專利名稱：人ppp2r3a基因突變及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人PPP2R3A的基因突變和分析人PPP2R3A基因的突變的方法，以及此突變在擴(kuò)張型心肌病中輔助診斷的用途。
背景技術(shù)：
擴(kuò)張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是一種以心室腔(左心室和/ 或右心室)擴(kuò)大、心肌收縮功能受損為主要特征的原因不明的心肌疾病，可通過超聲心動圖明確診斷。其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性心衰，左室收縮功能下降，室性及室上性心律失常， 傳導(dǎo)系統(tǒng)異常，血栓栓塞，猝死以及心衰相關(guān)的死亡。分別為心衰的第3大病因及心臟移植最常見原因[Maron BJ, Towbin JA, Thiene G，et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies :an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology,Heart Failure and Transplantation Committee ；Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups ；and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation，2006，113(14) :1807-1816.]。 目前認(rèn)為病毒感染、免疫功能異常和遺傳因素(基因突變)是導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的3個主要致病原因。如果DCM患者家族內(nèi)有2個或2個以上的成員患病，則為家族性擴(kuò)張型心肌病(FDCM)。研究表明約-48% 的 DCM 具有家族遺傳性[Menon SC, Olson TM,Michaels W.Genetics of familial dilated cardiomyopathy. Prog Pediatr Cardiol,2008, 25(3) :57-67.]。迄今為止，共定位、克隆了 40個與FDCM相關(guān)的疾病基因或位點(diǎn)。其中伴心臟傳導(dǎo)功能障礙的DCM與以下5個基因或位點(diǎn)相關(guān)LMNA [Fatkin D，MacRae C， Sasaki Τ, et al. Missense mutations in the rod domain of the lamin A/C gene as causes of dilated cardiomyopathy and conduction-system disease. N Engl J Med,1999,341 (23) :1715-1724. ]、SCN5A[McNair WP, Ku L, Taylor MR, et al. SCN5A mutation associated with dilated cardiomyopathy, conduction disorder, and arrhythmia. Circulation,2004,110 (15) :2163-2167. ]>6q22-q23[Messina DN, Speer MC, Pericak-Vance MA, et al. Linkage of familial dilated cardiomyopathy with conduction defect and muscular dystrophy to chromosome 6q23. Am J Hum Genet, 1997,61(4) :909-917. ]、2ql4_q22[Jung M, Poepping I，Perrot A, et al. Investigation of a family with autosomal dominant dilated cardiomyopathy defines a novel locus on chromosome 2ql4-q22. Am J Hum Genet, 1999,65(4) : 1068—1077·]禾口 3q26 [徐偉，張寶榮，胡正茂，等.應(yīng)用遺傳連鎖分析法對伴傳導(dǎo)功能障礙的擴(kuò)張型心肌病家系致病基因的定位.中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2005，30 (5) :510-514.]。關(guān)于DCM確切的致病機(jī)制， 目前仍不清楚。傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)方法采用連鎖分析合并候選基因篩查技術(shù)研究DCM取得了一些成果，但也存在諸多缺陷與不足。如對家系樣本的數(shù)量和質(zhì)量要求高、定位區(qū)域較寬、難以最終鑒定出致病基因以及耗時長等。外顯子組測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。2010年《Science》 雜志公布的十大科學(xué)突破中就包含外顯子組測序[The Runners-Up[J], Science, 2010, 333(17) :1605-1607.]。本發(fā)明以伴房室傳導(dǎo)阻滯的DCM家系為研究對象，結(jié)合連鎖分析、外顯子組測
序技術(shù)，鑒定了一個新的致病基因-PPP2R3A(protein phosphatase 2, regulatory
