專利名稱：miR397在培育高產(chǎn)水稻中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及miR397的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糧食問題是當(dāng)今世界所面臨的幾個難題之一。尋找影響水稻產(chǎn)量相關(guān)特性的基因一直以來都是提高糧食產(chǎn)量的研究重點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少影響水稻產(chǎn)量的基因，對提高水稻產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)。但為了解決不斷增長的人口與逐漸減少的耕地面積的矛盾， 發(fā)現(xiàn)更多調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量的基因仍是急需解決的大問題。因此，不斷尋找新的提高水稻產(chǎn)量基因，已成為農(nóng)業(yè)進(jìn)一步增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)研究，倍受世界各國政府和科學(xué)家的關(guān)注，也是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點。miRNA(microRNA)是一組非編碼單鏈RNA，廣泛存在于動物和植物等多細(xì)胞生物中，它可以通過與靶基因mRNA的特定位點結(jié)合，誘導(dǎo)該mRNA的降解或抑制該蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致基因沉默，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控。miRNAs參與了幾乎所有的生命活動，并起著重要作用。在植物中，DCLl酶在細(xì)胞核內(nèi)識別miRNA前體(pre_miRNA)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其切割成miRNA :miRNA*雙體，然后由HST蛋白將其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行進(jìn)一步的加工。在不同的植物組織、器官和發(fā)育時期，miRNA的表達(dá)譜是不同的，并且部分miRNA在不同的外界環(huán)境下也有著不同的表達(dá)水平。因此，研究miRNA表達(dá)譜對miRNA生物功能的研究是非常重要的。植物miRNA主要參與植物逆境抵抗，發(fā)育調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自身生物合成調(diào)控等。 例如miR393與生長素信號介導(dǎo)的病原菌抗性，miR393的靶蛋白為F_box類的生長素因子 (TIR1, AFB2, AFB3)，這些蛋白是生長素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要節(jié)點，miR393的表達(dá)量提高會減少TIRl的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使植物對病菌感染產(chǎn)生抵抗能力； miR398的表達(dá)受氧化脅迫的作用下下調(diào)表達(dá)，在擬南芥中，miR398的靶蛋白是超氧化物岐化酶CSDl和CSD2，它們在植物中可以清除氧負(fù)離子自由基，在植物抗氧化作用中起重要作用，組成型表達(dá)抗miR398切斷CSD基因的轉(zhuǎn)基因植物，對強紫光照射、重金屬等高氧化狀態(tài)的逆境有更好的抗性；miR399與植物無機磷吸收存在聯(lián)系，miR399的表達(dá)受磷(Pi)饑餓的誘導(dǎo)而上調(diào)，這種上調(diào)在額外加入Pi之后馬上被抑制，miR399的靶基因為一種UBC (Ubiquitin-conjugating E2 enzyme)蛋白，組成型表達(dá)miR399會引起植物體內(nèi)Pi的代謝失調(diào)，使植物體內(nèi)積累過多的Pi，導(dǎo)致植物呈現(xiàn)Pi中毒的癥狀；miR165/166調(diào)控葉子的極性、維管組織的發(fā)育，擬南芥有五個HD-ZIP III基因(REV、PHB、PHV、ATHB-8及ICU4)參與調(diào)節(jié)發(fā)育方面重要的方面，比如維管束的形成、在器官中建立或維持離軸及近軸的極性，所有這些基因內(nèi)部都存在miR165/miR166的靶位點，miRNA調(diào)節(jié)對于維持正常器官的極性，維管系統(tǒng)及分生組織的發(fā)育是必不可少的。
有趣的是，還有一些植物miRNA參與調(diào)控水稻產(chǎn)量。例如miR167可以通過調(diào)控其靶基因ARF8，來調(diào)節(jié)生長素信號通路，并最終影響植物產(chǎn)量；miR159切割一類受赤霉素調(diào)控的MTO家族基因，組成型表達(dá)miR159會引起短日照情況下開花的推遲和花粉的不正常發(fā)育；近期更有報道，水稻中miR156通過對下調(diào)其靶基因0sSPL14，顯著降低水稻分蘗，穗分支及種子數(shù)量，直接負(fù)調(diào)控水稻產(chǎn)量。因此，從miRNA角度尋找新的調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量的基因有著充分的理論基礎(chǔ)，并將成為新的研究熱點，有著廣闊的發(fā)展空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前糧食緊缺與不斷增長的人口這一主要矛盾，將miRNA調(diào)控技術(shù)引入水稻的品種改良中，從而提供miR397在培育高產(chǎn)水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
