專利名稱：亞洲帶絳蟲microRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學領(lǐng)域，涉及一種亞洲帶絳蟲，具體是一種亞洲帶絳蟲micoRNA 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
亞洲帶絳蟲ijaenia asiatica)廣泛分布于東南亞，包括我國西南地區(qū)及臺灣，韓國、泰國、印尼和菲律賓等地。人們通過食生或半生含有亞洲帶絳蟲囊尾蚴的豬、或野豬的內(nèi)臟，特別是肝臟而感染，對人類健康和畜產(chǎn)品質(zhì)量影響極大。亞洲帶絳蟲成蟲形態(tài)與牛帶絳蟲成蟲相似，但其幼蟲卻與豬帶絳蟲的囊尾蚴相似。亞洲帶絳蟲成蟲與牛帶絳蟲成蟲的形態(tài)極為相似，人們長期以來把亞洲帶絳蟲誤認為是牛帶絳蟲。上世紀80年代以來人們對其形態(tài)學、流行分布、中間宿主及實驗動物感染、遺傳學進行了研究，但大部分工作仍局限在細胞水平。MicroRNAs (microRNAs)是一類大小長約20 25個核苷酸，內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在許多真核生物中都曾經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。這類RNA的功能主要是參與機體或細胞的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等過程。在寄生蟲研究領(lǐng)域，已有研究表明寄生線蟲存在獨特的microRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，它們可以通過microRNA實現(xiàn)對宿主和自身基因表達模式的精確調(diào)控，從而提高感染和自身增殖的幾率并逃避免疫監(jiān)視。通過選擇性地抑制或阻斷某一特定發(fā)育期線蟲的發(fā)育，從而減少和阻斷寄生線蟲的傳播途徑。亞洲帶絳蟲特異表達的microRNA有可能成為其免疫預防和化學防治的新分子靶標，為核酸疫苗的制備奠定基礎(chǔ)；也為豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的分類提供新的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種亞洲帶絳蟲micoRNA及其應(yīng)用，所述的這種亞洲帶絳蟲micoRNA及其應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中的抗蠕蟲藥物造成的寄生蟲抗藥性、以及動物產(chǎn)品和環(huán)境中含有藥物殘留的技術(shù)問題。本發(fā)明一種亞洲帶絳蟲microRNA，其核苷酸序列為如SEQ ID Ν0:η所示，η選自 1 - 170的正整數(shù)；或者與SEQ ID Ν0:η中的任何一條序列互補的序列。進一步的，所述的互補序列為DNA或RNA。進一步的，所述互補序列為經(jīng)過修飾的DNA或RNA。進一步的，所述互補序列為經(jīng)過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。本發(fā)明還提供了上述的任一亞洲帶絳蟲microRNA在制備亞洲帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抑制亞洲帶絳蟲成蟲生長發(fā)育的組合物，含有有效量的至少一個寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 170中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 170中的任何一條序列互補的序列。本發(fā)明還提供了一種基因芯片，包括一個固相載體，其特征在于在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 170中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID NO: 1 170中的任何一條序列互補的序列。本發(fā)明所提供的亞洲帶絳蟲特異表達的microRNA均分別克隆亞洲帶絳蟲的成蟲，成熟的microRNA序列長度為18 25 nt。對其microRNA進行深度測序，獲得亞洲帶絳蟲成蟲的microRNA表達譜，通過比對發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO 1 170所示的microRNA只在亞洲帶絳蟲成蟲中表達，而在參照基因組日本血吸蟲中不表達。因此，在亞洲帶絳蟲體內(nèi)過量表達SEQ ID NO :1 170分子或采用microRNA反向互補序列抑制SEQ ID NO :1 170的表達將影響亞洲帶絳蟲生理功能及器官分化相關(guān)的功能。此外，鑒于亞洲帶絳蟲與牛帶絳蟲和豬帶絳蟲的物種相似性，本發(fā)明所提供的亞洲帶絳蟲成蟲特異性microRNA及其反向互補序列亦可應(yīng)該用于影響牛帶絳蟲以及豬帶絳蟲的生理功能及分化相關(guān)的功能。因此，本發(fā)明亞洲帶絳蟲成蟲特異性表達的microRNA可用于制備帶絳蟲疫苗，特別是亞洲帶絳蟲疫苗。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是顯而易見的。本發(fā)明的亞洲帶絳蟲成蟲特異表達的microRNA可以選擇性的抑制或阻斷某一特定發(fā)育期蟲體的發(fā)育，從而減少或阻斷寄生蟲，尤其是亞洲帶絳蟲的傳播。本發(fā)明microRNA制備成為亞洲帶絳蟲疫苗時，作為核酸疫苗，避免了傳統(tǒng)抗蠕蟲藥物造成的全球性分布的寄生蟲抗藥性問題，也不會導致動物產(chǎn)品或環(huán)境種內(nèi)藥物的殘留。
具體實施例方式實施例1
microRNA的獲得 1.總RNA抽提
1)將樣本(亞洲帶絳蟲成蟲孕節(jié)一片)放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50 - IOOmg組織/ml Trizol加入Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管；
2)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min ；
3)在4°C條件下，以 12000r/min 離心 15min ；
4)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，然后在 4°C條件下靜置10- 15min ；
5)在4°C條件下，以12000r/min離心15min，小心并盡可能去掉上清；
