專利名稱：一種突變型人表皮生長因子基因、蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變型人表皮生長因子基因、蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(humanepidermal growth factor, hEGF)發(fā)現(xiàn)于 1962 年，是一種由53個氨基酸殘基組成的單體多肽。已證實(shí)hEGF是一種關(guān)鍵性的創(chuàng)傷愈合因子，通過與人表皮生長因子受體(EGFR)的結(jié)合，它能對上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的致分裂作用；促進(jìn)皮膚、角膜、肺和氣管上皮組織等的增殖和分化；對表皮損傷和潰瘍具有卓越修復(fù)功能；臨床上對腸、胃、肝等器官表面損傷的修復(fù)和再生也有顯著療效。綜上所述hEGF在醫(yī)療、美容護(hù)膚等方面有著廣泛的應(yīng)用前景，但是由于其自身半 衰期較短等不利因素，至今尚未得到廣泛的使用，利用分子手段將它進(jìn)行改造已成為必然。上個世紀(jì)，我們對EGF的研究多集中于怎樣獲得更多的EGF。近年來，隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，人們不再滿足于簡單的獲取與利用，分子水平上的研究和改造也已開始進(jìn)行。由于EGFR的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，改造EGF以期獲得EGFR拮抗劑可能成為腫瘤治療的輔助藥物；另外，由于EGF能夠使細(xì)胞脫分化、促進(jìn)細(xì)胞生長，因此能得到活性增強(qiáng)的EGF突變體也是改造的一個重要目標(biāo)。分析了 EGF分子特點(diǎn)后我們發(fā)現(xiàn)1)現(xiàn)在EGF的三維結(jié)構(gòu)已比較清楚但是其結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系并不清楚；2) EGF分子很小，核酸序列只有159bp，蛋白質(zhì)水平也僅有53個氨基酸，難以進(jìn)行傳統(tǒng)改組方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種新突變型表皮生長因子基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述突變型表皮生長因子基因編碼的蛋白。本發(fā)明的又一目的是提供上述突變型表皮生長因子基因和蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
一種突變型人表皮生長因子基因，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。該序列是在野生型EGF (表皮生長因子)核苷酸序列的119位的腺嘌呤(A)突變?yōu)樾叵汆奏?T)的核苷酸序列。上述突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。氨基酸序列第40位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸，比野生型EGF蛋白比活提高了 20%。上述突變型人表皮生長因子基因的制備方法，是以天然人表皮生長因子基因和豬表皮生長因子基因?yàn)槟０?，進(jìn)行易錯PCR和交錯延伸PCR，獲得表皮生長因子基因的重組突變文庫，連接入噬菌體載體，轉(zhuǎn)化宿主菌獲得噬菌體文庫，經(jīng)過噬菌體拯救的方法擴(kuò)增該噬菌體文庫，用過表達(dá)人表皮生長因子受體的細(xì)胞淘洗篩選，最終獲得能與人表皮生長因子受體穩(wěn)定結(jié)合的噬菌體，將所得噬菌體與宿主菌孵育、擴(kuò)增，進(jìn)行細(xì)胞表面受體ELISA反應(yīng)，最終篩選出權(quán)利要求I所述突變型人表皮生長因子基因。上述方法更具體的步驟如下
(1)易錯PCR:以天然hEGF基因、pEGF基因?yàn)槟０?，SEQID NO:3 6所示序列為引物，進(jìn)行易錯PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落用Amp-LB培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，提取質(zhì)粒；
(2)交錯延伸PCR:以質(zhì)粒為模板，SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，SEQ ID NO: 3 4為引物進(jìn)行第二輪PCR，所得產(chǎn)物為人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化文庫；
(3)噬菌體展示篩選人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化文庫與載體PCANTAB-5E連接，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，同時在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中加入輔助噬菌體M13K07進(jìn)行噬菌體拯救，獲得人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化DNA的噬菌體展示文庫；
