專利名稱：用于乳腺癌的預(yù)后的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于乳腺癌的預(yù)后的方法和試劑盒，包括其部分。具體地，本方法包括鑒定出指示乳腺癌患者的生存可能性和/或正接受乳腺癌治療的或已經(jīng)治療的患者的疾病復(fù)發(fā)可能性和/或癌癥的轉(zhuǎn)移特性的基因表達(dá)模式。
背景技術(shù)：
乳腺癌是英國、美國和丹麥最為常見的女性癌癥。它也是工業(yè)化國家最常見的累及婦女的癌癥類型。乳腺癌的發(fā)生率正在逐漸增加，在美國，它是第二常見的癌癥死亡原因。事實(shí)上，在1997年，估計(jì)美國報道了 181，000例新發(fā)病例，并且估計(jì)每年有40，000人死于乳腺癌。盡管全球已經(jīng)進(jìn)行了對抗這種病癥的努力，但是乳腺癌的發(fā)病率只發(fā)生了很小的變化，雖然早期檢測和新的治療方法在過去的數(shù)十年里已經(jīng)少量地提高了生存率。雖然絕大多數(shù)乳腺癌的腫瘤發(fā)生機(jī)制在很大程度上還很不清楚，但是多種因素能使得一些婦女容易發(fā)生乳腺癌。這些因素包括生育史、月經(jīng)情況、腫瘤分級、ER狀態(tài)、腫瘤大小以及診斷和手術(shù)時的淋巴結(jié)受累。另外，用乳腺照相術(shù)或其他χ線顯像方法可以不同程度地確定出預(yù)后。但是，乳腺照相術(shù)并非沒有危險，并且在檢查中所用射線的電離性質(zhì)可能會誘發(fā)乳腺腫瘤。另外，這些方法都是昂貴的，并且結(jié)果可被不同的技術(shù)人員不同地解讀。例如，一個研究顯示在一組被一組放射學(xué)家所解讀的乳腺照相中，約三分之一有著較大的臨床不一致。此外，許多婦女發(fā)現(xiàn)進(jìn)行乳腺照相術(shù)是一種痛苦的經(jīng)歷。在臨床實(shí)踐中，疾病的預(yù)后是重要的，因?yàn)樗鼪Q定了將會給予的治療。正確的預(yù)后可以使得腫瘤學(xué)家例如優(yōu)先施用激素治療或化療，并且僅在最為侵襲性的癌癥病例中才推薦手術(shù)治療。但是，早期診斷已經(jīng)成為乳腺癌的常見特點(diǎn)，因?yàn)樵絹碓蕉嗟幕颊攥F(xiàn)在都呈現(xiàn)出非常早期的疾病。這使得評價癌癥結(jié)局的傳統(tǒng)方法變得更為困難，癌癥類型和治療的時機(jī)都是患者應(yīng)答好或壞的關(guān)鍵，這一點(diǎn)已經(jīng)變得越來越明顯。例如，許多患者可能正接受不必要的治療，所述治療常常會引起毒性副作用，而其他患者可能采取保守的治療策略，事實(shí)上癌癥比所預(yù)想的更為進(jìn)展。因此，在早期作出正確的和準(zhǔn)確的預(yù)后判斷是至關(guān)重要的。至今還沒有鑒定出一組令人滿意的單獨(dú)基于臨床信息的預(yù)后預(yù)測物。因此，研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向于關(guān)注可以診斷癌癥并預(yù)測癌癥預(yù)后的分子標(biāo)記(signature)。WO 02/103320闡述了數(shù)千個遺傳標(biāo)志物，所述標(biāo)志物的表達(dá)與臨床預(yù)后有關(guān)，其可以被用于區(qū)分預(yù)后良好的和預(yù)后差的患者。確定表達(dá)的方法包括將取自患者的組織測試樣品的表達(dá)模式與取自預(yù)后良好的患者的組織樣品的表達(dá)模式進(jìn)行比較，也與取自已知預(yù)后差的患者的樣品的表達(dá)模式進(jìn)行比較，并確定出測試樣品的表達(dá)模式與哪個樣品的表達(dá)模式最為相符。盡管該方法學(xué)比判斷預(yù)后的傳統(tǒng)臨床方法有所改進(jìn)，但是它的確具有很多缺點(diǎn)。例如，分析數(shù)百個基因標(biāo)志物要花費(fèi)相當(dāng)多的時間，并且本身并不實(shí)際。此外，還不清楚表達(dá)一些好的預(yù)后標(biāo)志物和一些壞的預(yù)后標(biāo)志物的樣品是否會給出模棱兩可的預(yù)后。因此， 由于方法學(xué)的復(fù)雜性，這種方法可能是不正確的，意思是患者將會被列入錯誤的預(yù)后組，因?yàn)樗麄儽磉_(dá)一組中的基因多于另一組，或者這可能不能提供明確的答案。如上所述，早期的和正確的預(yù)后對于適當(dāng)?shù)暮陀行У闹委熓侵匾摹Ｒ虼?，很明顯需要更簡單的、更明確的分子標(biāo)記。我們因此開發(fā)出了用于確定給定乳腺癌的預(yù)后的方法，其相對容易進(jìn)行，有效實(shí)施并能提供關(guān)于疾病的可能結(jié)局的正確指示。我們的方法使用小的但有高度代表性的標(biāo)志物樣本，因此能特別準(zhǔn)確地確定出給定癌癥的可能結(jié)局。此外，我們的方法可以分成三個組分第一個組分預(yù)測患有乳腺癌的個體的可能的生存率；第二個組分預(yù)測患有乳腺癌的個體的癌癥的可能復(fù)發(fā)率；和第三個組分預(yù)測癌癥的轉(zhuǎn)移特征。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，第二個組分因此提示了患有乳腺癌的患者的無發(fā)病生存可能性，以及第三個組分提示了疾病的侵襲性質(zhì)。綜上所述，我們已經(jīng)鑒定出了多個在確定給定乳腺癌的預(yù)后方面具有相關(guān)性的分子標(biāo)記。每個分子標(biāo)記包括多個遺傳標(biāo)志物，與具有中等預(yù)后(見下)的患者的組織相比較，所述遺傳標(biāo)志物的表達(dá)高或低是給定結(jié)局的指示。除此之外，我們已經(jīng)分析了每個分子標(biāo)記，以便鑒定出哪些遺傳標(biāo)志物是給定疾病的結(jié)局的最好的指示物，換句話說即對分子標(biāo)記的預(yù)測能力貢獻(xiàn)最多的那些遺傳標(biāo)志物。該標(biāo)志物亞組被總稱為改進(jìn)的(refined)分子標(biāo)記。例如，這里提供了第一個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述標(biāo)志物的高表達(dá)與低生存率相關(guān)；第一組包括那些作為低生存率的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物，在此它們?nèi)w被稱作第一個主要分子標(biāo)記[組(A)]AMF、ATF4、Cyr61、ER、Matriptase2、MET、MLN64、MMP7、柄蛋白(Nectin) 4、PAR1A、 Psoriason、Pttgl、Rho-C, Scotin、SDFl、SEMPl、SPF45、SSTl、ST15、TACC2、TBD10、TCF2、 TEM6、TEM7R、Z0-3 ；禾口第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第一個次要分子標(biāo)記[組(B)]Basigin、β-連環(huán)蛋白、BMP1、BMP10、Calpain large、CD44、CX43、細(xì)胞周期蛋白 D2、EHMS, FAK、FAP、GIRK、HAVRl、Isotopo3、JAK1、L0X12、NET-2、PAR1A2、PTHrP, Rho-G, S100A4、SPARC、TCF3、VECAD, Vilip、Wave2。