專利名稱：一種抑制水牛膜分化抗原14 基因表達(dá)的小核糖核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因表達(dá)、核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)干擾和檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子，本發(fā)明還涉及該種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞分化抗原 14 (cluster of differentiation antigen，CD14)是一種存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的分化抗原，為體內(nèi)介導(dǎo)脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)生物效應(yīng)的重要受體之一。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)包括膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14 (membrane bound CD14, mCD14)和可溶性白細(xì)胞分化抗原 14 (soluble CD14, sCD14)兩種形式膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)是分子量為55千道爾頓(KD)的糖蛋白，其 C-末端借助糖基磷酯酰肌醇(glucose phosphatidylinositol, GPI)結(jié)構(gòu)錨附于細(xì)胞膜表面；可溶性白細(xì)胞分化抗原14(sCD14)分子有49KD和55KD兩種形式，缺乏糖基磷酯酰肌醇(GPI)錨。膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)是由含有白細(xì)胞分化抗原14(CD14) 基因的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，自行轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)多肽鏈，在高爾基復(fù)合體內(nèi)糖化后，其羧基端再與磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)結(jié)合，并由磷酯酰肌醇的磷脂部分與細(xì)胞膜連接。生理?xiàng)l件下，膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(membrane bound cluster of differentiation antigen,mCD 14)主要表達(dá)于成熟的單核巨噬細(xì)胞，微弱表達(dá)于中性粒細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳房細(xì)胞和B細(xì)胞，介導(dǎo)脂多糖(lipopolysaccharid^LPS)對這些細(xì)胞的激活作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的組成部分，其主要成分為脂多糖(LPQ，脂多糖一旦進(jìn)入體內(nèi)，將誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)的反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷。在革蘭氏陰性細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)過程中，脂多糖受體起著關(guān)鍵作用，是脂多糖作用的重要門戶。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)被認(rèn)為是脂多糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的脂多糖受體，白細(xì)胞分化抗原 14在介導(dǎo)脂多糖激活靶細(xì)胞及炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用；研究表明，通過抑制白細(xì)胞分化抗原14破壞脂多糖所激活的靶細(xì)胞炎癥反應(yīng)是一個可行的治療方法。核糖核酸干擾(RNA interference，RNAi)是指由特定雙鏈核糖核酸(double stranded RNA, dsRNA)引發(fā)同源信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)降解的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制。這類特定雙鏈核糖核酸被裂解成小(干擾)核糖核酸分子(siRNAs)，并能導(dǎo)致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸誘導(dǎo)的靜默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)作用下降解。核糖核酸干擾(RNAi，Ribonucleic acid interference)RNA 是目前簡單而高效地阻斷哺乳動物細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)的最有效方法之一，可達(dá)到基因敲除效果，且安全性好。但對于核糖核酸干擾(RNAi)來說，并不是所有針對靶基因信使核糖核酸 (mRNA)序列隨機(jī)合成的小核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干擾靶序列的選擇對干擾效率的影響是至關(guān)重要的。因此，對能有效抑制特異基因表達(dá)的小核糖核酸分子(siRNAs)的篩選是應(yīng)用核糖核酸干擾(RNAi)技術(shù)進(jìn)行基因功能、基因治療等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子，通過抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)的表達(dá)，增強(qiáng)水牛抵抗革蘭氏陰性菌感染的能力。本發(fā)明的另一目的是，提供一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子，所述的小核糖核酸分子基因序列信息是正義，CGAGGUAAAUGACCUGACUTT(5，_3，)；反義，A⑶CAG⑶CAUUUACCUCGTT(5，-3，))。本發(fā)明所采用的另一技術(shù)方案是，一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法，該方法按照以下步驟實(shí)施步驟1、重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-mCD14的構(gòu)建，具體步驟如下將pEGFP-Cl表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Dffia感受態(tài)細(xì)胞，取50微升菌液涂布于 Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，含卡那霉素，37°C倒置培養(yǎng)M小時，挑取單菌落接種于3毫升Luria-Bertani培養(yǎng)液中，含卡那霉素，37°C振蕩M小時，12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘離心2分鐘， 收集菌體，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP-Cl質(zhì)粒；用EcoRI和Kpnl雙酶切回收純化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物和pEGFP-Cl表達(dá)載體，在T4DNA連接酶的作用下，將酶切后的目的片段與真核表達(dá)載體pEGFP-Cl進(jìn)行連接，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-mCD14 ；步驟2、穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系的構(gòu)建，具體步驟如下人胚腎293細(xì)胞在含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基中， 于37°C、5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳的飽和濕度下培養(yǎng)；按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明書將重組質(zhì)粒 pEGFP-mCD14的轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞內(nèi)，簡述如下(1)在轉(zhuǎn)染的前一天，計(jì)數(shù)人胚腎293細(xì)胞并鋪于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到 60-80% ；(2)在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，用250微升無血清的優(yōu)化改良伊格氏完全培養(yǎng)基I分別稀釋2微克EGFP-mCD14質(zhì)粒和6微升轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻；(3)孵育5分鐘后，將稀釋的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合，輕微混勻后于室溫孵育20分鐘以利于形成脫氧核糖核酸DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物；(4)將脫氧核糖核酸DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物直接加入含細(xì)胞和無雙抗培養(yǎng)基的6孔板中，十字形輕搖以混勻；轉(zhuǎn)染M小時后，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時，用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按 1 10-20的比例稀釋傳代，待細(xì)胞貼壁后，在含有氨基糖苷類抗生素500微克/毫升的選擇性培養(yǎng)基中加壓篩選，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克??；采用極限稀釋法將克隆稀釋至96孔板進(jìn)行單克隆篩選，再將篩選出的單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)從而獲得穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞，對穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行熒光顯微鏡檢測和Western Blot鑒定，通過比較，穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14 融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞正確表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白；步驟3、有效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子 siRNAs的合成與合成，根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因的序列，按照小核糖核酸分子siRNAs 合成的基本原則，合成四對不同的針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的小核糖核酸分子 siRNAs ；步驟4、按照高效轉(zhuǎn)染試劑操作說明書的方法將四對小核糖核酸分子siRNAs轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系，具體步驟如下(1)用900微升完全培養(yǎng)基將5X 105個細(xì)胞鋪于12孔板內(nèi)；(2)分別用100微升無血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋9微升濃度為20微摩爾濃度的小核糖核酸分子siRNAs和9微升高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑，將兩者混合，充分混勻，室溫放置5-10分鐘；(3)將形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，與人胚腎293細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系混合， 十字形輕搖以混勻，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(4)37°C培養(yǎng)M小時后，更換新鮮的含10%胎牛血清的700微升杜比克改良伊格
氏完全培養(yǎng)基；步驟5、分別檢測各項(xiàng)指標(biāo)5. 1)轉(zhuǎn)染48小時后，用倒置熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，倒置熒光顯微鏡，檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達(dá)情況，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子能夠明顯抑制增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的表達(dá)；5. 2)轉(zhuǎn)染48小時后，流式細(xì)胞術(shù)檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白GFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀采用激發(fā)波長408nm，發(fā)射波長 507nm，檢測表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)量和平均熒光強(qiáng)度，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的表達(dá)；5. 3)轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞層1_2次，0. 125%的胰酶常規(guī)消化，收集細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞沉淀的情況，加入細(xì)胞裂解液50毫摩爾濃度三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，PH為8. 0，150納摩爾濃度氯化鈉，毫摩爾濃度的聚乙二醇辛基苯基醚， 0. 2%毫摩爾濃度疊氮鈉，0. 5%毫摩爾濃度脫氧膽酸鈉，10微克/毫升抑肽酶aprotinin， 1微克/毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將總蛋白等量上樣，在12%的分離膠的濃度下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的表達(dá)，