subunit B"，alpha)，其編碼蛋白為蛋白磷酸酶2的一種調(diào)節(jié)亞基。蛋白磷酸酶2是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其功能極為廣泛，涉及細(xì)胞的發(fā)育與運(yùn)動性、細(xì)胞增殖與死亡、細(xì)胞骨架動力學(xué)、細(xì)胞周期調(diào)控、多種信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)等方面。此外，它也被認(rèn)為可能是一禾中重要的抑癌基因[Shi Y. Serine/threonine phosphatases :mechanism through structure. Cell, 2009,139 (3) :468-484.]。蛋白磷酸酶2的全酶為異源三聚體結(jié)構(gòu)，包含結(jié)構(gòu)亞基、催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。PPP2R3A基因的突變(R9Q，匪181897. 2)可能影響其蛋白功能，使磷酸酶活性異常，心肌蛋白去磷酸化出現(xiàn)異常，導(dǎo)致了擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生。在本申請之前，還沒有人PPP2R3A基因突變導(dǎo)致疾病特別是擴(kuò)張型心肌病的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種檢測PPP2R3A基因突變的方法；本發(fā)明的第二個目的在于提供用于檢測PPP2R3A基因突變的試劑盒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)PPP2R3A基因1號外顯子第沈位核苷酸G — A突變與擴(kuò)心病相關(guān)聯(lián)，在此位點(diǎn)存在突變。為此，本發(fā)明第一方面，提供一種檢測人PPP2R3A基因的突變的方法，其包括以下步驟(a)確定在樣品中人PPP2R3A基因編碼的第9位氨基酸，或SEQ ID NO=I的第360 至362位核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在氨基酸R — Q突變。本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的核酸，它具有SEQ ID NO 1所示的序列，且第 361位為A，或者包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特異性片段。進(jìn)而本發(fā)明提供一種分子標(biāo)記，其為上述SEQ ID NO. 1所述的核酸序列，或者所述的特異性片段，通過該分子標(biāo)記，能夠判斷是否存在可能的擴(kuò)心病。在本發(fā)明的第三方面，提供用于擴(kuò)增包括上述多態(tài)位點(diǎn)的特異性引物。例如，該引物其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人PPP2R3A基因的SEQ ID NO=I所示序列中第361位核苷酸G — A突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A 突變的擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的第四方面，提供一種可與上述SEQ ID NO. 1特異性雜交并檢測所述突變位點(diǎn)的寡核苷酸探針。例如，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人PPP2R3A基因的SEQ ID N0:1所示序列中第361位核苷酸G —A突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A堿基突變。在本發(fā)明的第五方面，提供了擴(kuò)張型心肌病分子診斷的試劑盒。該試劑盒包括用于人PPP2R3A基因的第1外顯子第沈位核苷酸檢測的試劑，或用于該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序
4列相應(yīng)位點(diǎn)檢測的試劑，或用于該基因表達(dá)產(chǎn)物相應(yīng)位點(diǎn)檢測的試劑。其可以是1)檢測基因組的PCR試劑盒；或2~)檢測mRNA的熒光定量PCR檢測試劑盒，或Northern檢測試劑盒。例如，可以包括上述的引物和/或本發(fā)明上述的寡核苷酸探針；或幻檢測該突變蛋白的免疫檢測試劑盒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)人PPP2R3A基因的SEQ ID NO :1所示序列中第361位核苷酸G —A 突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A突變，從而改變了 PP2A酶的磷酸酶活性，與遺傳性擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病相關(guān)。通過該位點(diǎn)的鑒定可以用于擴(kuò)心病的輔助診斷，用于發(fā)現(xiàn)擴(kuò)心病的潛在攜帶者，為該病的預(yù)防提供依據(jù)。


圖1顯示的是家系中對照及人群中對照的測序圖，為野生型(G/G)；圖2顯示的是家系中患者或無癥狀攜帶者的測序圖，為突變型(G/A)。具體實(shí)施的方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人PPP2R3A基因的突變(c. 26G > A，R9Q，NM_181897. 2)在一個遺傳性擴(kuò)張型心肌病家系中與疾病性狀共分離，這種擴(kuò)張型心肌病發(fā)病年齡較早，且伴有房室傳導(dǎo)阻滯，顯示這個突變可能影響到基因的功能，使心肌蛋白去磷酸化出現(xiàn)異常，導(dǎo)致了擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生。已經(jīng)有PPM基因心肌組織特異性敲除和PP2A全酶催化基團(tuán)PP2Ac α全身性敲除的小鼠模型，均導(dǎo)致了擴(kuò)張型心肌病的臨床表型。