(4)用經(jīng)過封閉的，可以過表達(dá)EGFR的A431細(xì)胞與人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化DNA的噬菌體展示文庫共同孵育，以大腸桿菌TGl洗脫，同時用輔助噬菌體M13K07進(jìn)行噬菌體拯救，反復(fù)淘洗4輪，得到與EGFR結(jié)合力強(qiáng)的人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化DNA的曬菌體展不文庫；
(5)步驟(4)所得產(chǎn)物與其宿主菌孵育、擴(kuò)增，然后進(jìn)行細(xì)胞表面受體ELISA反應(yīng)，篩選出具有高受體親和力的突變型人EGF基因。一種突變型人表皮生長因子表達(dá)載體，是由上述突變型人表皮生長因子基因插入到載體pET32a(+)的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。上述突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白的制備方法，步驟為^fSEQ ID NO: I所示突變型人表皮生長因子基因連接于表達(dá)載體pET32a(+)，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，進(jìn)行融合表達(dá)、純化，得到突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白。本發(fā)明的突變型人表皮生長因子基因在制備防治表皮生長因子受體表達(dá)異常引起的疾病的藥物、診斷表皮生長因子受體表達(dá)異常引起的疾病的試劑、防治上皮損傷疾病的藥物、促表皮生長恢復(fù)的藥物和/或化妝品添加劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所得到的突變型人表皮生長因子蛋白可作為藥物，用于治療燙傷燒傷、組織乃至器官切除的傷口愈合。本發(fā)明蛋白亦可作為美容用品，用于結(jié)痂的消除、皮膚美白
坐寸o本發(fā)明蛋白當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，通常將其凍干粉按照PH6-8溶于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中。配制好的藥物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)擦拭、皮下、皮內(nèi)或局部給藥。當(dāng)本發(fā)明蛋白被用做藥物時，治療有效劑量通常為g/100mL，當(dāng)然具體劑量應(yīng)當(dāng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明采用較有利于小分子進(jìn)化的易錯PCR (error prone PCR)和交錯延伸PCR(StEP-PCR)聯(lián)合的方法將hEGF和pEGF的DNA進(jìn)行分子定向進(jìn)化，探索了簡便、有效、優(yōu)化的EGF體外定向進(jìn)化的技術(shù)路線，構(gòu)建了 EGF定向進(jìn)化文庫，用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測法(SSCP)初步檢測發(fā)現(xiàn)文庫突變率可以達(dá)到其它大分子改組的突變率水平。本發(fā)明采用國際上先進(jìn)的活細(xì)胞篩選技術(shù)，將突變文庫構(gòu)建成M13噬菌體展示文庫，通過活細(xì)胞噬菌體展示、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和MTT還原測定的方法篩選到活性增強(qiáng)的突變體E40V。實(shí)驗(yàn)表明，在BL21細(xì)胞中表達(dá)得到的40位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸的EGF蛋白經(jīng)MTT法測活分析，比野生型EGF蛋白比活提高20%，因此可以在實(shí)際應(yīng)用中時減少用量，降低其副作用。本發(fā)明構(gòu)建的pET32a-EGF/E40V中EGF/E40V基因位于17啟動子控制下，在EGF/E40V基因的5’端融合了硫氧還蛋白基因，可以提高EGF蛋白的可溶性。


