專利名稱：微生物酶轉(zhuǎn)化棘白菌素b的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)微生物酶將棘白菌素B轉(zhuǎn)化為棘白菌素B母核的方法。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)70年代以來(lái)，真菌感染無(wú)論是其發(fā)生頻率還是感染種類都在不斷地增加，特別是在免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者、腫瘤患者以及那些患有其它疾病而正進(jìn)行免疫治療的患者中。直到20世紀(jì)80年代末和90年代咪唑類及三唑類抗真菌藥物的研發(fā)成功，臨床方能有效而安全地控制真菌感染。雖然這些藥物對(duì)控制臨床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于這些藥物選擇性差、耐藥真菌的出現(xiàn)以及對(duì)諸如曲霉和白色念珠菌等真菌的敏感性不強(qiáng)等原因，深部真菌感染疾病的死亡率仍居高不下。因此，尋找一種新的安全有效的抗真菌藥物就顯得尤為重要。眾所周知，真菌細(xì)胞具有細(xì)胞壁而哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁。因此，真菌細(xì)胞壁是新型抗真菌藥物的理想靶點(diǎn)。棘白菌素類藥物是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物，由相似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈組成，該脂類側(cè)鏈通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性作用機(jī)制抑制β-(1，3)- -葡聚糖的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁葡聚糖的排空、滲透不穩(wěn)定以及真菌細(xì)胞的溶解而發(fā)揮其抗真菌作用。其作用機(jī)制獨(dú)特，不良發(fā)應(yīng)率低，且對(duì)一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是對(duì)諸如曲霉和白色念珠菌等感染趨勢(shì)上升的真菌具有良好的殺滅作用。棘白菌素類抗生素主要有三種類型:B，C和D。其中棘白菌素B (Echinocandin B, ECB)是最主要的類型。ECB,是于1974年Nyfeler R.等人發(fā)現(xiàn)的由曲霉菌屬Aspergilus nidulans和Aspergilusrugulosus發(fā)酵產(chǎn)生的,但由于酰基側(cè)鏈的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可以得到一些具有臨床應(yīng)用價(jià)值的化合物，如西洛芬凈(Cilofungin)、卡帕芬凈(Caspofungin, MK991)、米卡芬凈(Micafungin, FK463)、阿尼芬凈(Anidulafungin, LY303366)。西洛芬凈由于毒性和劑型問(wèn)題終止了研究開發(fā)，但后三者已先后在美國(guó)(2001年)、日本(2002年)、美國(guó)(2006年)首次上市。其中阿尼芬凈是由禮來(lái)公司和Vicuron Pharmaceuticals公司聯(lián)合研制開發(fā),給藥途徑為靜脈滴注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，同卡泊芬凈和米卡芬凈相比，阿尼芬凈對(duì)煙曲霉菌活性更強(qiáng)，對(duì)白色念珠菌活性相對(duì)較弱。其制備過(guò)程包括以下兩步:(I)通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化——游動(dòng)放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的脫?；笇?duì)棘白菌素B(Echinocandin B, ECB)進(jìn)行催化，使側(cè)鏈斷裂，生成母核(EchinocandinB Nucleus,ECBN)和不飽和脂肪酸側(cè)鏈。(2)在母核的基礎(chǔ)上采用化學(xué)合成的方法加入新的側(cè)鏈——戊氧-三苯羧基。其中母核的制備是關(guān)鍵步驟。目前對(duì)于ECB母核的制備，化學(xué)方法成本較高，微生物轉(zhuǎn)化具有以下優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物單一、高度的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性、易于純化、不污染環(huán)境且能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng) 。美國(guó)專利US7785826B2詳細(xì)介紹了 ECB轉(zhuǎn)化ECBN的工藝。此工藝主要流程包括:將ECB發(fā)酵完成以后，離心獲得菌絲體，把菌絲體重新懸浮于水中然后加入脫酰酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化。但此工藝轉(zhuǎn)化耗時(shí)20 30h，且ECB脫酰酶僅利用一次。因此，仍需開發(fā)微生物酶轉(zhuǎn)化棘白菌素B的方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述狀況，本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)單的將棘白菌素B(ECB)轉(zhuǎn)化成棘白菌素B母核(ECBN)的方法，該方法包括以下步驟:I)微生物發(fā)酵獲得棘白菌素B脫酰酶；2)發(fā)酵完成后，往發(fā)酵液中添加磷酸鹽，進(jìn)行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液；3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液；4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉(zhuǎn)化為棘白菌素B母核，轉(zhuǎn)化完成后，過(guò)濾，取濾液；5)濾液過(guò)大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機(jī)溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來(lái)。以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明方法的各步驟:上述方法的步驟I)中，發(fā)酵所用菌株可以是天然產(chǎn)酶菌，例如猶他游動(dòng)放線菌；也可以是基因工程菌，例如白色鏈霉菌基因工程菌株。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的條件進(jìn)行棘白菌素B脫酰酶的發(fā)酵。