而PPP2R3A基因作為ΡΡ2Α酶的調(diào)節(jié)因子，它的功能缺失，可能導(dǎo)致ΡΡ2Α酶的活性下降，進(jìn)而導(dǎo)致例如Ca2+蛋白去磷酸化功能障礙，使心肌細(xì)胞的去極化障礙，凋亡增加，出現(xiàn)心肌細(xì)胞的重構(gòu)，最終表現(xiàn)出擴(kuò)張型心肌病的臨床癥狀。因此可以通過檢測PPP2R3A基因的mRNA、cDNA或基因組DNA中該位點(diǎn)的突變，或者通過檢測患者PP2A磷酸酶的酶活性，從而確定檢測對象的擴(kuò)張型心肌病易感性。人PPP2R3A基因的cDNA序列為SEQ ID NO :1，其開放閱讀框?yàn)榈?36-1925位，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。人PPP2R3A的基因組序列可以從GenBank中獲得。本技術(shù)領(lǐng)域的人員均知道，有許多的分析技術(shù)可以用于檢測人PPP2R3A基因的突變。這些技術(shù)包括(但不局限于)DNA測序、雜交測序、酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、高分辨率熔解曲線(HRM)、 變性的高效液相色譜(DHPLC)和分子信標(biāo)等。另一方面，本發(fā)明的檢測方法被用于評估個體患擴(kuò)張型心肌病的易感性。本發(fā)明的檢測樣品可以是從體液、組織甚至頭發(fā)等樣品中抽提的基因組DNA或 mRNA。用于本發(fā)明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據(jù)PPP2R3A基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1的序列)或基因組序列進(jìn)行設(shè)計，并用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成即可。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)進(jìn)行或者按照試劑盒建議的條件完成。實(shí)施例1基因組的抽提和測序用常規(guī)的酚氯仿法從人的血液中提取基因組DNA，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。
引物序列為正義引物AGGTATTGGGAGCCACAGACT反義引物ACTTCAGCCGCTTCTTAAACC擴(kuò)增體系(總體積50 μ L)
權(quán)利要求
1.一種檢測人/ ^/？劃基因突變的方法，其步驟包括(a)確定在樣品中人/^基因編碼的第9位氨基酸，或SEQID NO: 1的第360至 362位核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在氨基酸R— Q突變。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突變是在SEQID NO: 1第361位核苷酸G —A的突變。
3.一種分離的核酸，其特征在于，所述分離的核苷酸序列是SEQ ID N0:1所示的序列， 且第361位為A ；或包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特異性片段。
4.一種分子標(biāo)記，其為權(quán)利要求3所述分離的核酸。
5.一種用于輔助診斷遺傳性擴(kuò)張型心肌病的試劑盒，其包括用于人/ / ^基因的第 1外顯子第26位核苷酸檢測的試劑，或用于該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列相應(yīng)位點(diǎn)檢測的試劑， 或用于檢測該基因表達(dá)產(chǎn)物相應(yīng)位點(diǎn)檢測的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為1)檢測基因組的PCR試劑盒；或2)檢測mRNA的熒光定量PCR檢測試劑盒，或Northern檢測試劑盒；或3)檢測該突變蛋白的免疫檢測試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR試劑盒包括序列為SEQID NO:3和4的引物對。
8.一種檢測人/ ^/？劃基因突變的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和4所示。
9.一種寡核苷酸探針，其特異性地與SEQ ID NO: 1雜交并檢測其第361位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及人PPP2R3A的基因突變及其與擴(kuò)張性心肌病的相關(guān)性。本發(fā)明提供了檢測人PPP2R3A基因的突變的方法，并提供了相關(guān)的檢測試劑盒。本發(fā)明方法是通過確定SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸，檢測其是否存在G→A突變。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)人PPP2R3A基因的SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸(基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第26位)存在G→A單核苷酸多態(tài)性，當(dāng)發(fā)生G→A突變時，改變了PP2A酶的磷酸酶活性，存在與遺傳性擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病相關(guān)性。本發(fā)明可以用于擴(kuò)心病的輔助診斷，用于發(fā)現(xiàn)擴(kuò)心病的潛在攜帶者，為該病的預(yù)防提供依據(jù)。
文檔編號C12N15/11GK102443630SQ20111035431
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者周新, 宋貴波, 干學(xué)東, 李聰, 楊娜, 鄭芳 申請人:武漢大學(xué)