綜上所述，找出其中顯著表現(xiàn)出能特異且高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14蛋白表達(dá)的一個小核糖核酸分子siRNA。本發(fā)明的有益效果是，建立穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系(HEK293)，合成干擾水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因表達(dá)的不同小核糖核酸分子(short interfering RNAs, siRNAs)，并轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞系穩(wěn)定細(xì)胞系。通過熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞術(shù)檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡(western blot)鑒定其干擾效果，篩選出能高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因表達(dá)的小核糖核酸分子(siRNA)。為后續(xù)研究水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)在免疫及炎癥反應(yīng)中作用的分子機(jī)制和進(jìn)一步應(yīng)用核糖核酸干擾(RNAi)技術(shù)通過抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)的表達(dá)，增強(qiáng)水牛抵抗革蘭氏陰性菌感染的能力奠定了重要基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明方法中的重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP_mCD14的鑒定圖，圖中，從左到右標(biāo)示分別是M是指(XHindIII)；序號1和序號2是指原質(zhì)粒pEGFP-⑶14 ；序號3是指 PEGFP-CD14經(jīng)EcoR I和Kpnl雙酶切；序號4是指pEGFP_CD14經(jīng)Kpnl單酶切；序號5是指pEGFP-⑶14經(jīng)EcoR I單酶切；序號6是指pEGFP-⑶14經(jīng)BamHl單酶切2h ；序號7是指 PEGFP-CD14 經(jīng) BamHl 單酶切 2. 5h ；圖2是本發(fā)明方法中的穩(wěn)定表達(dá)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的人胚腎293 細(xì)胞系的構(gòu)建示意圖，其中圖a是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK293細(xì)胞系的熒光顯微鏡觀察照片；圖b是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的熒光顯微鏡觀察照片；圖c是對所建立的穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的Wfestern blot分析；圖3是本發(fā)明方法中的熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染小核糖核酸分子(siRNAs)后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度圖，其中，圖a是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的熒光顯微鏡觀察照片；圖b是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染無效siRNA (scramble siRNA)后的熒光顯微鏡觀察照片；圖c是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染抑制增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)的 siRNA (siRNA EGFP)后的熒光顯微鏡觀察照片；圖d是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA195 (siRNAl)后的熒光顯微鏡觀察照片；圖e是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA 664(siRNA2)后的熒光強(qiáng)度分析；圖f是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA902 (siRNA3)后的熒光強(qiáng)度分析；圖g是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA949 (siRNA4)后的熒光強(qiáng)度分析；圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染小核糖核酸分子(siRNAs)后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表達(dá)水平圖，其中，圖a是HEK293細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度分析；圖b是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度分析；圖c是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染無效siRNA (Scramble siRNA)后的的熒光強(qiáng)度分析；圖d是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染抑制增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)的 siRNA (siRNA EGFP)后的熒光強(qiáng)度分析；圖e是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA195 (siRNAl)后的熒光強(qiáng)度分析；圖f是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA664(siRNA2)后的熒光強(qiáng)度分析；圖g是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA902 (siRNA3)后的熒光強(qiáng)度分析；圖h是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系被轉(zhuǎn)染siRNA944(siRNA4)后的熒光強(qiáng)度分析；圖5是蛋白質(zhì)印跡(western blot)分析轉(zhuǎn)染小核糖核酸分子(siRNAs)穩(wěn)定細(xì)胞系的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的表達(dá)水平的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明依據(jù)一種水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)互補(bǔ)脫氧核糖核酸分子(cDNA)序列，該互補(bǔ)核糖核酸分子的基因序列(簡寫形式)為1 atggtgtgcg tgccctacct gttgctgctg ctgctgccgc cactgctgcgtgtgtctgcg61 gacacaacag aaccctgcga gctggacgac gacgatttcc gttgtgtctgcaacttcacg121 gatccgaagc ctgactggtc tagcgccgtt cagtgtatgg ttgccgtagaggtggagatc181 agtggcggcg gccgcagcct ggaacagttt ctcaagggag ccgacaccaacccgaagcag
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O
本發(fā)明的上述的能夠抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核