在此提及上面的和下面的標(biāo)志物是引述已命名的蛋白，在www.NCBI.LM.NIH. gov 數(shù)據(jù)庫可以獲得其全部身份，或者為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在此所述的高或低表達(dá)是相對于相同標(biāo)志物在被認(rèn)為具有中等預(yù)后的患者體內(nèi)的表達(dá)水平，所述具有中等預(yù)后的患者即具有標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后指數(shù)Nottingham預(yù)后指數(shù)(NPI)= 3. 4-5. 4的患者，其中NPI = 0. 2x腫瘤大小+腫瘤級別+淋巴結(jié)情況，其中NPI(低)< 3. 4，86%患者存活 15 年；NPI (中等)3.4-5. 4，42%患者存活 15 年；NPI (高)>5. 4，13% 患者存活 5 年。這里還提供了第二個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述分子標(biāo)志物的低表達(dá)與低生存率相關(guān)，第一組包括那些作為低生存率的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物，在此它們?nèi)w被稱作第二個主要分子標(biāo)記[組(C)]ARP2, Atf-3, HuR, MENU Paracellin, PTP-RK 卞艮胃白(Radixin) 、 RH08/ gdiG-Ratio ；和第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第二個次要分子標(biāo)記[組(D)]aMOT、Atf-I、Claudin-I、IL-22R、Rock 2 Vegl0這里還提供了第三個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述分子標(biāo)志物的高表達(dá)與低發(fā)生率的無癌生存相關(guān)，第一組包括那些作為低發(fā)生率的無癌生存的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物，在此它們?nèi)w被稱作第三個主要分子標(biāo)記[組(E)]AAMP、AMFR、Bmp8、BMP9、β -連環(huán)蛋白、CAR、Crebl2、DRIM、EHMS、Endomuscin2、FAK、 FAP>Isotopol、Kissl/ckl9、Notchl、PAR1A、ParlA2>PLC-delta>Psoriasin>PTTGU RhoC> Rockl、SDFl、SSTl、ST15、TEM6、TEM7R ；禾口第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第三個次要分子標(biāo)記[組(F)]血管緊張素a l、ATF4、BmplO、CASM、組織蛋白酶(cath印sin) S、CX43、彈性蛋白酶 PMN、GIRK、HAVRU HIN, Isotopo3、Kissl、L0X12、N0S3、PMSA、S100A4、SEMP1、TACC2、遍在蛋白、WISP2。這里還提供了第四個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述分子標(biāo)志物的低表達(dá)與低發(fā)生率的無癌生存相關(guān)，第一組包括那些作為低發(fā)生率的無癌生存的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物，在此它們?nèi)w被稱作第四個主要分子標(biāo)記[組(G)]Bmp3、IL22R、IL24、JAKl、PTP-RK、Rho8/GdiG、Snail、WASP ；禾口第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第四個次要分子標(biāo)記[組(H)]ATF3、Bmp4、BMPR1A、MENl、Parace 11 in。這里還提供了第五個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述分子標(biāo)志物的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移癌相關(guān)，第一組包括那些作為轉(zhuǎn)移癌的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物， 在此它們?nèi)w被稱作第五個主要分子標(biāo)記[組(I)]BAF57、BNDF、CARl、CASM、組織蛋白酶-L、Creb 1/2、CXCRlO、DRIM、HERG、IL-7R、 IL-11、Kissl、MKK1、PMN-彈性蛋白酶、PTTP1、SDF5、TACC2、遍在蛋白、VPRl、VUDP ；禾口第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第五個次要分子標(biāo)記[組(J)]Angiomotin, BMP7、細(xì)胞周期蛋白 Dl、DNA 連接酶 _1、IGFBP7、LYVE1、NET2、RH08、 SRBC、Math4、TGAse-3、粘著斑蛋白(Vinculin)、WAVE2。最后，這里還提供了第六個分子標(biāo)記，其包括兩組分子標(biāo)志物，所述分子標(biāo)志物的低表達(dá)與轉(zhuǎn)移癌相關(guān)，第一組包括那些作為轉(zhuǎn)移癌的統(tǒng)計(jì)學(xué)最為顯著的指示物的分子標(biāo)志物，在此全體被稱作第六個主要分子標(biāo)記[組(K)]Paracellin ；禾口第二組包括前面的分子標(biāo)志物加上至少一種下面的分子標(biāo)志物，在此它們?nèi)w被稱作第六個次要分子標(biāo)記[組(L)]
