專利名稱：Mlpa長探針制備方法、轉(zhuǎn)基因玉米mlpa長探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分子檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于MLPA檢測技術(shù)的長探針的制備方法，由此方法制備的用于轉(zhuǎn)基因玉米MLPA檢測的長探針，以及轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測。
背景技術(shù)：
目前基因檢測以PCR技術(shù)為主，檢測快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。然而，PCR 方法單管只分析一個基因，效率低。當(dāng)前要對如眾多轉(zhuǎn)基因品種和品系逐一篩查，工作量太大，成本高。因此，基因檢測急需一種高通量檢測方法。常見的高通量基因檢測技術(shù)有基因芯片、多通道毛細(xì)管電泳和DHPLC分離技術(shù)等。然而，這些方法一般只能進行“單對多”的檢測(單樣品對多項目)，“多對多”方式的檢測(多樣品對多項目)能力有限，其有限高通量的發(fā)揮還取決于上機樣品所含被檢目標(biāo)基因數(shù)。為一次性獲得多目標(biāo)DNA片段，人們采用多重PCR法，但引物間相互干擾和引物多聚體使該技術(shù)檢測基因數(shù)目很難超過10個。多重連接依賴探針擴增技術(shù)(Multiplex Ligation dependent Primers Amplification MLPA)由荷蘭的Dr. Schouten JP于2002年報道，最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測目的。其原理是針對不同的感興趣基因位點設(shè)計長度各不相同的探針對，探針對兩序列的一端具基因特異性，它們與各自目標(biāo)基因區(qū)域復(fù)性后僅留一缺口，于此同時所有探針對中與目的基因不雜交的一端都接有相同的堿基序列(既通用序列)用于PCR，這樣當(dāng)探針對與目標(biāo)區(qū)復(fù)性并在連接酶的作用下相連而本身成為PCR模板DNA，并由一對公用引物擴增而以信號放大，由于針對不同的感興趣基因位點設(shè)計的探針對長度各不相同，經(jīng)分離PCR產(chǎn)物大小(不須測序)便可知道是否有目標(biāo)基因的存在，在并能進行相對定量分析。MLPA技術(shù)包括探針的設(shè)計、探針和靶序列DNA進行雜交，之后通過連接、PCR擴增， 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集等過程。具有經(jīng)濟(不需昂貴設(shè)備)、特異性高(探針復(fù)性及連接酶識別)及高通量(單管可測多達(dá)40多個基因)的特點。 此外，該法檢測所針對的基因目標(biāo)區(qū)可短至40-50bp，特別適于DNA高度降解樣品的檢測。 至今，MLPA技術(shù)已應(yīng)用于很多領(lǐng)域，如單核苷酸多態(tài)性和基因突變檢測、基因片段缺失和重復(fù)、染色體數(shù)目異常、基因甲基化檢測及mRNA分析等等。以上MLPA技術(shù)原理顯示，多基因位點憑其最終PCR擴增片段長度的不同而相互區(qū)別。為了能清晰分辨不同基因位點PCR擴增片段DNA，特別是在采用低分辨率的瓊脂糖凝膠電泳分析MLPA產(chǎn)物時，必須拉開各擴增片段的差距。因此，在單鏈探針設(shè)計和制備時必須將探針之間的大小拉開，隨著被檢測目的基因的增加，單鏈探針的長度也要增加，而單鏈長探針的制備則是難點。單鏈探針制備最簡單的方法是采用化學(xué)合成法，但是，當(dāng)單鏈探針超過IOObp時， 化學(xué)合成法則不合適，因為出現(xiàn)合成錯誤的概率大大增加，合成的產(chǎn)量也大大降低。為克服單鏈探針制備的困難，發(fā)明MLPA的荷蘭公司MRC-Holland開發(fā)了基于一套M13載體的單鏈探針制備方法，其原理就是將各M13載體的大小不同的無關(guān)序列或無關(guān)的模板(Unrelated Template, UT)引入單鏈探針從而獲得長度不同的單鏈探針。該單鏈探針生物方法非常繁瑣，不僅需要基因克隆、病毒轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒提取等過程，還必須購買一套昂貴的M13載體，此外，操作M13病毒極易發(fā)生污染。為壟斷MLPA應(yīng)用市場，現(xiàn)在荷蘭公司MRC-Holland不再出售M13載體，因此，單鏈長探針的制備急待克服。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述MLPA長探針生物制備方法繁瑣的問題，提供一種簡單、 無污染、高效的MLPA長探針制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于轉(zhuǎn)基因玉米MLPA檢測的長探針、短探針以及轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公布了一種MLPA長探針的制備方法，包括采用引物對以模板進行不對稱 PCR擴增，然后用限制性內(nèi)切酶處理不對稱PCR擴增產(chǎn)物，凝膠電泳經(jīng)過酶切處理的不對稱 PCR擴增產(chǎn)物，切膠回收不對稱PCR擴增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即得到MLPA長探針；所述模板為與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的序列，所述不對稱PCR擴增產(chǎn)物的序列內(nèi)包括有多克隆位點，所述限制性內(nèi)切酶與多克隆位點對應(yīng)；所述引物對的一條引物從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段；所述引物對的另一條引物從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段。本發(fā)明中的MLPA是指多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)，MLPA長探針是指現(xiàn)有技術(shù)中由M13噬菌體衍生法制備的那條探針。所述模板是需要通過不對稱PCR插入或部分插入到長探針中的序列，因此，只要是與需要檢測的靶標(biāo)序列沒有同源關(guān)系，或同源關(guān)系比較低，或序列差異性很大，并且不會對長探針用于MLPA檢測造成不利影響的序列即可。所述檢測靶標(biāo)序列是指MLPA檢測對象的核苷酸序列，即需要檢測的制定樣品的核苷酸序列。所述回收是指從不對稱PCR中分離獲得單鏈DNA的過程。所述MLPA通用引物是指在MLPA長探針和短探針的5’端都具有的一段與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的序列，用于在MLPA雜交連接成功后對鏈接起來的探針進行PCR擴增。