棘白菌素B脫酰酶為一種鹽溶性蛋白，且結(jié)合在細(xì)胞膜上。棘白菌素B脫酰酶發(fā)酵完成后，在發(fā)酵液中添加一定量的磷酸鹽以形成酸堿緩沖體系，使得磷酸鹽的濃度為0.05M-0.15M，從而提供一定的離子強(qiáng)度以及穩(wěn)定的pH環(huán)境，利于棘白菌素B脫酰酶的溶解和穩(wěn)定。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述方法的步驟2)中，調(diào)節(jié)所述緩沖體系的pH為6-7。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，超聲該酸堿緩沖體系1-2小時(shí)。超聲有利于脫酰酶從細(xì)胞膜上脫離下來(lái)。離心取上清液，即得棘白菌素B脫酰酶粗酶液。得到棘白菌素B脫酰酶粗酶液后，需對(duì)該粗酶液進(jìn)行純化。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述純化包括使粗酶液旋蒸濃縮并抽濾的步驟。旋蒸后有雜蛋白沉淀出現(xiàn)，抽濾以去除雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。因此上述方法的步驟3)的主要作用是去除棘白菌素B脫酰酶粗酶液中的雜蛋白，并且使酶液得到一定程度的濃縮，提高酶轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述旋蒸溫度為45-50°C，旋蒸時(shí)間為1-2小時(shí)；所述濃縮為將體積減少至原體積的50-80%。由于棘白菌素B水溶性極差，已公開的轉(zhuǎn)化方法多采用DMSO為助溶劑，本發(fā)明方法的步驟4)中用乙醇替代DMSO作為棘白菌素B助溶劑。乙醇與DMSO相比具有環(huán)境友好、無(wú)毒、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，且意外發(fā)現(xiàn)利用乙醇作為棘白菌素B助溶劑轉(zhuǎn)化效率更高。將溶于乙醇的棘白菌素B添加到脫酰酶酶液中配成反應(yīng)體系，通常將配制好的反應(yīng)體系置于轉(zhuǎn)化反應(yīng)器內(nèi)，充分?jǐn)嚢瑁D(zhuǎn)化完成后，抽濾，濾液即棘白菌素B母核。用HPLC定量檢測(cè)濾液中棘白菌素B母核的含量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述轉(zhuǎn)化時(shí)間可以為6-12小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述乙醇的濃度為大于或等于95% (體積)。最后一步，濾液過(guò)大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，然后用有機(jī)溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來(lái)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物棘白菌素B母核能夠完全吸附于樹脂上，而一些極性較大雜質(zhì)則不能吸附。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述方法的步驟5)中上柱后用濃度為30-60%的甲醇水溶液(體積)能夠?qū)⒓拙谺母核完全解析下來(lái)，液相純度達(dá)到90%以上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述大孔吸附樹脂可以選自HP20或XAD18。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，上柱后脫酰酶酶液按步驟4)-5)可重復(fù)使用2-4次。棘白菌素B脫酰酶能夠重復(fù)使用是其他已公開的工藝中所未報(bào)道的，重復(fù)使用棘白菌素B脫酰酶能夠有效降低生產(chǎn)成本，減少能耗。本發(fā)明將ECB轉(zhuǎn)化為ECBN方法的摩爾轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，產(chǎn)物易于分離純化，能夠有效提高后期分離純化的收率和純度，ECB脫酰酶能夠重復(fù)使用。因此適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，具有很好的商業(yè)價(jià)值。


圖1是實(shí)施例1第I次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；圖2是實(shí)施例1第4次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；

圖3是實(shí)施例2第I次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；圖4是實(shí)施例2第3次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；圖5是實(shí)施例3第I次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；圖6是實(shí)施例3第4次轉(zhuǎn)化后HPLC圖譜；圖7是實(shí)施例1第I次轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化液過(guò)柱后HPLC圖譜；圖8是實(shí)施例2第I次轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化液過(guò)柱后HPLC圖譜；圖9是實(shí)施例3第I次轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化液過(guò)柱后HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式除非另有所指，實(shí)施例中的％為重量百分比。以下實(shí)施例中，HPLC檢測(cè)法的條件如下:流動(dòng)相:0.2%乙酸銨水溶液:乙腈=95: 5；柱型號(hào):C18，150X4.60mm，3ym;柱溫:40°C；流速:0.7ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng):222nm。本發(fā)明實(shí)施例中所用試劑均可從市售獲得。其中酵母粉(Yeastextract)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；蛋白胨(Trypton)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，麥芽浸粉購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司；蔗糖購(gòu)自上海藍(lán)平實(shí)業(yè)有限公司；葡萄糖購(gòu)自上海西王淀粉糖有限公司；花生柏粉購(gòu)自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司；燕麥粉購(gòu)自天津化工經(jīng)銷部；其余生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。HP20樹脂由日本三菱化學(xué)公司生產(chǎn)，XAD18樹脂購(gòu)自羅門哈斯公司。實(shí)施例1:I)、棘白菌素B脫酰酶的發(fā)酵菌種:猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心。培養(yǎng)基配方:斜面培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂
2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養(yǎng) 5-7 天種子培養(yǎng)基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養(yǎng) 4_5 天發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =
6.8，30°C 培養(yǎng) 3-4 天2)、發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2Η20濃度分別為6.1Og/L和5.8g/L，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，超聲lh，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積80%，旋蒸溫度為45°C，旋蒸時(shí)間為lh。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現(xiàn)，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于95%乙醇中，添加到脫酰酶酶液內(nèi)配成反應(yīng)體系，體系內(nèi)棘白菌素B濃度控制在4mg/ml。將配制好的反應(yīng)體系置于轉(zhuǎn)化反應(yīng)器內(nèi)，充分?jǐn)嚢瑁?8°C，150rpm，轉(zhuǎn)化12h。轉(zhuǎn)化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測(cè)棘白菌素B母核含量，并計(jì)算底物棘白菌素B的摩爾轉(zhuǎn)化率為93%。摩爾轉(zhuǎn)化率％ =生成ECBN摩爾數(shù)/底物ECB摩爾數(shù)X 100%5)、轉(zhuǎn)化后濾液過(guò)大孔吸附樹脂HP20，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為40%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來(lái)，由圖7計(jì)算的液相純度達(dá)到93.3 %。6)、上柱后酶液按步驟4) 5)重復(fù)使用3次，摩爾轉(zhuǎn)化率分別為94%、90 %、86%。實(shí)施例2I)、棘白菌素B脫酰酶的發(fā)酵菌種:猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心。培養(yǎng)基配方:斜面培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂
2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養(yǎng) 5-7 天種子培養(yǎng)基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養(yǎng) 4_5 天發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =
6.8，30°C 培養(yǎng) 3-4 天2)、發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20濃度分別為
18.20g/L和15.15g/L，NaOH調(diào)pH為7.0，超聲2h，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積50%，旋蒸溫度為45°C，旋蒸時(shí)間為2h。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現(xiàn)，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即為棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于無(wú)水乙醇中，添加到脫酰酶酶液內(nèi)配成反應(yīng)體系，體系內(nèi)棘白菌素B濃度控制在2mg/ml。將配制好的反應(yīng)體系置于轉(zhuǎn)化反應(yīng)器內(nèi)，充分?jǐn)嚢瑁?8°C，150rpm,轉(zhuǎn)化6h。轉(zhuǎn)化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測(cè)棘白菌素B母核含量，并計(jì)算底物棘白菌素B的摩爾轉(zhuǎn)化率為86%。摩爾轉(zhuǎn)化率％ =生成ECBN摩爾數(shù)/底物ECB摩爾數(shù)X 100%5)、轉(zhuǎn)化后濾液過(guò)大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為60%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來(lái)，由圖8計(jì)算的液相純度達(dá)到90.7%。6)、上柱后酶液按步驟4 5重復(fù)使用2次，棘白菌素B的摩爾轉(zhuǎn)化率為90%、86%。實(shí)施例3I)、棘白菌素B脫酰酶的發(fā)酵菌種:猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心。培養(yǎng)基配方:斜面培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養(yǎng) 5-7 天種子培養(yǎng)基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養(yǎng) 4_5 天發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =6.8，30°C 培養(yǎng) 3-4 天 2)、發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20濃度分別為12.20g/L和10.15g/L，調(diào)節(jié)pH為6.8，超聲1.5h，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積70%，旋蒸溫度為50°C，旋蒸時(shí)間為1.5h。