ALCAM、Eplin, ERbeta, Glypic3、JAKU MAGI-U PEDF, PKC-eta、Stathlin, WWOX。我們因此已經(jīng)確定出了至少六個分子標(biāo)記，包括12組分子標(biāo)志物(6組主要和6 組次要標(biāo)志物)，其可以用于乳腺癌的預(yù)后。對這些標(biāo)記的闡明包含了十多年的工作，期間我們已經(jīng)系統(tǒng)地和仔細(xì)地檢查了數(shù)百個乳腺癌組織樣品以及成百上千多個遺傳分子標(biāo)志物。但是，在完成這個艱辛的工作后，我們驚訝地發(fā)現(xiàn)事實(shí)上對于提供給定乳腺癌組織樣品的正確預(yù)后，只需要檢查非常少的基因。甚至令人更驚訝的是，通過鑒定出對于我們的分子標(biāo)記的預(yù)測結(jié)局貢獻(xiàn)最多的那些分子標(biāo)志物，我們能進(jìn)一步地減少這個數(shù)目，例如對于與轉(zhuǎn)移癌相關(guān)的分子標(biāo)記，只需要檢查20/21個基因。這意味著我們的方法學(xué)具有直接應(yīng)用， 在臨床上可以快速地和常規(guī)地實(shí)施。事實(shí)上，我們建議我們的方法學(xué)作為乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案的一部分，使得相關(guān)腫瘤學(xué)家在早期就能確定出特定疾病的結(jié)局，并能因此相應(yīng)匹配治療。因此，例如對于具有提示低生存率或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(即癌癥可能播散)的標(biāo)記的個體，可能要給予即刻的和攻擊形式的治療。同樣，當(dāng)個體具有提示低無病生存率的標(biāo)記， 且因此更有可能出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)時，可能需要更頻繁的隨診和檢測。相反地，如果個體具有提示無轉(zhuǎn)移的標(biāo)記，腫瘤學(xué)家可以給予侵入性和攻擊性較低的治療，據(jù)此使患者免于任何不必要的痛苦和不需要的副作用。我們的方法因此不僅能保證個體接受適應(yīng)于他們的遺傳構(gòu)成的治療，還能提高患者在治療期間的生活質(zhì)量，通過保證只在必需的病例中給予攻擊性的治療。因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查取自個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(A)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出這些標(biāo)志物的高水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定編碼組(B)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否具有高表達(dá)水平；和/或確定編碼組(C)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足(under expressed)；和/或確定編碼組(D)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足；以及如果鑒定出上面的表達(dá)模式，則推斷所述個體具有低的生存可能性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(C)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出這些標(biāo)志物的低水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(D)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足，如果它們是表達(dá)不足，則推斷個體具有低的生存可能性。在本發(fā)明的這個方面的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定組(A)中的基因和/或組(B)中的至少一個基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否是過量表達(dá)的，如果它們是過量表達(dá)的，則推斷個體具有低的生存可能性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面中，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(E)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出這些標(biāo)志物的高水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。在此所述癌癥復(fù)發(fā)包括指癌癥的局部復(fù)發(fā)(在乳腺或在遠(yuǎn)處部位)或者指轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定編碼組(F)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否具有高表達(dá)水平；和/或確定編碼組(G)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足；和/或確定編碼組(H)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足；以及如果鑒定出上面的表達(dá)模式，則推斷所述個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(G)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出這些標(biāo)志物的低水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(H)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足，如果它們是表達(dá)不足的，則推斷個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。