所述多克隆位點為具有至少一個限制性內(nèi)切酶酶切位點的DNA序列。所述限制性內(nèi)切酶處理，即采用與該多克隆位點所含有的酶切位點對應(yīng)的內(nèi)切酶進行。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述引物對中從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段的一條引物為不對稱PCR中的非限定引物，另一條引物為限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修飾。所述非限定引物是指不對稱PCR中用量相對較多的那條引物，限定引物是指用量相對較少的那條引物。不對稱PCR 產(chǎn)物中，所產(chǎn)生的單鏈DNA即是由非限定引物所引導(dǎo)的。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述模板為PUC18質(zhì)粒，所述限制性內(nèi)切酶包括 HindIII, EcoR I中的至少一種。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述非限定引物為不對稱PCR中的上游引物，所述限定引物為下游引物；所述上游引物位于PUC18質(zhì)粒多克隆位點的左側(cè)，含有％(1 ID No. 2所示序列；
Seq ID No. 2 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式，所述上游引物中與PUC18質(zhì)粒結(jié)合的區(qū)段均相同，且位于質(zhì)粒多克隆位點的左側(cè)；而下游引物則在PUC18質(zhì)粒多克隆位點的下游根據(jù)需要插入長探針的序列長度進行設(shè)計。本發(fā)明還公布了一種轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA長探針，所述MLPA長探針的5’端帶有磷酸化修飾，從5’端到3’端依次包括T2、UT、P2區(qū)段，所述T2為與檢測靶標(biāo)序列匹配的檢測區(qū)域，UT為與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的插入序列，P2為MLPA通用引物對的結(jié)合區(qū)域；所述P2 含有kq ID No. 11所示序列；所述T2含有Seq ID No. 3所示序列，所述UT含有Seq ID No. 12所示序列，或者所述T2含有kq ID No. 5所示序列，所述UT含有kq ID No. 13所示序列；Seq ID No. 3 5' -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-3’Seq ID No. 5 5' -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-3，Seq ID No. 11 :5’ -TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’Seq ID No. 12 5， -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-|Seq ID No.2|GTTGTAAAACGACGG-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTG-3’|Seq ID No.4的互4卜配對位點Seq ID No. 13 5， -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-|Seq ID No.2|GTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG AGCTCGAATTCGTAATCATGG-TCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3，|Seq ID No.6 的互補配對^^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，MLPA檢測中長探針的5’端是保證其檢測特異性的關(guān)鍵，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在上述公布的長探針序列的基礎(chǔ)上，在所述T2的3’端或者在UT或P2的兩端或中間替換、添加或刪減數(shù)個堿基，仍可以實現(xiàn)本發(fā)明所述長探針的基本功能。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，上述MLPA長探針的制備方法包括，采用引物對以 PUC18質(zhì)粒為模板進行不對稱PCR擴增，回收擴增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即MLPA長探針；所述引物對由非限定引物和限定引物組成，所述非限定引物的5’端帶有磷酸化修飾；所述非限定引物從5’端到3’端依次包括T2和UTl區(qū)段，T2為與檢測靶標(biāo)序列匹配的檢測區(qū)域，UTl為與不對稱PCR模板相匹配的區(qū)域；所述限定引物從5’端到3’端依次包括P2’和UT2區(qū)段；P2’為MLPA通用引物相匹配的區(qū)域，UT2為與不對稱PCR模板相匹配的區(qū)域；所述P2’含有kq ID No. 1所示序列，所述UTl含有kq ID No. 2所示序列；所述T2含有Seq ID No. 3所示序列，UT2含有Seq ID No. 4所示序列，或者T2含有Seq ID No. 5所示序列，UT2含有Seq ID No. 6所示序列；具體的，所述非限定引物含有^^ ID No. 7所示序列，所述限定引物含有％(1 IDNo. 8所示序列；或者所述非限定引物含有kq ID No. 9所示序列，所述限定引物含有％(1 ID No. 10所示序列；Seq ID No. 1 :5，-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，Seq ID No. 4 5' -CAGGCATGCAAGCTTGGCACTGG-3’Seq ID No. 6 5' -CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3’Seq ID No. 7 5， -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-|Seq ID No.3|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’|Seq ID No.2|Seq ID No. 8 5， -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-|Seq IDNo.llCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGG-3’|Seq ID No.4|Seq ID No. 9 5， -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-|Seq IDNo.5|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’|Seq ID No.2|Seq ID No. 10 5， -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-|Seq IDNo.llCAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3’。