圖I. EGF定向進(jìn)化文庫的構(gòu)建及噬菌體展示法篩選突變型EGF的流程圖。圖2. EGF/E40V基因的測序結(jié)果圖。 圖3.突變型EGF (rEGF)與野生型EGF (hEGF)的活性比較圖，即MTT法比較分析各重組子促A431細(xì)胞生長幾率，樣品I飛分別為第13、14、15、16、22、26號樣品，其中26號樣品即為EGF/E40V。圖4. SDS-PAGE電泳分析重組EGF表達(dá)及純化情況，其中a圖為誘導(dǎo)前后的對比，泳道 13b、14b、15b、16b、22b、26b 為誘導(dǎo)前的菌液，13a、14a、15a、16a、22a、26a 為誘導(dǎo)后的菌液，上樣15 u L，泳道CK為重組EGF陽性對照，分量子約為27kD ；b圖為純化后的蛋白，泳道CK為重組EGF陽性對照，分量子約為27kD，泳道13、14、15、16、22和26為相應(yīng)編號樣品純化后的結(jié)果，上樣15 UL。圖5. MTT法檢測hEGF和EGF/E40V在不同濃度梯度下的促增殖活性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例不對本發(fā)明作任何形式的限制，實(shí)施例中如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段。實(shí)施例中所用到的生物材料及來源
載體 pMD18T : TAKARA 公司；
大腸桿菌DH5 a TAKARA公司；
PCANTAB-5E 載體NEB 公司；
大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞TAKARA公司；
噬菌體M13K07 NEB公司；
A431細(xì)胞中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；
載體 pET32a(+) Novagen 公司；
大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞TAKARA公司；
大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞TAKARA公司；
NTH3T3 細(xì)胞TAKARA 公司。實(shí)施例I
天然的人表皮生長因子為53個氨基酸，天然的豬表皮生長因子同為53個氨基酸，兩者同源性為84%。我們通過DNA定向進(jìn)化的方法和噬菌體展示方法得到了具有高EGFR親和性的突變型EGF的編碼核苷酸序列。其DNA序列及氨基酸編碼序列見SEQ ID NO: I和SEQID N0:2。通過將該序列與pET32a(+)載體融合表達(dá)獲得新的具有高EGFR親和性的突變型人重組表皮生長因子蛋白。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
I.突變型人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化文庫的構(gòu)建。I)分別以人表皮生長因子(hEGF)核苷酸序列(Gene ID: 1950，SEQ ID N0:7)和豬表皮生長因子(pEGF)核苷酸序列(Gene ID: 397083, SEQ ID NO:8)為模板，用引物1，2，3，4進(jìn)行易錯PCR (Mn2+O. 25/Mg2+l. OOmM)擴(kuò)增得到5’端帶酶切位點(diǎn)，3’端帶艙(1酶切位點(diǎn)的基因片段。hEGF 引物 引物 I :5’ TAGGCCCAGCAGGCCAATAGTGACTCTGAATGTCC 3’(SEQ ID NO:3);
引物 2:5’ CCGGCGGCCGCGCGCAGTTCCCACCACTTCAG 3’(SEQ ID NO:4)。pEGF 引物
引物 3:5’ TAGGCCCAGCAGGCCAATAGTACTCTGAATGCCCGC 3’(SEQ ID NO:5);
引物 4:5’ CCGGCGGCCGCGCGCAGCTCCCACCATTTCAAG 3’(SEQ ID NO:6)。易錯PCR 反應(yīng)體系50 ii L 體系中含 10XPCR buffer 5u L (不含 Mg2+)，dNTP I UL，上游引物、下游引物各Iii L，模板DNAlii L (約lng)，Taq DNA聚合酶I y L，Mn2+O. 1/0. 25/0. 4mM, Mg2+O. 5/1. 0/1. 5mM,加 ddH20 至 50 y L。反應(yīng)條件為94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火45秒，72°C延伸I分鐘，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72°C下保溫3分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。2)將擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pMD18T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，涂布于含IPTG/X-Gal的平板上，37°C倒置培養(yǎng)18小時后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色單菌落于Amp-LB液體培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振蕩過夜培養(yǎng)(Amp-LB液體培養(yǎng)基配制酵母提取物5g，蛋白胨10g, NaC15g，水lOOOmL，pH7. Cl. 6，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素lmL)。分別提取擴(kuò)大培養(yǎng)的質(zhì)粒。