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現(xiàn)，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于無(wú)水乙醇中，添加到脫酰酶酶液內(nèi)配成反應(yīng)體系，體系內(nèi)棘白菌素B濃度控制在3mg/ml。將配制好的反應(yīng)體系置于轉(zhuǎn)化反應(yīng)器內(nèi)，充分?jǐn)嚢瑁?8°C，150rpm，轉(zhuǎn)化12h。轉(zhuǎn)化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測(cè)棘白菌素B母核含量，并計(jì)算底物棘白菌素B的摩爾轉(zhuǎn)化率為93%。摩爾轉(zhuǎn)化率％ =生成ECBN摩爾數(shù)/底物ECB摩爾數(shù)X 100%5)、轉(zhuǎn)化后濾液過(guò)大孔吸附樹脂XAD18，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為50%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來(lái)，由圖9計(jì)算的液相純度達(dá)到92.6%。6)、上柱后酶液 按步驟4 5重復(fù)使用3次，棘白菌素B的摩爾轉(zhuǎn)化率為90%、85%,85%o
權(quán)利要求
1.將棘白菌素B轉(zhuǎn)化成棘白菌素B母核的方法，包括以下步驟: 1)微生物發(fā)酵獲得棘白菌素B脫酰酶； 2)發(fā)酵完成后，往發(fā)酵液中添加磷酸鹽，進(jìn)行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液； 3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液； 4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉(zhuǎn)化為棘白菌素B母核，轉(zhuǎn)化完成后，過(guò)濾，取濾液； 5)濾液過(guò)大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機(jī)溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟I)中的發(fā)酵所用菌株為天然產(chǎn)酶菌或基因工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方 法，其中所述步驟I)中的發(fā)酵所用菌株為猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utahensis)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟2)所述超聲持續(xù)l_2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中往發(fā)酵液中添加磷酸鹽，使得磷酸鹽的濃度為0.05M-0.15M。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中將所述發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)為6-7。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟3)所述純化包括使粗酶液旋蒸濃縮并抽濾的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟3)中所述旋蒸溫度為45-50°C，旋蒸時(shí)間為1-2小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述步驟3)中所述濃縮為將體積減少至原體積的50-80%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述大孔吸附樹脂選自HP20或XAD18。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述轉(zhuǎn)化時(shí)間為6-12小時(shí)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述乙醇的濃度為大于或等于95%。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟5)中所述有機(jī)溶劑為甲醇水溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述甲醇水溶液的濃度為30-60%。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中上柱后脫酰酶酶液按步驟4)-5)可重復(fù)使用2-4次。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物酶轉(zhuǎn)化棘白菌素B的方法，包括以下步驟1)微生物發(fā)酵獲得棘白菌素B脫酰酶；2)發(fā)酵完成后，往發(fā)酵液中添加磷酸鹽，進(jìn)行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液；3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液；4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉(zhuǎn)化為棘白菌素B母核，轉(zhuǎn)化完成后，過(guò)濾，取濾液；5)濾液過(guò)大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機(jī)溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來(lái)。本發(fā)明方法的摩爾轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，產(chǎn)物易于分離純化，且ECB脫酰酶能夠重復(fù)使用。
文檔編號(hào)C12R1/045GK103074403SQ20111033011
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者李繼安, 陳詳, 阮建昌, 林慧敏, 陳代杰, 沈劍鋒, 阮霞琴, 石飛燕, 董華成 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 浙江震元制藥有限公司