|Seq ID No.6本發(fā)明中，不對稱PCR擴增出MLPA長探針的方式是，由T2和UTl區(qū)段構(gòu)成的非限定引物，和由P2 ’和UT2區(qū)段構(gòu)成的限定引物，在不對稱PCR時，引物的UT1或UT2分別與不對稱PCR的模板，即PUC18質(zhì)粒匹配，然后進行擴增，隨著擴增的進行，擴增產(chǎn)物中會具有兩條引物各自5’端的T2和P2’。由于長探針5’端需要進行磷酸化修飾，因此，不對稱PCR擴增獲得單鏈DNA的非限定引物的5’端進行了磷酸化修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明上述公布的引物對序列，只要能夠基本實現(xiàn)以PUC18質(zhì)粒為模板進行不對稱PCR，在UTl 或UT2或P2’兩端或中間、T2中間、T2和UTl之間，或者P2’和UT2之間替換、添加或減少數(shù)個堿基同樣能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明所要求的基本功能。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA長探針具有％(1 ID No. 14或者kq ID No. 15所示序列；Seq ID No. 14 5， -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-
|Seq ID No.3|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG|Seq ID No. 12]TGCCAAGCTTGCATGCCTG-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’|Seq IDNo.ljSeq ID No. 11Seq ID No. 15 5， -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-|Seq IDNo.5|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG|Seq ID No. 13]TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCG|Seq ID No. 13]GGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGT|Seq ID No. 13]GTGAAATTG-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’。|Seq IDNo.l3l|Seq ID No. 11本發(fā)明的實施方式中，具體的，kq ID No. 14所示序列的MLPA長探針由kq ID No. 7所示序列的非限定引物以PUC18質(zhì)粒為模板進行不對稱PCR擴增獲得；Seq ID No. 15 所示序列的MLPA長探針由％(1 ID No. 9所示序列的非限定引物以PUC18質(zhì)粒為模板進行不對稱PCR擴增獲得。本發(fā)明還公布了一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA短探針，所述短探針從5’端到3’端依次包括Pl和Tl區(qū)段，所述Pl為MLPA通用引物對的結(jié)合區(qū)域，Tl為與檢測靶標(biāo)序列匹配的檢測區(qū)域；所述Pl含有ID No. 16所示序列，所述Tl含有kq ID No. 17或者Seq ID No. 18所示序列；Seq ID No. 16 :5’ -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’Seq ID No. 17 :5’ -CGAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATC-3’Seq ID No. 18 :5’ -GGATCAGATTGTCGTTTCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3，。本發(fā)明的實施方式中，所述的檢測轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA短探針具有kq ID No. 19 或Seq ID No. 20所示序列；Seq ID No. 19 5， -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|Seq ID No. 16]CGAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATC-3’|Seq ID No. 17]Seq ID No. 20 5， -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|Seq ID No. 16]
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GGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3，。|Seq ID No. 18]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，MLPA檢測中短探針的3’端是保證其檢測特異性的關(guān)鍵，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在上述公布的短探針序列的基礎(chǔ)上，在所述Tl的5’端或者在Pl的兩端或中間替換、添加或刪減數(shù)個堿基，仍然可以實現(xiàn)本發(fā)明所述短探針的基本功能。本發(fā)明還公布了一種轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測方法，所述檢測方法包括采用本發(fā)明提供的MLPA長探針和短探針以轉(zhuǎn)基因玉米品系的DNA序列為模板進行雜交。