在本發(fā)明的這個方面的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定組(E)中的基因和/或組(F)中的至少一個基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否是過量表達(dá)的，如果它們是過量表達(dá)的，則推斷個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組⑴中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出這些標(biāo)志物的高水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定編碼組(J)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否具有高表達(dá)水平；和/或確定編碼組(K)中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出該基因是否表達(dá)不足；和/或確定編碼組(L)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足；以及如果鑒定出上面的表達(dá)模式，則推斷所述個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組⑷中的分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出該標(biāo)志物的低水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(L)中的至少一個分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否表達(dá)不足，如果它們是表達(dá)不足，則推斷個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。在本發(fā)明的這個方面的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法學(xué)在其部分(a)中還包括確定組(I)中的基因和/或組(J)中的至少一個基因的表達(dá)水平，以確定出這些基因是否是過量表達(dá)的，如果它們是過量表達(dá)的，則推斷個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面中，提供了所有上面提及的方法的任何選擇的組合。在上述每個本發(fā)明方法中，該檢測理想地實(shí)施于人類乳腺癌組織，以及更優(yōu)選地實(shí)施于人類女性乳腺癌組織。在上述每個本發(fā)明方法中，理想地，對所檢查的組織樣品檢測RNA的存在，優(yōu)選地是總RNA，以及仍更優(yōu)選地是mRNA的量。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于檢測RNA含量的技術(shù)是公知的，并且實(shí)際上是臨床診斷領(lǐng)域中的技術(shù)人員常規(guī)地實(shí)行的。在本發(fā)明的可選的實(shí)施方式中，方法包括檢測每種分子標(biāo)志物所編碼的蛋白，因此通常(但不排外)包括應(yīng)用與相關(guān)蛋白結(jié)合并因此鑒定所述蛋白的試劑。常用的試劑是抗體，以及最理想地是單克隆抗體，所述單克隆抗體有利地已經(jīng)被合適的標(biāo)簽標(biāo)記，據(jù)此可以確定出結(jié)合抗體的存在。用于鑒定蛋白的檢測技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，并且實(shí)際上為臨床診斷領(lǐng)域的人員每日使用。另外，本發(fā)明的方法學(xué)可以包括在鑒定所選的標(biāo)志物之前擴(kuò)增所選的標(biāo)志物，在這種情況中，通常用PCR反應(yīng)實(shí)施擴(kuò)增，其中使用對所述分子標(biāo)志物特異性的寡核苷酸探針，以便在確定其存在之前擴(kuò)增所述分子標(biāo)志物，并考慮擴(kuò)增程度而確定其量。在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其它優(yōu)選的方法中，參照對照樣品確定出給定分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中對照樣品是無癌癥的乳腺組織樣品或者是來自具有在此所定義的中等預(yù)后的患者的乳腺組織樣品。更理想地是，該乳腺組織樣品取自未呈現(xiàn)該疾病的個體。可選地，對照是公認(rèn)的每個相關(guān)基因在健康個體中的表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)物。利用實(shí)時定量PCR可以測定出基因表達(dá)的水平，利用在Jiang等2003a或Parr和 Jiang 2004中所述的方法。生存可能性表示患者將在未來的10年存活的可能性。復(fù)發(fā)可能性表示癌癥將在 10年內(nèi)復(fù)發(fā)的可能性。轉(zhuǎn)移形式的癌癥表示癌癥將從起源的器官或組織播散到機(jī)體的另一個部分。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于實(shí)施任何一種或多種上面所提及的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括(a)多個用于檢測至少一組在上面提及的方法中所述的分子標(biāo)志物的探針；和(b)任選地，與所述探針應(yīng)用有關(guān)的試劑和說明書。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒，其包括(a)多個用于鑒定組(A)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用于鑒定組(C)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物，和/或組(B) 或(D)中的至少一個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒，其包括(a)多個用于鑒定組(E)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的進(jìn)一步的優(yōu)選方面中，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用于鑒定組(G)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物，和/或組(F) 或(H)中的至少一個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，提供了用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒，其包括(a)多個用于鑒定組(I)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用于鑒定組(K)中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物，和/或組(J) 或(L)中的至少一個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了包括上面提及的用于鑒定上面提及的分子標(biāo)志物組的探針組的任何選擇組合的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了包括任何一個或多個上面提及的用于鑒定任何一個或多個上面提及的分子標(biāo)志物組的表達(dá)水平的探針組的微陣列。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于確定患者的生存和/或乳腺癌復(fù)發(fā)的可能性和/或癌癥的轉(zhuǎn)移性質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一個包括多個用于鑒定至少一組在上面方法中所述的分子標(biāo)志物的探針的微陣列；以及任選地(b)第二個包括多個用于鑒定在代表所述標(biāo)志物的正常表達(dá)水平的內(nèi)標(biāo)物中的相同組的分子標(biāo)志物的探針的微陣列。本發(fā)明也提供了如上所述的微陣列或探針組。參照表1-3和