酸分子(siRNAs)，其生物學(xué)篩選原理是，先建立穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系(HEK293)；然后根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，合成四對不同的針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)的小核糖核酸分子(siRNAs)、應(yīng)用高效轉(zhuǎn)染試劑(HiPeri^ect Transfection Reagent)將該四對小核糖核酸分子(siRNAs)轉(zhuǎn)染該穩(wěn)定細(xì)胞系；再次，通過熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14) 融合蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的蛋白表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡(western blot)鑒定其干擾效果， 篩選出能高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因表達(dá)的小核糖核酸分子 (siRNA)；最后，綜合這些數(shù)據(jù)，比較發(fā)現(xiàn)其中的一條(即第4條949號)小核糖核酸分子 (siRNAs)能夠明顯抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)的表達(dá)。步驟1、重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP_mCD14的構(gòu)建，具體步驟如下將pEGFP-Cl表達(dá)載體轉(zhuǎn)化0冊￡1感受態(tài)細(xì)胞，取50微升(μ )菌液涂布于 Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素)，37°C倒置培養(yǎng)M小時，挑取單菌落接種于3 毫升(ml)Luria-Bertani培養(yǎng)液中(含卡那霉素)，37°C振蕩M小時，12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘 (rpm)離心2分鐘，收集菌體，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP-Cl質(zhì)粒；用EcoRI和Kpnl雙酶切回收純化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物和pEGFP-Cl表達(dá)載體，在T4DNA連接酶的作用下，將酶切后的目的片段(mCD14插入片段)與真核表達(dá)載體pEGFP-Cl進(jìn)行連接，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-mCD14，酶切鑒定見圖1，圖1中的分析情況表明，pEGFP_mCD14構(gòu)建正確。步驟2、穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系(HEK293)的構(gòu)建，具體步驟如下
人胚腎四3細(xì)胞(HEK293)在含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium,DMEM)中，于 37°C、5% (體積分?jǐn)?shù)) 二氧化碳(CO2)的飽和濕度下培養(yǎng)；按照轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM 2000, Invitrogen, USA)操作說明書將重組質(zhì)粒pEGFP-mCD14的轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞(HEK293)內(nèi)，簡述如下(1)在轉(zhuǎn)染的前一天，計(jì)數(shù)人胚腎293細(xì)胞(HEK293)并鋪于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到60-80% ；(2)在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，用250微升(μ )無血清的優(yōu)化改良伊格氏完全培養(yǎng)基I (Opti-MEM I)分別稀釋2微克(μ g) EGFP-mCD14質(zhì)粒和6微升(μ 1)轉(zhuǎn)染試劑 (LipofectamineTM 2000, hvitrogen，USA)，輕輕混勻；(3)孵育5分鐘后，將稀釋的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM2000， Invitrogen,USA)混合，輕微混勻后于室溫孵育20分鐘以利于形成脫氧核糖核酸(DNA)-轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM 2000, Invitrogen, USA)復(fù)合物；(4)將脫氧核糖核酸(DNA)-轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM 2000, Invitrogen,USA) 復(fù)合物直接加入含細(xì)胞和無雙抗培養(yǎng)基的6孔板中，十字形輕搖以混勻。轉(zhuǎn)染M小時后，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時，用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按 1 10-20的比例稀釋傳代，待細(xì)胞貼壁后，在含有氨基糖苷類抗生素(G418，500微克/毫升)的選擇性培養(yǎng)基中加壓篩選，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克?。徊捎脴O限稀釋法將克隆稀釋至96孔板進(jìn)行單克隆篩選，再將篩選出的單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)從而獲得穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚腎 293細(xì)胞(HEK293)，對穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行熒光顯微鏡檢測和flfestern Blot鑒定，結(jié)果見圖2 各個分圖，圖2中的分析情況表明，穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞(HEK293)正確表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白，而對照則否，說明穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建正確。圖2中，圖a是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK293細(xì)胞系的熒光顯微鏡觀察照片；圖b是穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14(mCD14)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系的熒光顯微鏡觀察照片；圖c是對所建立的穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)融合蛋白的HEK293 細(xì)胞系的Western blot分析。步驟3、有效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因表達(dá)的小核糖核酸分子(siRNAs)的合成與合成，根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，按照以下基本原則合成小核糖核酸分子(siRNAs)1) GC 含量 30 % -52% ；2) sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ；3)不含有反向重復(fù)序列；4) sense鏈的第19堿基為A ；5) sense鏈的第3堿基為A ；