3)將提取的含有hEGF易錯PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒和含有pEGF易錯PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒等比例混合作為PCR模板(標(biāo)記為StEP模板)，用引物I，2，4進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，50°C退火30秒，循環(huán)50輪，進(jìn)行PCR，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72°C下保溫3分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分)，取擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物1，2再進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火45秒，72°C延伸I分鐘，循環(huán)30輪，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72°C下保溫3分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收保存。該產(chǎn)物即為人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化文庫。2.用噬菌體展示文庫的方法篩選具有高EGFR親和性的突變型人重組表皮生長因子基因。I)使用限制性內(nèi)切酶和艙打分別將pCANTAB-5E載體和步驟I得到的人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化文庫進(jìn)行雙酶切，兩種DNA反應(yīng)體系相同，反應(yīng)體系30iiL :10XM/H buffer 3 u L，質(zhì)粒 DNA20 u L,Sfil ^iNotll u L, ddH206 y L，5(TC或 37°C溫浴 2 小時，pCANTAB 5E載體溫浴4h。2)將雙酶切產(chǎn)物膠回收后使用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌TGl感受態(tài)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中加入輔助噬菌體M13K07進(jìn)行噬菌體拯救(具體步驟為1、在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入9. ImL不含Amp的2 X YT-G培養(yǎng)基，37°C下250rpm震蕩培養(yǎng)I小時。2、加A 50mL 20ng/mL的Amp和4X 101Qpfu的輔助噬菌體M13K07，37°C下250rpm震蕩培養(yǎng)I小時。3、1000XG離心10分鐘收集，小心地棄除上清并輕柔地加入IOmL 2XYT-AK重懸。4、用0. 45 ii m濾膜過濾,儲存于4°C或者進(jìn)行淘洗。5、如滴度小于IO7 pfu/mL則要進(jìn)行文庫擴(kuò)增，將過濾的噬菌體重新感染TGl細(xì)胞37°C下250rpm震蕩培養(yǎng)過夜再進(jìn)行噬菌體拯救)，獲得人重組表皮生長因子基因定向進(jìn)化DNA的噬菌體展示文庫(簡稱噬菌體展示文庫)。3)利用A431細(xì)胞表面過量表達(dá)EGFR (表皮生長因子受體)的現(xiàn)象，將A431細(xì)胞用含5%胎牛血清的PBS封閉后，與上述步驟2)得到的噬菌體展示文庫共同孵育，然后用含0. 1%吐溫20的PBS洗滌，后用5mL對數(shù)期的大腸桿菌TGl洗脫得到與EGFR結(jié)合力強(qiáng)的噬菌體展示文庫，并使用輔助噬菌體M13K07拯救文庫。如此反復(fù)淘洗,總計4輪。4)在最后一輪淘洗得到的文庫涂布SOBAG平板(細(xì)菌用蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0. 5g，加水至900mL，高壓滅菌，滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至60°C，加入IOmL IM的MgC12，55. 6mL 2M的葡萄糖，以及5mL 20mg/mL的Amp青霉素〈三者均為過濾除菌〉，固體培養(yǎng)基在 滅菌前加入瓊脂粉15g)培養(yǎng)，挑取30個單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后用輔助噬菌體M13K07侵染獲得單克隆噬菌體液，將該噬菌體液加入種有過量A431細(xì)胞的96孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞表面ELISA，獲得SEQ ID NO: I所示的DNA分子EGF/E40V。具體步驟如下
細(xì)胞固定
①選擇覆蓋度70%，25cm2培養(yǎng)瓶中細(xì)胞數(shù)達(dá)到3.5 4X IO6左右的細(xì)胞，胰蛋白酶作用消化，計數(shù)；
②1500轉(zhuǎn)離心3分鐘，用完全培養(yǎng)基懸浮到合適濃度(A431為上皮細(xì)胞所以濃度應(yīng)為4X IO5 cells/mL)；