圖1-4，現(xiàn)在將通過下面的實(shí)施例描述本發(fā)明，其中圖1顯示了表1中的所有標(biāo)志物的Kaplan-Meier生存曲線。圖2顯示了表1中經(jīng)*標(biāo)示的標(biāo)志物的Kaplan-Meier生存曲線。圖3顯示了表2中的所有標(biāo)志物的Kaplan-Meier生存曲線。
圖4顯示了表2中經(jīng)*標(biāo)示的標(biāo)志物的Kaplan-Meier生存曲線。組織和細(xì)胞在手術(shù)后即刻收集乳腺腫瘤組織以及伴隨的正常組織，并冷凍備用。該試驗(yàn)經(jīng)過了當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的許可，試驗(yàn)主要在1991到1994年間進(jìn)行，有限的數(shù)目是在1995到 1996年期間收集的。目前的分析是基于中位數(shù)10年的隨診(到2004年6月)。本研究采用了乳腺癌組織(n = 120)和正常背景組織(n = 32)。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA MB 231、人成纖維細(xì)胞細(xì)胞系MRC-5購自歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC，索爾茲伯里， 英國)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購自TCS Biologicals(牛津，英國)。在手術(shù)后不久或在隨診時獲得病理信息、手術(shù)期間或手術(shù)后的臨床信息以及患者的臨床結(jié)局。組織處理將乳腺組織冰凍切片。切片被分成了下面的三個部分一個部分用于常規(guī)的組織學(xué)、一個部分用于免疫組織化學(xué)以及另一個部分用于制備RNA。從細(xì)胞和組織中提取RNA以及cDNA合成組織的冰凍切片被切成5-10 μ m厚度，并留取用于免疫組織化學(xué)和常規(guī)組織學(xué) (Jiang等2003a)。在冰冷RNA提取溶液中，用手執(zhí)式勻漿器將其他15到20個切片勻漿化。用UV分光光度計(jì)測定出RNA濃度。利用AbGene 提供的具有錨定寡dt引物的RT試劑盒以及利用Iyg總RNA在96孔板中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用β-肌動蛋白引物驗(yàn)證cDNA的質(zhì)量。RNA提取試劑盒和RT試劑盒都來自AbGene Ltd, Surrey, England, UK。用Beacon Designer (California，USA)設(shè)計(jì) PCR 引物，并經(jīng) hvitrogen Ltd (Paisley, Scotland, UK) 合成所述引物。分子生物學(xué)級的瓊脂糖和DNA梯都來自Invitrogen。用于常規(guī)PCR和定量 PCR 的 Mastermix 來自 AbGene0遺傳標(biāo)志物的定量分析基于由先前報道的方法(Jiang等2003a和2003b)修改的Amplifuor 技術(shù) (Nazarenko et al 1997)，用實(shí)時定量PCR從上面制備的cDNA確定出CCN家族成員的轉(zhuǎn)錄物水平。簡而言之，用Beacon Designer軟件(第2版，美國加利福尼亞)設(shè)計(jì)出一對PCR 引物。往其中一個引物(在我們實(shí)驗(yàn)室常規(guī)向反義引物)中加入稱作Z序列的附加序列 (5，actgaacctgaccgtaca，3), Z 序列與通用的 Z 探針(Nazarenko et at 1997) (Intergen Inc. ,England, UK)互補(bǔ)。用于β -肌動蛋白的Taqman 檢測試劑盒購自Perkin-Elmer 。用下面的試劑進(jìn)行反應(yīng)Hot-start Q-master mix (Abgene)、IOpmol特異性正向引物，Ipmol具有Z序列的反向引物、IOpmol FAM標(biāo)記的探針(Intergen Inc.)、和來自約 50ng RNA的cDNA (從RT反應(yīng)中的起始RNA計(jì)算得到)。用裝配有能實(shí)時檢測96個反應(yīng)的光學(xué)單元的ICyClerIQTM(Bi0-RadTM)進(jìn)行反應(yīng)，利用下面的條件94°C 12分鐘；50個循環(huán)的 94°C 15 秒、55°C 40 秒以及 72°C 20 分鐘(Jiang et al 2003b，2003c，Parr 和 Jiang 2004)。 從與樣品同時擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)物(Jiang et al 2003a)生成轉(zhuǎn)錄物的水平。在此用兩種方式顯示了結(jié)果基于相同量的RNA的轉(zhuǎn)錄物水平，或者作為靶/CK19比值。適宜情況下對分子的免疫組織化學(xué)染色用恒冷切片機(jī)將乳腺腫瘤和背景組織的冷凍切片切成6μπι厚(Jiang et al 2003c)。將切片放置于super frost plus顯微鏡載玻片上，風(fēng)干，然后將其在50%丙酮和 50%甲醇的混合物中進(jìn)行固定。然后將切片放置于“Optimax”洗滌緩沖液中5到10分鐘，以便進(jìn)行再水合。將切片在0. 6% BSA封閉溶液中溫育20分鐘，并用第一抗體探測。在充分洗滌之后，將切片在生物素化的第二抗體(Multilink豬抗-山羊/小鼠/兔免疫球蛋白，Dako he.)中溫育 30 分鐘。在洗滌之后，將 Avidin Biotin Complex (Vector Laboratories) 施用于切片，然后充分洗滌。然后往切片中加入二氨基聯(lián)苯胺色原(Vector Labs)，將其在暗處溫育5分鐘。