所述轉(zhuǎn)基因玉米品系的DNA序列，在本發(fā)明中的定義為該轉(zhuǎn)基因玉米品系所特有的，可用于鑒定該轉(zhuǎn)基因玉米品系的特殊序列；即在玉米或轉(zhuǎn)基因玉米中檢測到該DNA序列，就可以得出結(jié)論認(rèn)為所檢測的玉米或該轉(zhuǎn)基因玉米樣品為該品系的轉(zhuǎn)基因玉米或者含有該品系的轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明的實施方式中，kq ID No. 19所示序列的MLPA短探針與kq IDNo. 14所示序列的MLPA長探針配套使用，以轉(zhuǎn)基因玉米M0N810品系的DNA序列為模板進行雜交，用于其MLPA檢測；Seq ID No. 20所示序列的MLPA短探針與Seq ID No. 15所示序列的MLPA 長探針配套使用，以轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系的DNA序列為模板進行雜交，用于其MLPA檢測。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述檢測方法還包括采用一對通用弓I物對雜交后連接起來的長探針和短探針進行PCR擴增，所述通用引物的上游/下游引物分別含有％(1 ID No. ID No. 1所示序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明公布的通用引物序列的基礎(chǔ)上，進行數(shù)個堿基的替換、添加或刪減，都能夠?qū)崿F(xiàn)對MLPA雜交連接后的探針序列進行擴增的基本功能。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述檢測方法還包括采用轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因的MLPA 檢測探針進行檢測，所述檢測探針分別含有^^ ID似.21和％(1 ID No. 22所示序列，Seq ID No. 22所示序列探針的5’端帶有磷酸化修飾；Seq ID No. 21 5' -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|P1 區(qū)段CGCGTGCGTTTGTGTGGATTGT-3’|τι 區(qū)段Seq ID No. 22 5 -AGGACAAGGCTCCCTATGTAGGCAAGG-|T2 區(qū)段TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 。—2 區(qū)段本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明公布的短探針序列的基礎(chǔ)上，對其Pl區(qū)段或 Ρ2區(qū)段兩端或中間、Tl區(qū)段5’端或中間、Τ2區(qū)段3’端或中間進行數(shù)個堿基的替換、添加或刪減，仍然能夠?qū)崿F(xiàn)其作為短探針進行MLPA檢測的基本功能。
由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的MLPA長探針制備方法采用簡單的不對稱PCR擴增、酶切、凝膠電泳以及切膠回收等實驗室常規(guī)技術(shù)就可以獲得符合試驗要求的MLPA長探針。與現(xiàn)有的制備方法相比，操作簡單、成本低廉，在一般的實驗室均可進行；解決了由于長探針制備困難、成本高昂造成的MLPA檢測方法應(yīng)用受到限制的問題。為MLPA檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本發(fā)明巧妙的在不對稱PCR擴增產(chǎn)物序列內(nèi)設(shè)置有限制性內(nèi)切酶的酶切位點，對不對稱 PCR產(chǎn)物進行酶切處理后，通過簡單的凝膠電泳和切膠回收就可以將長探針分離出來，有效的簡化了長探針的回收純化，大大降低了生產(chǎn)成本，使整個操作過程更加簡便。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA長探針和MLPA短探針，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米的檢測，為轉(zhuǎn)基因玉米的高通量MLPA檢測奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因玉米MLPA檢測方法，為轉(zhuǎn)基因玉米的多靶標(biāo)檢測奠定了基礎(chǔ)，該檢測方法擴展性好、特異性強，為轉(zhuǎn)基因玉米檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法，特別適合用于檢驗檢疫等部門。


圖1是本發(fā)明實施例中MLPA長探針制備示意圖和制備的長探針示意圖，其中引物擴增的模板為PUC18質(zhì)粒，P為磷酸化修飾，T2為與檢測靶標(biāo)序列特異性配合的區(qū)域，UTl 和UT2為與PUC18質(zhì)粒結(jié)合的區(qū)域，P2’為通用引物結(jié)合區(qū)域，UT為UTl和UT2擴增區(qū)間內(nèi)的插入到長探針中的插入序列；圖2是本發(fā)明實施例中MLPA檢測示意圖，其中雜交連接的模板為轉(zhuǎn)基因玉米檢測靶標(biāo)序列，Pl為短探針的通用引物結(jié)合區(qū)域，Tl為短探針與靶標(biāo)序列特異性結(jié)合區(qū)域，T2 為長探針與靶標(biāo)序列特異性結(jié)合區(qū)域，UT為長探針的插入序列，P2為長探針中與通用引物結(jié)合區(qū)域；圖3是本發(fā)明實施例中制備的長探針回收純化后的電泳結(jié)果圖，其中M0N810、 NK603、M0N863、89034、88017、MIR604、GA21、BT11、59122、3272、CBH351、LY038,為對應(yīng)的檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系 M0N810、NK603、M0N863、M0N89034、M0N88017、MIR604、GA21、BTlU M0N59122, M0N3272, CBH351, LY038 的長探針的電泳結(jié)果；圖4是本發(fā)明實施例中轉(zhuǎn)基因玉米M0N810和M0N88017的MLPA檢測結(jié)果，其中 1為玉米內(nèi)源基因kin的檢測信號91bp，2為玉米品系M0N810的檢測信號170bp，3為玉米品系M0N88017的檢測信號25^p，4-12為分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為7^p、lOObp、139bp、150bp、 160bp、200bp、250bp、300bp、340bp。