③在96孔板上每孔加IOOyL的細(xì)胞懸浮液，應(yīng)注意的是，為了保證每個孔的細(xì)胞數(shù)分布均勻，每加三個孔就要將細(xì)胞吹打懸浮一次，37°C培養(yǎng)過夜；
④用PBSI洗兩次；
⑤每孔加入125y L緩沖液稀釋過的10%的福爾馬林，室溫下固定15分鐘；
⑥雙蒸水洗滌三次，吸干水分；
⑦2 8°C儲存，盡快使用。ELISA
①用雙蒸水洗滌ELISA板一次；
②封閉每孔加250u L PBS II，37。。孵育Ih ；
③雙蒸水洗滌3次，每孔加入用PBSI稀釋過的檢測物50 ii L ;
④37°C孵育2h；
⑤雙蒸水洗滌5次，每孔加入生物素標(biāo)記的抗體(PBSI稀釋)50i!L;
⑥37°C孵育Ih；
⑦雙蒸水洗滌5次后，每孔加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(PBSI稀釋)50yL孵育Ih;
⑧雙蒸水洗漆5次后,再用碳酸鹽buffer洗漆一次；
⑨顯色每孔加入0.5u L 4. 0% 0PD, 5 u L 30% H202,1. 0 u L IOX酶作用底物buffer, 8. 5 uL dd_H20，室溫孵育 20min ；⑩每孔加入25 Ii L 4. 5N的硫酸(終止反應(yīng))，15min內(nèi)酶標(biāo)儀A490波長讀數(shù),篩選到13、14、15、16、22、26號樣品為具有較高親和活性的突變子，其中第26號即為SEQ ID NO: I所示的DNA分子EGF/E40V。3.高效表達(dá)融合型pET32a(+)_EGF/E40V重組載體的構(gòu)建。I)以SEQ ID N0:1所示的DNA分子(EGF/E40V)為模板，用引物5，6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到5’端帶Ac0RI酶切位點(diǎn)，3’端帶通ol酶切位點(diǎn)的基因片段。引物5 :5，-GCGAATTCAATAGTGACTCTGAATGTCC-3，(SEQ ID NO:9);
引物 6 :5，-ATCTCGAGGCGCAGTTCCCACCACTTCAG-3’ (SEQ ID NO: 10)。2)用&oRI與通ol同時雙酶切PCR膠回收產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pET32a，酶切的重組EGF/E40V片段與pET32a進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，Amp-LB平板上37 °C過夜培養(yǎng)。 3)挑取單個的陽性克隆培養(yǎng)，并進(jìn)行雙酶切(&oRI酶切和通ol酶切)和PCR驗(yàn)證，最終通過測序確定pET32a (+) -EGF/E40V重組載體構(gòu)建成功。4. pET32a(+)_EGF/E40V重組載體在BL21細(xì)胞中的表達(dá)及分離純化和鑒定。I)將構(gòu)建成功的pET32a(+)_EGF/E40V重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞。2)挑取單克隆培養(yǎng)，在擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)期后，使用異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG,終濃度為0. 5mM)在30°C、220rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6小時后，收集菌體。3)使用PBS洗滌菌體2次后，反復(fù)凍融菌體3次。4)加入IOOii L溶菌酶和IOii L苯甲基磺酰氟(PMSF)與之冰上孵育I小時，然后超聲破碎(4s/4s/99個循環(huán))，離心，取上清(含蛋白)。5)將上步得到的蛋白上清液加入TAL0N 金屬離子樹脂純化柱中，按照其操作指南進(jìn)行純化，得到SEQ ID N0:2所示多肽蛋白，具體步驟如下
①用ImL Equilibration/Wash Buffer 重懸His-Tag純化柱,之后 700g 離心 2 分鐘，去掉離心所得液。重復(fù)此步驟3次；
②將表達(dá)獲得的蛋白上清ImL加到純化柱中，重懸樹脂后靜置30s；
③將純化柱放置在靜音混合器上，4°C結(jié)合過夜(12-16h)；
④第二天700g離心2分鐘，收集流出液用于跑膠檢測；
⑤向純化柱中加入0.5mLEquilibration/Wash Buffer (20mM咪唑)，靜置30s,之后放置在靜音混合器上5min，充分重懸樹脂；
⑥700g離心2分鐘，收集流出液跑膠檢測；并重復(fù)此步驟5次；
⑦空轉(zhuǎn)，700g離心純化柱2分鐘，以除去多余的Equilibration/WashBuffer ；
⑧加入0.5mL Elution Buffer (300mM咪唑)到純化柱中，靜置Imin,之后輕輕攪動，重懸樹脂；
⑨700g離心2分鐘，收集洗脫液，用以跑膠檢測；并重復(fù)次步驟4次。6)使用15% SDS-PAGE檢測純化產(chǎn)物，考馬斯亮藍(lán)染色檢測呈一條帶，見圖4，表明獲得了純的，最終得到突變型表皮生長因子蛋白。實(shí)施例2MTT法檢測突變蛋白的促增殖活性
I)培養(yǎng)NTH3T3細(xì)胞至狀態(tài)良好，覆蓋度達(dá)到75%，消化離心后重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