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6) sense鏈的第10堿基為U ；7) sense鏈的第19堿基不是G/C ；8) sense鏈的第13堿基不是G，根據(jù)上述原則，本發(fā)明實(shí)施例中，合成了四對不同的針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)的小核糖核酸分子(siRNAs)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，該小核糖核酸分子(siRNAs)的保藏條件是，置于焦碳酸二乙酯(DEPC，diethypyrocarbonate)DEPC 水中，-20°C保存，表1是針對水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)合成的小核糖核酸分子(siRNAs)序列，表1本發(fā)明實(shí)施例合成的四對小核糖核酸分子(siRNAs)序列
權(quán)利要求
1.一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子，其特征在于，所述的小核糖核酸分子基因序列信息是 正義，CGAGGUAAAUGACC UGACUTT(5，_3，)； 反義，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5，-3，))。
2.一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子的生物學(xué)用途，其特征在于，所述的小核糖核酸分子基因序列信息是 正義，CGAGGUAAAUGACC UGACUTT(5，_3，)； 反義，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5，-3，))， 或者，所述的小核糖核酸分子計(jì)算機(jī)可讀版本是， <110>王鳳陽<120>抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子<160>1<210>1<211>21<212>RNA<213>水牛<400>1cgagguaaau gaccugacut t 21該小核糖核酸分子應(yīng)用于核糖核酸干擾技術(shù)，能特異且高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14蛋白表達(dá)，增強(qiáng)水牛抵抗革蘭氏陰性菌感染的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小核糖核酸分子的生物學(xué)用途，其特征在于根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，所述的小核糖核酸分子，按照以下基本原則合成1)GC含量 30% -52% ；2)sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ；3)不含有反向重復(fù)序列；4)sense鏈的第19堿基為A ；5)sense鏈的第3堿基為A ；6)sense鏈的第10堿基為U ；7)sense鏈的第19堿基不是G/C ；8)sense鏈的第13堿基不是G。
4.一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法，其特征在于，該方法按照以下步驟實(shí)施步驟1、重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-mCD14的構(gòu)建，具體步驟如下將pEGFP-Cl表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Dffia感受態(tài)細(xì)胞，取50微升菌液涂布于Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，含卡那霉素，37°C倒置培養(yǎng)M小時，挑取單菌落接種于3毫升Luria-Bertani培養(yǎng)液中，含卡那霉素，37°C振蕩M小時，12000轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘離心2分鐘，收集菌體，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取pEGFP-Cl質(zhì)粒；用EcoRI和Kpnl雙酶切回收純化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物和pEGFP-Cl表達(dá)載體，在T4DNA連接酶的作用下，將酶切后的目的片段與真核表達(dá)載體 pEGFP-Cl進(jìn)行連接，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-mCD14 ；步驟2、穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系的構(gòu)建，具體步驟如下人胚腎293細(xì)胞在含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基中， 于37°C、5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳的飽和濕度下培養(yǎng)；按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明書將重組質(zhì)粒 pEGFP-mCD14的轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞內(nèi)，簡述如下(1)在轉(zhuǎn)染的前一天，計(jì)數(shù)人胚腎293細(xì)胞并鋪于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到 60-80% ；(2)在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，用250微升無血清的優(yōu)化改良伊格氏完全培養(yǎng)基I分別稀釋2微克 EGFP-mCD14質(zhì)粒和6微升轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻；(3)孵育5分鐘后，將稀釋的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合，輕微混勻后于室溫孵育20分鐘以利于形成脫氧核糖核酸DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物；(4)將脫氧核糖核酸DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物直接加入含細(xì)胞和無雙抗培養(yǎng)基的6孔板中，十字形輕搖以混勻；轉(zhuǎn)染M小時后，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)對小時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1 10-20 的比例稀釋傳代，待細(xì)胞貼壁后，在含有氨基糖苷類抗生素500微克/毫升的選擇性培養(yǎng)基中加壓篩選，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克??