通過分析水稻種子和胚胎中特異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR397在種子和胚胎中均高表達(dá)，并且在胚后發(fā)育時表達(dá)量顯著下調(diào)。這暗示了 miR397可能有調(diào)節(jié)水稻種子發(fā)育的潛在功能。為了進(jìn)一步驗證miR397與水稻種子的關(guān)系，本發(fā)明構(gòu)建了過表達(dá)miR397的水稻突變株，該突變株生長迅速，提前抽穗，并且在成熟期時稻穗明顯比野生型下垂。對該突變株進(jìn)行詳細(xì)的表型分析后發(fā)現(xiàn)，該突變株的水稻谷粒顯著大于野生型谷粒，并且每穗粒數(shù)與千粒重都也明顯高于野生型。最終每穗產(chǎn)量約高出野生型37%。除了對水稻產(chǎn)量的影響外，該突變株還具有提前抽穗，提高有效分蘗率的表型，非常適宜于投入生產(chǎn)使用。綜上所述可以得出結(jié)論過表達(dá)miR397可以顯著提高水稻的產(chǎn)量，增大谷粒大小與千粒重，增多每穗粒數(shù)。因此miR397可以用于培育高產(chǎn)水稻。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR397可以顯著提高水稻的產(chǎn)量，增大谷粒大小與千粒重，增多每穗粒數(shù)，這一結(jié)果為培育高產(chǎn)水稻提供了一種全新的并且簡單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用；
2.本發(fā)明通過分子生物學(xué)技術(shù)培育高產(chǎn)水稻，不但水稻的產(chǎn)量高，而且不會對環(huán)境造成污染，食用安全。


圖1為northern雜交檢測各T3代突變株中miR397的表達(dá)水平； 其中，1為野生型對照，2 10為T3代突變株的不同轉(zhuǎn)基因系列；
圖2為野生型與突變株全株的比較；
其中，左邊為野生型，右邊為過表達(dá)miR397的突變株
圖3為野生型與突變株的種子大小比較；
其中，上排為野生型，下排為過表達(dá)miR397的突變株谷粒；
圖4為野生型與突變株的穗大小比較；
其中，左為野生型，右為過表達(dá)miR397的突變株穗；
圖5為野生型與突變株千粒重和每穗粒數(shù)的統(tǒng)計比較；其中，左圖為千粒重比較，右圖為每穗粒數(shù)比較；黑色柱子代表野生型，紅色柱子代表過表達(dá)miR397的突變株；
圖6為野生型與突變株每穗產(chǎn)量的統(tǒng)計比較；
其中，黑色柱子代表野生型，紅色柱子代表過表達(dá)miR397的突變株。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1 水稻總RNA提取
本實施例采用本領(lǐng)域常用的酚氯仿異戊醇法提取水稻總RNA，其具體步驟如下
(1)稱Ig水稻樣品液氮研磨成細(xì)粉，加入IOmLRNA zol (100ml中含有異硫氰酸胍47. 2g，IM檸檬酸鈉(pH7. 0) 2. 5ml，10%月桂?；徕c5ml)和ImL醋酸鈉(2M，pH 4.0)，繼續(xù)研磨；
(2)加入IOmL的水飽和酚，4mL的氯仿異戊醇(49:1，體積比)混合液，混勻后轉(zhuǎn)入離心管，渦旋lmin，冰上放置5分鐘，然后4°C,12000rpm離心15min ；
(3)離心后取上清，并向上清液中加入等體積的酚氯仿異戊醇(5049 :1，體積比)混合液，渦旋lmin,冰上放置5分鐘，然后40C，12，OOOrpm離心15min ；
(4)離心后取上清，重復(fù)步驟(3)2^3次；
(5)離心后取上清，并向上清液中加入異丙醇(異丙醇和上清液的體積比為0.6 :1)，冰上放置30min Ih ；
(6)4°C，12，OOOrpm離心15min，棄上清，往管中加入1.2mL DEPC處理水溶解管底沉淀， 然后每管600 μ 1分裝轉(zhuǎn)入1. 5mL的離心管；
(7)向上述1.5L離心管中加入600μ 1的酚氯仿異戊醇(50:49:1，體積比)混合液，上下顛倒混勻后，冰上放置5分鐘，室溫12，OOOrpm離心15min ；
(8)離心后取上清，重復(fù)步驟(7)2^3次；
(9)離心后取上清，將上清液每管分裝300μ L分裝入新的離心管中，并向分裝后的離心管中加入1/10上清體積的3Μ NaAc CpH 5. 2)和3倍上清體積的無水乙醇，混勻，-20°C 放置過夜；
(10)4°C，12，OOOrpm離心15min，棄除上清，70%乙醇洗兩次，95%乙醇洗一次，晾干，用 15 30 μ L DEPC處理水溶解，_20°C保存?zhèn)溆?，即獲得水稻總RNA。本實施例總RNA提取時所用到的各種試劑均為市售。實施例 2 miRNA 的 Northern 雜交
本實施例對實施例1提取的處理樣品組總RNA和對照組總RNA進(jìn)行Northern blot檢測，所用方法均可參考本領(lǐng)域Northern雜交的常規(guī)操作。取實施例1制備的水稻總RNA 1 μ L進(jìn)行甲醛變性膠電泳，變性電泳采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。待電泳完畢，取下電泳板后揭板，用一張和目標(biāo)區(qū)域差不多大小的干濾紙覆在凝膠樣品區(qū)域上，用刀片切去多余的凝膠，利用濾紙把膠翻轉(zhuǎn)，剝離另一塊電泳板。在膠上蓋一張等面積的預(yù)先用0. 5 X TBE浸潤的Hybond N+尼龍膜，將濾紙-凝膠-尼龍膜放于電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)電極之間，膠在上面，尼龍膜在下面，上下各墊10層用0.5XTBE浸濕并趕走氣泡的濾紙。用0.8 mA/cm2尼龍膜的電流強度，通電45分鐘。之后關(guān)閉電源，取下尼龍膜。尼龍膜在253 nm紫外燈下正反兩面分別交聯(lián)3分鐘，將RNA及分子量標(biāo)記固定于膜上。將交聯(lián)好的尼龍膜放入雜交管中，加入5 10mL雜交液(雜交液的配制可參考本領(lǐng)域 Northern雜交所采用的常規(guī)雜交液配制)，42 °C預(yù)雜交1小時，然后加入同位素標(biāo)記探針20 yL，42°C雜交過夜。雜交完畢，將雜交液倒出，用洗膜液(2XSSPE，0.5% SDS)于室溫下洗 3次，每次10分鐘。將雜交膜包入保鮮膜中，壓磷屏3小時以上，再用磷屏掃描儀Typhoon 8600 imager掃描，并保存結(jié)果。本實施例的Northern雜交檢測結(jié)果如圖1所示，過表達(dá)miR397的突變株中 miR397表達(dá)量明顯高于野生型。實施例3過表達(dá)miR397水稻突變株的構(gòu)建