具體實施例方式本發(fā)明的基本構(gòu)思就是，采用不對稱PCR將一段不影響靶標(biāo)序列的MLPA檢測的序列插入到長探針中，以滿足制備不同長度的長探針的需求。具體的本發(fā)明提供了 MLPA長探針制備方法，包括采用引物對以模板進行不對稱PCR擴增，所述模板為與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的序列，回收不對稱PCR擴增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即得到MLPA長探針；所述引物對的一條引物從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段； 所述引物對的另一條引物從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段。在本發(fā)明中，由于MLPA長探針在與檢測靶標(biāo)序列雜交時，位于靶標(biāo)序列的下游， 因此需要對長探針5’端進行磷酸化修飾；并且，在不對稱PCR中，最終擴增出的單鏈DNA產(chǎn)物是由非限定引物所引導(dǎo)的，所以，本發(fā)明的不對稱PCR中非限定引物為引物對中從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段的一條引物，并且其5’端進行了磷酸化修飾，而所述“另一條引物”則為限定引物；因此，制備出的長探針， 其5’端帶有磷酸化修飾，從5’端到3’端依次包括T2、UT、P2區(qū)段(圖1)，其中T2為與檢測靶標(biāo)序列匹配的檢測區(qū)域，UT為與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的插入序列，P2為MLPA通用引物對的結(jié)合區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，如果長探針在與檢測靶標(biāo)序列雜交時，位于靶標(biāo)序列的上游，則不需要對其5’端進行磷酸化修飾，那么，上述引物對中的非限定引物和限定引物的結(jié)構(gòu)就會發(fā)生相應(yīng)的變化。具體為，非限定引物為從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段的所述的“另一條引物”。那么，制備出的長探針從5’端到3’將依次包括PI、UT和Tl區(qū)段，其中UT為在所述模板上UTl區(qū)域和UT2 區(qū)域之間的插入到長探針的區(qū)域，Tl為與檢測靶標(biāo)相匹配的區(qū)域。同時，短探針的結(jié)構(gòu)也會相應(yīng)的變化，短探針在化學(xué)合成時需要在其5’端進行磷酸化修飾，并且其序列從5’端到 3’端依次包括T2和P2區(qū)段，T2為與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)域，P2為與MLPA通用引物相匹配的區(qū)域。本發(fā)明中不對稱PCR的模板是一段與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的序列。該模板的選擇， 首要考慮的因素則是，在將該模板的序列插入或者部分插入長探針后，該插入序列不會與檢測靶標(biāo)序列產(chǎn)生影響MLPA檢測的錯配；其次還必須考慮的是，該插入序列不會對長探針造成不利于其與檢測靶標(biāo)序列雜交的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。綜合各種因素，本發(fā)明優(yōu)選的采用PUC18質(zhì)粒為不對稱PCR的模板。另外，在不對稱PCR擴增中，除了擴增出預(yù)定的需要的單鏈長探針DNA以外，還會擴增出雙鏈的DNA片段。為了便于單鏈DNA的回收，本發(fā)明的一個設(shè)計構(gòu)思是，在不對稱PCR擴增產(chǎn)物中設(shè)計了至少一個限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在擴增完成后，對擴增產(chǎn)物進行酶切處理，以切除其中的雙鏈DNA，然后通過簡單的凝膠電泳和凝膠回收就可以回收獲得其中的單鏈DNA，即MLPA單鏈長探針。PUC18質(zhì)粒中存在大量的單一的限制性內(nèi)切酶酶切位點，將其選為模板，同樣也是在上述發(fā)明構(gòu)思下的一個最優(yōu)選擇。下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1轉(zhuǎn)基因玉米MLPA長探針的制備1.材料和設(shè)備(1)不對稱PCR擴增反應(yīng)試劑10X高保真PCR緩沖液、2. 5mmol/L的dNTP混合液、50mmol/L的MgS04溶液、10 μ mol/L的上游引物、1 μ mol/L的下游引物、5U/yL的 PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶、Ing/ μ L的PUC18質(zhì)粒溶液、滅菌蒸餾水；(2)電泳檢測試劑Takara DL 500 分子量標(biāo)記、6XLoading Buffer、10mg/mL 的溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、IXTAE緩沖液；(3) PCR 產(chǎn)物純化試劑盒QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN)；
(4)凝膠回收試劑盒:QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)；(5)材料轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810和M0N88017 ；(6)主要儀器設(shè)備=PCR儀(Biometra T)、電泳儀(BioRad 300Χ 型)、紫外交聯(lián)儀(Spectronics，XJ-1000)、凝膠圖像分析儀(CEE，GAS7001X)、微量紫外光分光光度計 ND-3300 (NANOdrop)、ABI3100 測序儀。2.不對稱PCR引物設(shè)計和合成根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系的特異性序列和PUC18質(zhì)粒設(shè)計制備長探針的上游引物，使得上游引物的5’端為帶有磷酸化修飾的與轉(zhuǎn)基因玉米品系特異性序列互補配對的序列， 3’端含有kq ID No. 1所示的與PUC18質(zhì)?；パa的序列；并根據(jù)MLPA檢測的通用引物和 PUC18質(zhì)粒設(shè)計制備長探針的下游引物，使得下游引物的5’端含有MLPA通用引物結(jié)合的位點，3’端含有與PUC18質(zhì)粒下游序列互補配合的序列。根據(jù)上述原理，本發(fā)明分別設(shè)計了用于不對稱PCR擴增檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810和M0N88017的MLPA長探針的引物對。其中檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810的長探針1的擴增引物對1包括上游引物(I^rimerSlO-l) 和下游引物(Primer810-2)；測轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N88017的長探針2的擴增引物對2包括上游引物(Primer88017-1)和下游引物(Primer88017-2)(表1)。上述引物均在寶生生物工程有限公司合成。表1不對稱PCR所用弓I物
_ 名稱序列(5，—3，)Seq ID No.