2)按細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至合適濃度(保證96孔板每孔細(xì)胞數(shù)為1000個)，在96孔板上每孔加入IOOiI L細(xì)胞懸液，其中第一列不加細(xì)胞作為空白對照。370C，5%C02培養(yǎng)4 6小時。3)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基小心吸出，換成無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)37V，5%C02饑餓培養(yǎng)4小時。4)小心吸出無血清培養(yǎng)基，將稀釋于含0. 2FBS%的DMEM的實(shí)驗(yàn)藥物(hEGF、EGF/E40V)按照0. OOlnM, 0. InM, InM, IOnM, IOOnM, IOOOnM的濃度加入，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)孔，37 °C, 5%C02培養(yǎng)24小時。5)每孔加入5mg/mL溶解于PBS的MTT 50 u L,37 °C，5%C02培養(yǎng)4小時，以使細(xì)胞內(nèi)線粒體充分還原MTT形成甲瓚。6)小心地將96孔板倒扣于衛(wèi)生紙上，輕輕地將培養(yǎng)基倒出，然后每孔加入150 U I DMSO,于脫色搖床上搖勻15分鐘，使甲瓚充分溶解，酶標(biāo)儀492nm波長檢測，取3孔的平均值扣除陰性對照，于GraphPad prism 5軟件中作圖分析，并比較hEGF與EGF/E40V的促增殖活性。7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，表明EGF/E40V相對于hEGF具有顯著的增長，其促增殖活性提高了 20%。
權(quán)利要求
1.一種突變型人表皮生長因子基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權(quán)利要求I所述突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.權(quán)利要求I所述突變型人表皮生長因子基因的制備方法，其特征在于以天然人表皮生長因子基因和豬表皮生長因子基因?yàn)槟０澹M(jìn)行易錯PCR和交錯延伸PCR，獲得表皮生長因子基因的重組突變文庫，連接入噬菌體載體，轉(zhuǎn)化宿主菌獲得噬菌體文庫，經(jīng)過噬菌體拯救的方法擴(kuò)增該噬菌體文庫，用過表達(dá)表皮生長因子受體的細(xì)胞淘洗篩選，最終獲得能與表皮生長因子受體穩(wěn)定結(jié)合的噬菌體，將所得噬菌體與宿主菌孵育、擴(kuò)增，進(jìn)行細(xì)胞表面受體ELISA反應(yīng)，最終篩選出權(quán)利要求I所述突變型人表皮生長因子基因。
4.一種突變型人表皮生長因子表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求I所述突變型表皮生長因子基因插入載體pET32a(+)的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。
5.權(quán)利要求2所述突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白的制備方法，其特征在于將SEQ ID NO: I所示突變型人表皮生長因子基因連接于表達(dá)載體pET32a(+)，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，進(jìn)行融合表達(dá)、純化，得到突變型人表皮生長因子基因編碼的蛋白。
6.權(quán)利要求I所述突變型人表皮生長因子基因在制備防治表皮生長因子受體表達(dá)異常引起的疾病的藥物、診斷表皮生長因子受體表達(dá)異常引起的疾病的試劑、防治上皮損傷疾病的藥物、促表皮生長恢復(fù)的藥物和/或化妝品添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種突變型人表皮生長因子基因、蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的突變型人表皮生長因子基因和蛋白序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。本發(fā)明采用易錯PCR和交錯延伸PCR聯(lián)合的方法將hEGF和pEGF的DNA進(jìn)行分子定向進(jìn)化，構(gòu)建了EGF定向進(jìn)化文庫，進(jìn)而篩選出上述突變型人表皮生長因子基因。該序列是野生型EGF核苷酸序列119位A突變?yōu)門，其編碼的氨基酸40位的Glu突變?yōu)閂al，突變后的蛋白功能與野生型相同，且比野生型EGF蛋白比活提高20%，可用于制備防治表皮生長因子相關(guān)疾病藥物或診斷試劑等，使用量減少，其副作用降低。
文檔編號A61K8/60GK102719439SQ201210170800
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者劉昕, 張擎, 鄒尚利 申請人:中山大學(xué)