；采用極限稀釋法將克隆稀釋至96孔板進(jìn)行單克隆篩選，再將篩選出的單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)從而獲得穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞，對穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行熒光顯微鏡檢測和Wfestern Blot鑒定，通過比較，穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞正確表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原 14融合蛋白；步驟3、有效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子siRNAs 的合成與合成，根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因的序列，按照小核糖核酸分子siRNAs合成的基本原則，合成四對不同的針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的小核糖核酸分子siRNAs ；步驟4、按照高效轉(zhuǎn)染試劑操作說明書的方法將四對小核糖核酸分子siRNAs轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系，具體步驟如下(1)用900微升完全培養(yǎng)基將5X105個細(xì)胞鋪于12孔板內(nèi)；(2)分別用100微升無血清的Opti-MEMI培養(yǎng)基稀釋9微升濃度為20微摩爾濃度的小核糖核酸分子siRNAs和9微升高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑，將兩者混合，充分混勻，室溫放置 5-10分鐘；(3)將形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，與人胚腎293細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系混合，十字形輕搖以混勻，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(4)37°C培養(yǎng)M小時后，更換新鮮的含10%胎牛血清的700微升杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基；步驟5、分別檢測各項(xiàng)指標(biāo)5. 1)轉(zhuǎn)染48小時后，用倒置熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，倒置熒光顯微鏡，檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達(dá)情況，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子能夠明顯抑制增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的表達(dá)；5. 2)轉(zhuǎn)染48小時后，流式細(xì)胞術(shù)檢測增強(qiáng)型綠色熒光蛋白GFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀采用激發(fā)波長408nm，發(fā)射波長507nm， 檢測表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)量和平均熒光強(qiáng)度，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的表達(dá)；5. 3)轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞層1-2次，0. 125%的胰酶常規(guī)消化，收集細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞沉淀的情況，加入細(xì)胞裂解液50毫摩爾濃度三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，PH為8. 0，150納摩爾濃度氯化鈉，毫摩爾濃度的聚乙二醇辛基苯基醚，0. 2% 毫摩爾濃度疊氮鈉，0. 5%毫摩爾濃度脫氧膽酸鈉，10微克/毫升抑肽酶aprotinin，1微克 /毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將總蛋白等量上樣，在12%的分離膠的濃度下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的表達(dá)，綜上所述，找出其中顯著表現(xiàn)出能特異且高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14 蛋白表達(dá)的一個小核糖核酸分子siRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法，其特征在于，所述的步驟3中的四個針對水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14合成的四對小核糖核酸分子，根據(jù)水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因的序列，按照以下基本原則合成小核糖核酸分子1)GC含量 30% -52% ；2)sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ；3)不含有反向重復(fù)序列；4)sense鏈的第19堿基為A ；5)sense鏈的第3堿基為A ；6)sense鏈的第10堿基為U ；7)sense鏈的第19堿基不是G/C ；8)sense鏈的第13堿基不是G。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法，其特征在于，所述的步驟3中的四個針對水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14合成的四對小核糖核酸分子siRNAs序列分別是起始位點(diǎn)正義(5 ‘-3 ‘)反義(5 ‘-3 ‘)陰性對照UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT第一對195#GCCUGGAACAGUUUCUCAATTUUGAGAAACUGUUCCAGGCTT第二對664#CCUCCAAUAUCUAGCGCUATTUAGCGCUAGAUAUUGGAGGTT第三對902#CUCAGCUGCAACAAGCUAATTUUAGCUUGUUGCAGCUGAGTT第四對949#CGAGGUAAAUGACCUGACUTTAGUCAGGUCAUUUACCUCGTT
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸分子的生物學(xué)篩選方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)印跡所用主要的抗體，一抗為兔抗膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14多克隆抗體，1 1000 倍稀釋，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶單抗，1 1000倍稀釋；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G，1 6000倍稀釋。
全文摘要
本發(fā)明的一種抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子，通過建立穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細(xì)胞系，合成不同小核糖核酸分子，并轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞系穩(wěn)定細(xì)胞系；通過熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14融合蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞術(shù)檢測其蛋白表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡鑒定其干擾效果，篩選出能高效抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因表達(dá)的小核糖核酸分子。本發(fā)明為進(jìn)一步應(yīng)用核糖核酸干擾技術(shù)通過抑制水牛膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的表達(dá)，增強(qiáng)水牛抵抗革蘭氏陰性菌感染的能力奠定了重要基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102533758SQ20111031740
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者張冬琳, 成鷹, 杜麗, 焦寒偉, 王鳳陽, 郝永昌, 雷明 申請人:海南大學(xué)