5，-po4-ctttgccattgcccagctatctgtcacttta
ttgtcgccagggttttcccagtcacgac-3 ‘ 7 5，-gcgccagcaagatccaatctagacaggcatgc aagcttggcactgg-3 ‘ 8 5，-po4-agtcgggtttggatggtcaactccggcat a ctgcgccagggttttcccagtcacgac-3 ‘ 9 5 '-gcgccagcaagatccaatctagacaatttcaca caggaaacagctatga-3，_103.不對稱PCR擴增反應(yīng)(I)PCR反應(yīng)液總體積50 μ L，其中包括10Χ高保真PCR緩沖液5 μ L、2. 5mmol/L 的 dNTP 混合液 4 μ L、50mmol/L 的 MgS045 μ LUOy mol/L 的上游引物 25 μ LU μ mol/L 的下游引物5 μ L、5U/ μ L的PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶0. 4 μ L、lng/ μ L的PUC18質(zhì)粒 1 μ L，然后加滅菌蒸餾水至反應(yīng)液總體積50 μ L0O) PCR反應(yīng)條件為，先94°C預(yù)變性lmin，然后進入35個循環(huán)94°C變性20sec、 65°C退火30sec、72°C延伸20sec，循環(huán)完成后最后72°C延伸lOmin。(3) PCR產(chǎn)物的純化PCR產(chǎn)物的純化采用QIAGEN公司的QIAquick PCRPurification kit，參考試劑盒說明書，純化步驟如下A)在PCR產(chǎn)物中加入PCR產(chǎn)物5倍體積的Buffer PBI，混合均勻；B)將 QIAquick column 放入一個 2mL 的收集管；C)將步驟A)的混合樣品加入到QIAquick column中，離心30 60sec,棄濾液；D)在經(jīng)過步驟 C)的 QIAquick column 中加入 0. 75mL Buffer PE，離心 30_60sec， 棄濾液，離心Imin ；
Primer810-1 Pnmer810"2 Primer88017-1
Primer88017-2
E)將QIAquick column轉(zhuǎn)移到一個新的1. 5mL的離心管上；F)加入50 μ L Buffer AE洗脫，室溫下放置lmin，離心lmin，收集濾液，即純化的 PCR產(chǎn)物。4. MLPA長探針的獲得(1)酶切反應(yīng)采用HindIII限制性內(nèi)切酶消化經(jīng)過純化的不對稱PCR擴增產(chǎn)物，酶切反應(yīng)液的總體積為50μ L，其中包括上述純化的不對稱PCR擴增產(chǎn)物44. 75μ LUOXHindIII緩沖液5 μ L、9U/ μ L的HindIII酶0. 25 μ L。將上述酶切反應(yīng)液混勻后，37°C恒溫處理lh。(2)電泳及切膠回收采用3-4%的瓊脂糖凝膠進行瓊脂糖凝膠電泳約20 60min后，割取預(yù)期片段大小的DNA帶，用QIAGEN公司提供的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒^jIAquick Gel Extraction kit)回收DNA，參考試劑盒說明書，具體回收步驟如下A)切取含DNA片段的膠帶，按1 6加入溶液QG (Img凝膠加入300 μ L溶液)；B) 50°C水浴 10_20min，渦旋 2-3 次；C)力口 10 μ L 3mol/L 的 NaAC，混勻；D)按膠帶(mg)異戊醇(mL)比例1 1的量加入異戊醇；E)將步驟 D)的溶液轉(zhuǎn)入 QIAquick spin column 中，13000rpm 離心 60sec ；F)棄濾液，再力口 500 μ L 溶液 QG 至Ij QIAquick spin column 中，13000rpm 離心 60sec ；G)棄濾液，力口 750μ L 溶液 PE 至 QIAquick spin column 中，13000rpm 離心 30_60sec ；H)棄濾液，再 13000rpm 離心 60sec ；I)將QIAquick spin column置于一個新的1. 5mL的離心管中，加入50 μ L溶液 EB或水，室溫靜置lmin，8000rpm離心lmin，即制備的MLPA長探針。實施例2MLPA長探針檢測1. MLPA長探針凝膠電泳檢測采用上述相同的方法，本發(fā)明還制備了檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603、M0N863、 M0N89034、MIR604、GA21、BT11、M0N59122、M0N3272、CBH351、LY038 的長探針，將所有制備的 MLPA長探針進行瓊脂糖凝膠電泳，定性檢測各探針的長度是否與預(yù)期的相符合。瓊脂糖凝膠電泳具體為，采用3%的凝膠，在電泳儀上電泳20-60min。結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的MLPA 單鏈長探針的長度全部合乎預(yù)期，探針的長度呈約20bp的梯度遞增，見圖3。2. MLPA長探針濃度測定為了便于確定制備的MLPA長探針在MLPA檢測中的使用量，本發(fā)明采用微量紫外光分光光度計ND-3300對制備的MLPA長探針的濃度進行檢測。其檢測原理是， Quant-iTTM ds BR DNA Assay kit中的熒光染料能與DNA結(jié)合，并能在523 士 20nm的藍(lán)光下被ND-3300檢測到光吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對，即可得出DNA樣品的濃度，檢測的范圍是10-5000ng/y L。根據(jù)測得的MLPA長探針的質(zhì)量濃度，可以推導(dǎo)出MLPA長探針的摩爾濃度，計算公式為，摩爾濃度=質(zhì)量濃度/分子質(zhì)量，其中分子質(zhì)量=堿基個數(shù)X324. 5g/ mol。本發(fā)明制備的MLPA長探針的濃度見表2。
