENCE LISTING<110>上海市肺科醫(yī)院
〈120〉焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法
〈160〉4
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉25
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉擴(kuò)增異煙肼目的片段的PCR引物
〈400〉I
atgaggtcta ttggggcaag gaagc25
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉擴(kuò)增異煙肼目的片段的PCR引物
〈400〉2
cccgcagcga gaggtcagtg g21
〈210〉3
〈211〉18
〈212〉DNA
<213>Artificial〈220〉
〈223〉擴(kuò)增異煙肼目的片段的PCR引物〈400〉 3
agatgggctt gggctgga18
〈210〉4
〈211〉15
〈212〉DNA
<213>Artificial
〈220〉
〈223〉檢測(cè)異煙肼耐藥突變位點(diǎn)的測(cè)序引物〈400〉 4
ccggtaagga cgcga15`
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，其特征在于，包括以下順序步驟 步驟I，對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟2，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷KatG基因是否具有突變位點(diǎn)；其中焦磷酸測(cè)序采用SNP模式、核苷酸加樣順序?yàn)镚TCACAGTCTG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，針對(duì)KatG基因315位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序并設(shè)計(jì)引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，其中第一次擴(kuò)增以痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA提取物為模板，第二次擴(kuò)增以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物為模板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一次擴(kuò)增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示序列，所述第二次擴(kuò)增使用的第二 PCR引物具有SEQ IDNO. 3所示序列或帶有生物素標(biāo)記的具有SEQ ID NO. 2所示序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR引物和第二 PCR引物的濃度為 0. 4 u ml/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在焦磷酸測(cè)序中用的測(cè)序引物具有SEQID NO. 4所示序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程包括下列順序步驟 步驟1:在94°C下進(jìn)行預(yù)熱5分鐘； 步驟2 :在95°C下保持30秒進(jìn)行變性、61°C下保持30秒進(jìn)行退火、72°C下保持30秒進(jìn)行擴(kuò)增和延伸，循環(huán)退火過(guò)程40次； 步驟3 :在72°C下保持10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的方法，包括以下順序步驟步驟1，對(duì)KatG基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟2，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷KatG基因是否具有突變位點(diǎn)；其中焦磷酸測(cè)序采用SNP模式、核苷酸加樣順序?yàn)镚TCACAGTCTG。本發(fā)明提供的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥性的方法可以從患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，無(wú)需再做分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株，相比現(xiàn)在常用檢測(cè)方法可以縮短檢測(cè)時(shí)間，減少焦磷酸序列測(cè)定所需要的反應(yīng)次數(shù)和檢測(cè)試劑用量。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK103045716SQ20111030510
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者鄭瑞娟, 胡忠義, 周燕, 王潔, 秦蓮花 申請(qǐng)人:上海市肺科醫(yī)院