專利名稱：一種快速分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組 織工程領(lǐng)域，涉及一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒、該試劑盒的應(yīng)用以及一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞，具有來源自體，取材廣泛、易于采集、保存和運(yùn)輸、無異體排斥、避免倫理爭(zhēng)議等諸多優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志(⑶44、⑶105)、整合素受體(⑶29、⑶49b、⑶49c、⑶51)，不表達(dá)造血系標(biāo)志(⑶34、⑶45)和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志⑶31。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等。目前人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程皮膚以及細(xì)胞治療等臨床應(yīng)用研究中已逐漸深入，并已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前，對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，存在純度低、原代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。各種類型的成纖維成體干細(xì)胞擴(kuò)增一般在2 3天開始進(jìn)入指數(shù)式生長(zhǎng)，相差不大，而原代細(xì)胞由于組織來源不同，出現(xiàn)細(xì)胞克隆時(shí)間差異較大，所以，原代細(xì)胞傳代時(shí)間是分離得到目的細(xì)胞的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離的純度、數(shù)量和原代培養(yǎng)時(shí)間問題，本發(fā)明提供了一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。此試劑盒能有效純化哺乳動(dòng)物脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，加快原代細(xì)胞擴(kuò)增速度。獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以利于進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括洗滌液，細(xì)胞培養(yǎng)液A，細(xì)胞培養(yǎng)液B和細(xì)胞消化液，其中:所述細(xì)胞洗滌液為生理鹽水；所述細(xì)胞培養(yǎng)液A 為含 100ng/ml LIF(Sigma，L5158)與 100ng/ml bFGF (Sigma,F5392)細(xì)胞因子的 Knockout-DMEM 液體培養(yǎng)基(Gibco，12660012)；所述細(xì)胞培養(yǎng)液B為胎牛血清；所述細(xì)胞消化液為膠原酶I型酶液(Sigma，C-0130)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞源自哺乳動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述洗滌液、培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B以及細(xì)胞消化液是無菌的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述洗滌液、培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B以及細(xì)胞消化液為獨(dú)立包裝。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液是將細(xì)胞培養(yǎng)液A與細(xì)胞培養(yǎng)液B按照4:I體積比配制的細(xì)胞培養(yǎng)混合液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的細(xì)胞洗滌液含0.9%的氯化鈉的，所述細(xì)胞消化液可為質(zhì)量/體積百分比濃度為0.2 %。本發(fā)明的另一目的 在于提供了一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法用試劑盒內(nèi)細(xì)胞消化液處理脂肪組織，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液A和B的原代培養(yǎng)，最終獲得分離的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明的方法采用膠原酶I型酶有效處理脂肪蛋白膠質(zhì)，利用細(xì)胞因子(LIF、bFGF)組合對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的促進(jìn)作用，從而確保了原代細(xì)胞分離數(shù)量和減少原代培養(yǎng)時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可包括:1、脂肪預(yù)處理:無菌收集脂肪，浸沒于含1%雙抗(青鏈霉素)的細(xì)胞培養(yǎng)液(A和B)中，玻璃容器密封運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；生物安全柜中剪取約Ig脂肪，用生理鹽水清洗脂肪中的血污。用剪刀剪碎脂肪組織成糜狀。2、分離細(xì)胞:將剩余脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入20ml細(xì)胞消化液，混勻37°C過夜消化約6小時(shí)。離心，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種原代細(xì)胞于0.2%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)候，可見貼壁成纖維狀細(xì)胞，呈漩渦式生長(zhǎng)(見圖1)。


圖1.分離得到的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但是并不以此來限制本發(fā)明。實(shí)施例1、用于分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的配制1、洗滌液:取9g NaCl以去離子水定容至1000ml，高壓滅菌制得0.9%的氯化鈉洗滌液，放置在4V冰箱內(nèi)備用。2、細(xì)胞培養(yǎng)液:含 100ng/ml LIF 與 100ng/ml bFGF 細(xì)胞因子的 Knockout-DMEM 液體培養(yǎng)基和無菌胎牛血清培養(yǎng)液按照4:I的體積比混合配制細(xì)胞培養(yǎng)中所用細(xì)胞培養(yǎng)混合液。3、細(xì)胞消化液:配制質(zhì)量/體積百分比濃度為0.2%的膠原酶I型酶溶液。實(shí)施例2、用于分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的分裝試劑盒的規(guī)格為I次/盒，每盒中各組分的量:洗滌液I瓶(IOOml/瓶)，細(xì)胞培養(yǎng)液Al瓶(80ml/瓶)，細(xì)胞培養(yǎng)液BI瓶(20ml/瓶)，細(xì)胞消化液I瓶(IOOml/瓶)。接上述劑量對(duì)試劑盒中各組分進(jìn)行獨(dú)立包裝，得到分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。