實施例3轉(zhuǎn)基因玉米MLPA檢測選取上述制備的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810和M0N88017的MLPA長探針，Probe810-2和ftx)be88017-2，同時化學(xué)合成內(nèi)源基因kin的MLPA檢測探針 Zein-U Zein-2,并合成檢測M0N810的短探針I(yè)^robeSlO-l、檢測M0N88017的短探針 Probe88017-1 (表3)，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測。MLPA反應(yīng)產(chǎn)物采用ABI3100測序儀進行片段分析，結(jié)果顯示，M0N810、M0N88017以及內(nèi)源基因kin都有擴增信號。其中M0N810 有170bp的擴增信號、M0N88017有252bp的擴增信號、內(nèi)源基因kin有91bp的擴增信號 (圖4)，與理論長度相符合，證明制備的MLPA長探針達(dá)到設(shè)計要求，可用于MLPA檢測。表3MLPA檢測探針和通用弓丨物
_ 名稱序列(5，—3，)Seq ID No.
5，-P04-CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTAT TGTCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA
14
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGTCTAG ATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGAAGGACGAAGG ACTCTAACGTTTAACATC-3 ‘19
5，-PO4-AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATA CTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAA15
TTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGATCAGATTGTCG
20
TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3 ‘ 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCGTGCGTTTGTG TGGATTGT-3'
5，-PO4-AGGACAAGGCTCCCTATGTAGGCAAGGTCT AGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 22 5 '-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3 ‘ 16 5，-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，_1MLPA的具體檢測步驟如下(1)模板與探針復(fù)性將檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N810品系的長探針1、短探針1、檢測轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017 品系的長探針2、短探針2以及檢測內(nèi)源基因的kin-Ι和kin-2混合作為混合探針，各探針的最終濃度為lOfmol/μ L。將轉(zhuǎn)基因玉米M0N810品系和M0N88017品系的DNA進行等量混合作為模板DNA，并將模板DNA預(yù)先進行變性處理。反應(yīng)液的總體積為4 μ L，其中包括 50ng/ μ L的預(yù)變性的模板DNA 2 μ L、各探針濃度IOfmol/ μ L的混合探針0. 75 μ L、MLPA 緩沖液0.75 μ L、滅菌蒸餾水0.5 μ L。反應(yīng)液混勻后，95°C變性lmin，60°C恒溫過夜(約
Probe810-2
Probe810-1
Probe88017-2
Probe88017-1 Zein-I
Zein-2
上游通用引物下游通用引物
1410-12h)。(2)連接反應(yīng)在模板與探針復(fù)性后，采用連接酶將短探針和長探針連接起來。反應(yīng)液總體積為 20 μ L，其中包括，1. 5 μ L 的 Ligase-65bufferA> 1. 5 μ L 的 Ligase_65bufTerB、0· 5 μ L 的 Ligase-65連接酶、12. 5μ L的滅菌蒸餾水，最后加入步驟(1)模板與探針復(fù)性的產(chǎn)物4 μ L。 混勻反應(yīng)液，在下恒溫反應(yīng)15min，然后98°C處理5min滅活連接酶。(3) PCR擴增反應(yīng)將上述步驟O)的連接反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR擴增。反應(yīng)液總體積為25 μ L，其中包括=SALSA PCR buffer 2 μ L，步驟(2)連接反應(yīng)的產(chǎn)物5 μ L，滅菌蒸餾水13 μ L，IOpmol/ μ L的MLPA通用引物1 μ L，DNA聚合酶稀釋緩沖液1 μ L，5U/ μ L的DNA聚合酶0. 25 μ L，滅菌蒸餾水2. 75 μ L0PCR反應(yīng)條件為，直接進入35次循環(huán)95°C變性30s、60 V復(fù)性30s、72°C延伸60s， 循環(huán)完成后72°C延伸20min。(4) PCR 產(chǎn)物采用ABI 3100測序儀的片段分析功能對步驟(3)中的PCR產(chǎn)物進行分析。