然后在用二甲苯清洗和放上蓋玻片之前，將切片在Gill蘇木精中復(fù)染并在漸增等級的甲醇中脫水。利用我們先前所述的Optimas 6. O軟件(Davies et al 2000， King et al 2004)定量相應(yīng)蛋白的胞質(zhì)染色，并在此用相對染色強(qiáng)度表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用 Kaplan-Meier生存曲線和單變量分析(SPSSll)進(jìn)行生存分析。結(jié)果篩選的分子針對于包括10年隨診情況的完整臨床信息，我們已經(jīng)定量了 453個分子。在分析了生存率和疾病復(fù)發(fā)發(fā)生率之后，我們已經(jīng)開發(fā)出了三個標(biāo)記生存的分子標(biāo)記和發(fā)病預(yù)測的分子標(biāo)記以及轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記。生存的分子標(biāo)記如表1所示，發(fā)現(xiàn)51個分子與低生存率有著正相關(guān)，而14個分子與低生存率負(fù)相關(guān)。圖1顯示，預(yù)測92. 2%的具有在此被稱為“好標(biāo)記”(即沒有高表達(dá)表1左側(cè)欄中的分子以及沒有低表達(dá)表1右側(cè)欄中的分子)的個體可生存長達(dá)148. 9個月，而預(yù)測僅8. 3% 的具有在此被稱作“壞標(biāo)記”(即高表達(dá)表1左側(cè)欄中的分子以及低表達(dá)表1右側(cè)欄中的分子)的個體可生存長達(dá)40個月。該結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，ρ值< 0.00001。利用Kaplan-Meier生存曲線和單變量分析，我們通過鑒定出那些對統(tǒng)計(jì)學(xué)準(zhǔn)確性貢獻(xiàn)最多的分子(在表1中用*表示)改進(jìn)了分子標(biāo)記。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 33個主要分子標(biāo)志物造成了大多數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，其中25個與低生存率有著正相關(guān)，以及其中8個與低生存率有著負(fù)相關(guān)。圖2顯示了用第一個主要和第二個主要分子標(biāo)記預(yù)測的生存曲線， 預(yù)測93. 2%的具有好標(biāo)記的個體可生存長達(dá)149. 69個月，預(yù)測僅14. 4%的具有壞標(biāo)記的個體可生存長達(dá)52. 3個月(ρ < 0. 000001)。無發(fā)病預(yù)測的分子標(biāo)記如表2所示，發(fā)現(xiàn)48個分子與發(fā)病發(fā)生(復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移)有著正相關(guān)，而13個分子與發(fā)病發(fā)生負(fù)相關(guān)。圖3顯示，預(yù)測94. 5%的具有“好標(biāo)記”(即沒有高表達(dá)表2左側(cè)欄中的分子以及沒有低表達(dá)表2右側(cè)欄中的分子)的個體無疾病復(fù)發(fā)(即無病生存)可長達(dá) 150. 4個月，而預(yù)測僅有34. 5%的具有“壞標(biāo)記”(即高表達(dá)表2左側(cè)欄中的分子以及低表達(dá)表2右側(cè)欄中的分子)的個體能無病生存僅長達(dá)72. 4個月(ρ值< 0. 00001)。與上面的生存標(biāo)記一樣，我們也改進(jìn)了該標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)了 36個主要分子標(biāo)志物 (在表2中用*表示)造成了大多數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，其中觀個與復(fù)發(fā)有著正相關(guān)，以及其中8個與復(fù)發(fā)具有負(fù)相關(guān)。圖4顯示了用第三個主要和第四個主要分子標(biāo)記預(yù)測的生存曲線，預(yù)測91. 7%的具有好標(biāo)記的個體可無疾病復(fù)發(fā)長達(dá)148. 4個月，預(yù)測僅有5. 88%的具有壞標(biāo)記的個體可無任何疾病復(fù)發(fā)生存長達(dá)44. 2個月(ρ < 0. 000001)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記
如表3所示，發(fā)現(xiàn)37個分子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)，以及10個分子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)。這37個分子的組合已經(jīng)顯示91%的具有壞標(biāo)記(即高表達(dá)表3左側(cè)欄中的分子以及低表達(dá)表3右側(cè)蘭中的分子)的腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，88. 9%的具有好標(biāo)記 (即沒有高表達(dá)表3左側(cè)欄中的分子以及沒有低表達(dá)表3右側(cè)欄中的分子)的腫瘤沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P = 0. 00024)。如上所述，我們通過精選組合已經(jīng)改良了該標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)了 21個主要基因的組合也能很好地預(yù)測，其中20個基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著正相關(guān)，1個基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著負(fù)相關(guān)(在表3中用*表示)。89. 具有壞標(biāo)記的腫瘤有著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，86. 8%有著好標(biāo)記的腫瘤沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P = 0. 0000205)。