6)用ImL75%乙醇洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以12000r/min離心8min，然后小心棄去乙醇；
7)將RNA沉淀進行干燥(不能完全干燥)處理后，用10μ L RNase - free水將RNA溶解， 直接用于反轉(zhuǎn)錄。2.總RNA純度和完整性檢測
1)純度檢測取1 μ L RNA樣品50倍稀釋，在BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀上測定OD值，OD 260/0D 280的比值大于1. 8。
4
2)總RNA完整性取RNA樣品1 μ L，1%瓊脂糖凝膠電泳80 VX 20 min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA 5S rRNA, 18S rRNA和^S rRNA條帶，三條帶條帶完整。3. small RNA序列的獲得和篩選
用15% PAGE膠回收20-30 nt的small RNA，加上5，和3，端接頭(購自Illumina公司)后實施RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自hvitrogen公司)。產(chǎn)物經(jīng)6 %TBE PAGE膠純化后進行Solexa測序。然后屏蔽掉可能為接頭序列的部分、測序質(zhì)量差的序列(例如測序信號很低等)及長度小于18 nt的序列獲得clean reads。4. microRNA 的鑒定
用 BLAST 程序(NCBI，www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 與 GenBank 禾口 Rfam database (version 9.0) (http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/microRNA) 進行比對分析，去除非編碼RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA,和other ncRNA ； 通過Repeatmasker (http://www. repeatmasker. org)去除轉(zhuǎn)座子等重復序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)數(shù)據(jù)庫，尋找序列相似性microRNA。將亞洲帶絳蟲所表達的microRNA與已報道的日本血吸蟲進行比較，分別屏蔽掉兩兩共有相關(guān)的序列，獲得亞洲帶絳蟲未注釋的microRNA (例舉170條)。此外，為了提高反向互補序列的作用和細胞內(nèi)穩(wěn)定性，上述亞洲帶絳蟲特異性 microRNA的反向互補序列可以是DNA或RNA，還可以對反向互補序列進行硫代、甲氧基等修飾。實施例2
本發(fā)明一種基因芯片，包括一個固相載體，在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 170中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 170中的任何一條序列互補的序列。由于芯片的制造技術(shù)屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種亞洲帶絳蟲microRNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:η所示，η選自 1 - 170的正整數(shù)；或者與SEQ ID NO:η中的任何一條序列互補的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞洲帶絳蟲microRNA，其特征在于所述的互補序列為DNA 或 RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的亞洲帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補序列為經(jīng)過修飾的DNA或RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞洲帶絳蟲microRNA，其特征在于所述互補序列為經(jīng)過硫代修飾或甲氧基修飾的DNA或RNA。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的亞洲帶絳蟲microRNA在制備亞洲帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。
6.一種抑制亞洲帶絳蟲成蟲生長發(fā)育的組合物，其特征在于含有有效量的至少一個寡核苷酸，所述的寡核苷酸特異性的對應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 170中任一所示的 microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 170中的任何一條序列互補的序列。
7.一種基因芯片，包括一個固相載體，其特征在于在所述的固相載體上固定有至少一個寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應(yīng)于如SEQ ID NO: 1 170中任一所示的microRNA序列或者與SEQ ID N0:1 170中的任何一條序列互補的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種亞洲帶絳蟲microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:n所示，n選自1－170的正整數(shù)；或者與SEQIDNO:n中的任何一條序列互補的序列。本發(fā)明還提供了上述的任一所述的亞洲帶絳蟲microRNA在制備亞洲帶絳蟲疫苗中的應(yīng)用。還提供了一種抑制亞洲帶絳蟲生長發(fā)育的組合物。本發(fā)明還提供了一種基因芯片。本發(fā)明首次從亞洲帶絳蟲分離獲得一類新的microRNA，這些microRNA在亞洲帶絳蟲生活史中的表達具有重要意義，可用于影響亞洲帶絳蟲幼蟲生理功能，發(fā)育，分化相關(guān)等功能，并為制備亞洲帶絳蟲基因工程疫苗以及防治亞洲帶絳蟲病提供了新的途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102329797SQ20111031801
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者劉宏坤, 周曉農(nóng), 張永年, 徐民俊, 朱興全, 李 浩, 王尚位, 艾琳, 郭儉, 陳家旭, 陳木新, 陳紹榮, 陳韶紅 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所