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種MLPA長探針的制備方法，所述制備方法包括，采用引物對以模板進行不對稱PCR擴增，然后用限制性內(nèi)切酶處理不對稱PCR擴增產(chǎn)物，凝膠電泳經(jīng)過酶切處理的不對稱PCR擴增產(chǎn)物，切膠回收不對稱PCR擴增產(chǎn)物中的單鏈 DNA，即得到MLPA長探針；所述模板為與檢測靶標(biāo)序列無關(guān)的序列，所述不對稱PCR擴增產(chǎn)物的序列內(nèi)包括有多克隆位點，所述限制性內(nèi)切酶與多克隆位點對應(yīng)；所述引物對的一條引物從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段；所述引物對的另一條引物從5’端到3’端依次包括與MLPA通用引物相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述引物對中從5’端到3’端依次包括與檢測靶標(biāo)序列相匹配的區(qū)段和與所述模板相匹配的區(qū)段的一條引物為不對稱PCR中的非限定引物，另一條引物為限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述模板為PUC18質(zhì)粒，所述限制性內(nèi)切酶包括HindIII、EcoR I中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述非限定引物為不對稱PCR中的上游引物，所述限定引物為下游引物；所述上游引物位于PUC18質(zhì)粒多克隆位點的左側(cè)，含有kq ID No. 2所示序列。
5.一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA長探針，其特征在于所述長探針的5’端帶有磷酸化修飾，從5’端到3’端依次包括T2、UT、P2區(qū)段，所述P2含有kqlD No. 11所示序列；所述T2含有kq ID No. 3所示序列，所述UT含有kq ID No. 12所示序列，或者所述T2含有kq ID No. 5所示序列，所述UT含有kq ID No. 13所示序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MLPA長探針，其特征在于所述MLPA長探針的制備方法包括，采用引物對以PUC18質(zhì)粒為模板進行不對稱PCR擴增，回收擴增產(chǎn)物中的單鏈DNA，即 MLPA長探針；所述引物對由非限定引物和限定引物組成，所述非限定引物的5’端帶有磷酸化修飾；所述非限定引物含有kq ID No. 7所示序列，所述限定引物含有％(1 ID No. 8所示序列；或者所述非限定引物含有kq ID No. 9所示序列，所述限定引物含有％(1 IDNo. 10所示序列。
7.一種檢測轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA短探針，其特征在于所述短探針從5’端到3’端依次包括Pl和Tl區(qū)段；所述Pl含有kq ID No. 16所示序列，所述Tl含有kq ID No. 17或者 Seq ID No. 18所示序列。
8.一種轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括采用權(quán)利要求5 或6的MLPA長探針與權(quán)利要求7的短探針以轉(zhuǎn)基因玉米品系的DNA序列為模板進行雜交。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于還包括采用一對通用引物對雜交后連接起來的長探針和短探針進行PCR擴增，所述通用引物的上游/下游引物分別含有Seq ID No. 16 和 kq ID No. 1 所示序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測方法，其特征在于還包括采用對轉(zhuǎn)基因玉米內(nèi)源基因進行MLPA檢測的兩條探針，所述兩條探針分別含有kq IDNo. 21和kq ID No. 22所示序列，Seq ID No. 22所示序列探針的5’端帶有磷酸化修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸分子檢測領(lǐng)域，具體公開了一種MLPA長探針的制備方法、轉(zhuǎn)基因玉米MLPA長探針和短探針以及轉(zhuǎn)基因玉米的MLPA檢測方法。本發(fā)明的MLPA長探針制備方法采用不對稱PCR擴增、酶切、凝膠電泳及切膠回收等實驗室常規(guī)技術(shù)就可以進行。與現(xiàn)有的制備方法相比，操作簡單、成本低廉，在一般的實驗室均可操作；解決了由于長探針制備困難、成本高昂造成的MLPA檢測方法應(yīng)用受限的問題。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米MLPA長探針和短探針可以用于轉(zhuǎn)基因玉米的檢測，為轉(zhuǎn)基因玉米的高通量MLPA檢測提供了基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上進行的轉(zhuǎn)基因玉米MLPA檢測方法，其擴展性能好、特異性強，為轉(zhuǎn)基因玉米檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法，特別適合用于檢驗檢疫等部門。
文檔編號C12N15/10GK102399873SQ20111033107
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者凌杏園, 向才玉, 康林, 潘廣, 章桂明, 陳枝楠, 陳菲 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心