參考文獻(xiàn)Davies et al 2000 :Davies G, Jiang WG, Mason MD. Cell-cell adhesion and signalling intermediates in human prostate cancer. Journal of Urology, 2000,163, 985-992Jiang et al 2003a Jiang WG, Watkins G, Lane J, Douglas-Jones A, Cunnick GH,Mokbel M,Mansel RE. Prognos tic value of Rho family and and rho-GDIs in breast cancer. Clinical Cancer Research,2003,9(17),6432-6440Jiang et al 2003b Jiang WG, Douglas-Jones A, and Mansel RE. Level of expression of PPAR-gamma and its co-activator (PPAR-GCA) in human breast cancer. International Journal of Cancer,2003,106,752-757Jiang et al 2003c :Jiang WG, Grimshaw D, Lane J, Martin TA, Parr C,Davies G, Laterra J, and Mansel RE. Retroviral hammerhead transgenes to cMET and HGF/ SF inhibited growth of breast tumour, induced by fibroblasts. Clinical Cancer Research,2003，9，4274—4281King et al 2004 =King JAC,Ofori-Acquah AF,Stevens T,Al-Mehdi AB,Fodstad 0，Jiang WG. Prognostic value of ALCAM in human breast cancer.Breast Cancer Research,2004, R478_487Nazarenko et al 1997 :Nazarenko IA, Bhatnagar SK, Hohman RJ. A closed tube format for amplification and detection of DNAbased on energy transfer. Nucleic Acids Res 1997 ；25 :2516-21Parr 禾口 Jiang 2004 :Parr C and Jiang WG. The Notch receptors, Notch-I and Notch-2, in human breast cancers. International Journal of Molecular Medicine, 2004 Nov ； 14 (5) :779-786表1.總生存的分子標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種試劑在制備用于通過下列確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒中的用途(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平 AAMP、AMFR、Bmp8、BMP9、 β -連環(huán)蛋白、CAR、Creb 12, DRIM、EHMS, Endomuscin2、FAK, FAP, Isotopol、Kissl/ckl9、Notchl、PARlA、ParlA2、PLC-delta、Psoriasin、PTTGl、RhoC、Rockl、 SDFl、SSTl、ST15、TEM6 和 TEM7R ；禾口(b)如果確定出這些標(biāo)志物的高水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。
2.權(quán)利要求1的用途，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平血管緊張素2R1、ATF4、BmplO, CASM、組織蛋白酶S、CX43、彈性蛋白酶PMN、 GIRK、HAVRU HIN, Isotopo3、Kissl、L0X12、N0S3、PMSA, S100A4、SEMPl、TACC2、遍在蛋白、 WISP2。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的用途，其中部分(a)還包括確定編碼以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平Bmp3、IL22R、IL24、JAK1、PTP-RK、Rho8/GdiG、Snail 和 WASP ；禾口(b)如果確定出這些標(biāo)志物的低水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌癥復(fù)發(fā)可能性。
4.權(quán)利要求3的用途，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平ATF3、Bmp4、BMPR1A、MENU Paracellin0
5.一種試劑在制備用于通過下列確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒中的用途(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平 BAF57、BNDF、CAR1、CASM、組織蛋白酶 _L、Crebl/2、CXCR10、DRIM、HERG、IL7R、IL_ll、Kissl、 MKKl、PMN-彈性蛋白酶、PTTPl、SDF5、TACC2、遍在蛋白、VIPRl 和 VUDP ；禾口(b)如果確定出這些標(biāo)志物的高水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。
6.權(quán)利要求5的用途，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平Angiomotin、BMP7、細(xì)胞周期蛋白D1、DNA連接酶-1、IGFBP7、LYVEl、NET2、 RH08、SRBC、Stath4, TGAse-3、粘著斑蛋白、WAVE2。
7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的用途，其中部分(a)還包括確定編碼分子標(biāo)志物 Paracellin的基因的表達(dá)水平；和(b)如果確定出該標(biāo)志物的低水平表達(dá)；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥。
8.權(quán)利要求7的用途，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標(biāo)志物的基因的表達(dá)水平ALCAM、Eplin、ERbeta、Glypic3、JAKl、MAGI-l、PEDF、PKC-eta、Stathlin、ffffOX。