實(shí)施例3、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增培養(yǎng)無菌收 集脂肪，浸沒于含1%雙抗(青鏈霉素)的細(xì)胞培養(yǎng)液(A和B)中，玻璃容器密封運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；生物安全柜中剪取約Ig的脂肪，用生理鹽水清洗脂肪中血管中的血污。將脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入20ml細(xì)胞消化液，混勻37°C過夜消化約6小時(shí)。離心，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種原代細(xì)胞于0.2%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，置37°C>5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，包括: 洗滌液，其為含0.9%的氯化鈉的生理鹽水； 培養(yǎng)液A，其為含100ng/ml LIF與100ng/ml bFGF細(xì)胞因子的Knockout-DMEM液體培養(yǎng)基; 培養(yǎng)液B，其為胎牛血清； 細(xì)胞消化液，其為膠原酶I型酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述洗滌液、培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B以及細(xì)胞消化液是無菌的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述洗滌液、培養(yǎng)液A、培養(yǎng)液B以及細(xì)胞消化液是獨(dú)立包裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞源自哺乳動(dòng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述培養(yǎng)液B的技術(shù)指標(biāo)如下:pH(7.0-7.5)、總蛋白含量(3-3.5/100ml)、血紅蛋白(彡 20mg/100ml)。
6.權(quán)利要求1所述的試劑盒 ，其特征在于:所述培養(yǎng)液A與培養(yǎng)液B以4:1的體積比來提供。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述生理鹽水為含0.9%的氯化鈉溶液，所述細(xì)胞消化液為質(zhì)量/體積百分比濃度0.2%的膠原酶I型酶液。
8.一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的力法，包括: (1)利用洗滌液沖洗脂肪中中的血污，用解剖刀在脂肪一端(離頂端Icm處)圓周劃開外表皮，用夾子固定脂肪此端，用兩把鑷子用力撕下脂肪外表皮，再分離兩根動(dòng)脈，最后將靜脈內(nèi)皮剔除； (2)將剩余脂肪組織剪碎成肉糜狀，轉(zhuǎn)移到離心管中，隨后用細(xì)胞消化液消化(37°C消化6小時(shí)); (3)吸出離心管中消化后的液體。除去其他組織及雜質(zhì)。
(4)吸出的液體經(jīng)離心機(jī)離心(2500rpm，5分鐘)。離心后，倒出培養(yǎng)基，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
(5)接種的原代細(xì)胞于0.2%明膠包被的培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
其中洗滌液為生理鹽水； 細(xì)胞培養(yǎng)混合液為按照9:1體積比來配制的培養(yǎng)液A與培養(yǎng)液B，其中培養(yǎng)液A為Knockout-DMEM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)液B為胎牛血清； 以及細(xì)胞消化液膠原酶I型酶液。
(6)每天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況。細(xì)胞多數(shù)貼壁后全量換液，除去未貼壁細(xì)胞和雜質(zhì)，以后每3 4天半量換細(xì)胞培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟(5)中，采用每106個(gè)細(xì)胞接種到25m2培養(yǎng)瓶中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在步驟￠)中，24小時(shí)細(xì)胞多數(shù)貼壁后全量換液，除去未貼壁細(xì)胞和雜質(zhì)，。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒及方法。該試劑盒包括洗滌液，細(xì)胞培養(yǎng)液A，細(xì)胞培養(yǎng)液B，細(xì)胞消化液，其中洗滌液為生理鹽水(含0.9％的氯化鈉)；細(xì)胞培養(yǎng)液A為含100ng/ml LIF與100ng/ml bFGF細(xì)胞因子的Knockout-DMEM液體培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)液B為胎牛血清；細(xì)胞消化液為質(zhì)量/體積百分比濃度為0.2％的膠原酶I型酶液。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比，采用此試劑盒得到的細(xì)胞純度高，增殖更快，一般7天即可完成原代細(xì)胞培養(yǎng)。將原代細(xì)胞傳代，利用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，一般2-3天細(xì)胞密度即可達(dá)到90％，為利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了豐富的來源。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103087982SQ201110330948
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者田杰 申請(qǐng)人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司