9.任一先前權(quán)利要求的用途，其中癌癥組織取自于人。
10.任一先前權(quán)利要求的用途，其中癌癥組織取自雌性。
11.任一先前權(quán)利要求的用途，其中通過檢測RNA或mRNA的存在確定表達(dá)水平。
12.任一先前權(quán)利要求的用途，其中通過檢測分子標(biāo)志物編碼的蛋白確定表達(dá)水平。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述試劑與相關(guān)蛋白結(jié)合并由此鑒定所述相關(guān)蛋白。
14.權(quán)利要求13的用途，其中試劑是抗體。
15.權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的用途，其中在實(shí)施部分(a)之前，擴(kuò)增所選的標(biāo)志物。
16.權(quán)利要求15的用途，其中用PCR擴(kuò)增標(biāo)志物。
17.任一先前權(quán)利要求的用途，其中參照對照樣品確定給定分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中對照樣品是以下任何一種無癌癥的乳腺組織樣品、取自未呈現(xiàn)癌癥的個體的乳腺組織樣品、或公認(rèn)的每種相關(guān)分子標(biāo)志物在健康個體中的表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)物。
18.一種用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒，其包括(a)多種用于鑒定下面標(biāo)志物組中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物的探針AMFR、AAMP、 β -連環(huán)蛋白、Bmp8、BMP9、CAR、Creb 12, DRIM、EHMS, Endomuscin2、FAK, FAP, Isotopol、 Kissl/ckl9、Notchl、PAR1A、ParlA2、PLC-delta、Psoriasin、PTTGl、RhoC, Rockl、SDFl、 ST15、SST1、TEM6 禾Π TEM7R ；禾Π(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中試劑盒還包括(a)多種探針，其用于鑒定以下標(biāo)志物組中的至少一個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物血管緊張素 2R1、ATF4、BmplO, CASM、組織蛋白酶 S、CX43、彈性蛋白酶 PMN、GIRK、HAVRl、HIN、 Isotopo3、Kissl、L0X12、N0S3、PMSA, S100A4、SEMP1、TACC2、遍在蛋白、WISP2 ；和 / 或下面標(biāo)志物組中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物Bmp3、IL22R、IL24、JAKl、PTP-RK, Rho8/GdiG、 Snail和WASP ；和/或下面標(biāo)志物組中至少一個的至少一種轉(zhuǎn)錄物ATF3、Bmp4、BMPR1A、 MENl、Paracellin ；禾口(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。
20.一種用于確定哺乳動物乳腺癌的預(yù)后的試劑盒，其包括(a)多種用于鑒定以下標(biāo)志物組中的每個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物的探針BAF57、 BNDF、CARl、CASM、組織蛋白酶 _L、Creb 1/2、CXCRlO、DRIM、HERG、IL7R、IL-11、Kissl、MKKl、 PMN-彈性蛋白酶、PTTPl、SDF5、TACC2、VIPRl、VUDP 和遍在蛋白；禾口(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述試劑盒還包括(a)多種探針，其用于鑒定以下標(biāo)志物組中的至少一個基因的至少一種轉(zhuǎn)錄物 Angiomotin, BMP7、細(xì)胞周期蛋白 Dl、DNA 連接酶-1、IGFBP7、LYVEU NET2、RH08、SRBC, Stath4、TGAse-3、粘著斑蛋白、WAVE2 ；和/或以下標(biāo)志物組Paracellin ；和/或下面標(biāo)志物組中至少一個的至少一種轉(zhuǎn)錄物ALCAM、Eplin、ERbeta、Glypic3、JAKU MAGI-U PEDF, PKC-eta,Stathlin, WffOX ；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達(dá)水平的試劑和說明書。
22.一種用于確定患者的生存和/或乳腺癌復(fù)發(fā)可能性和/或癌癥的轉(zhuǎn)移性質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一種包括至少一組用于鑒定構(gòu)成權(quán)利要求1到8中所述的分子標(biāo)記的分子標(biāo)志物組的探針的微陣列；和任選地(b)包括多種用于鑒定在代表所述標(biāo)志物在無癌癥個體或具有中等預(yù)后的患者體內(nèi)的表達(dá)水平的內(nèi)標(biāo)物中的相同組分子標(biāo)志物的探針的第二微陣列。
23.權(quán)利要求22的微陣列。
24.權(quán)利要求18到21的任一項(xiàng)的一組探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于乳腺癌的預(yù)后的方法和試劑盒，包括其部分。具體地，方法包括鑒定出指示乳腺癌患者的生存可能性、和/或正接受乳腺癌治療的或已經(jīng)被治療的患者的疾病復(fù)發(fā)可能性、以及患者具有轉(zhuǎn)移形式的癌癥的可能性的基因表達(dá)模式、或分子標(biāo)記。已經(jīng)鑒定出了6個分子標(biāo)記，包括12群/組分子標(biāo)志物，其在確定給定乳腺癌的預(yù)后方面具有關(guān)聯(lián)性。每個分子標(biāo)記都包括多個遺傳標(biāo)志物，其相對于正常組織的高或低水平的表達(dá)是給定結(jié)局例如生存或復(fù)發(fā)的指示。
文檔編號C12N15/11GK102443627SQ201110315370
公開日2012年5月9日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月10日
發(fā)明者姜文國 申請人:加的夫生物學(xué)有限公司