本實施例在實施例2的檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了過表達(dá)miR397的水稻突變株， 其具體步驟如下所示
1. miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
本實施例選擇載體pCAMBIA1390(市售)，并且在該載體的酶切位點歷'/^III和SalY之間插入CaMV35S啟動子，該啟動子以后可以作為控制miR397表達(dá)的組成型啟動子。這里的試驗操作采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。從以實施例1制備的處理樣品總RNA為模板，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，并且在擴增產(chǎn)物兩端加上損al和^^TPI的酶切位點。PCR擴增反應(yīng)條件參考PCR擴增反應(yīng)試劑盒說明。 (這里上游引物采用 5，- GAATCTAGAACACGCTCTACCTACATCGTGT-3，，下游引物采用 5，- A TTGAATTCTCACCTCGTCTGCTGGGGACCT-3’)
PCR結(jié)束后回收擴增產(chǎn)物并進(jìn)行損aI和雙酶切，同時對pCAMBIA1390載體也進(jìn)行損al和雙酶切，然后將兩個雙酶切產(chǎn)物用Τ4連接酶連接起來即構(gòu)建成miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒。上述所涉及的擴增產(chǎn)物回收，雙酶切反應(yīng)，T4連接等反應(yīng)均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作，實驗中所涉及的載體、試劑等均為市售。2、miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織
將上述構(gòu)建的miR397組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(市售)，所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)操作，然后將該轉(zhuǎn)化有miR397過表達(dá)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌種，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培養(yǎng)基(IOg酵母膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl, 15 g瓊脂)上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)2 3天后挑取單菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2天，刮取適量菌體懸浮于含有100 μ M乙酰丁香酮的液體共培養(yǎng)基中，使之稀釋至 0D550為0.3左右，28°C搖床(140 rpm)培養(yǎng)40分鐘，即制備得到根癌農(nóng)桿菌浸染液，可用于侵染。取水稻的成熟種子剝?nèi)シf殼，用75%酒精浸泡1分鐘后用無菌水清洗多次，然后用次氯酸鈉處理兩次，每次20分鐘，期間搖動多次，無菌水清洗多次后用無菌濾紙吸干水分，接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6大量，B5微量，B5有機，鐵鹽，2mg/L 2，4_D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3. Og/L植物凝膠)上，將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織接到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 3個星期再挑取生長狀態(tài)好的愈傷組織接到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。挑取淡黃色、顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密、生長狀態(tài)好的愈傷組織到無菌三角瓶中適當(dāng)干燥處理后，加入上述制備好的根癌農(nóng)桿菌侵染液侵染20分鐘，期間適當(dāng)搖動幾次。侵染后將愈傷組織放在加有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，風(fēng)干1 2小時。然后把愈傷組織接到加有一層濾紙的共培養(yǎng)基上，再風(fēng)干半小時左右后，置于^TC黑暗培養(yǎng)2 3天。3、轉(zhuǎn)基因水稻陽性愈傷組織的篩選與分化
取出共培養(yǎng)后的愈傷組織放在加有三層濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，干燥1天左右，再接到篩選培養(yǎng)基上，置于26°C黑暗培養(yǎng)14 21天。共篩選兩次。挑取生長狀態(tài)好的抗性愈傷組織接到預(yù)分化培養(yǎng)基上，26°C光照培養(yǎng)。21天后，把生長狀態(tài)好及出現(xiàn)綠點的抗性愈傷組織接到分化培養(yǎng)基上，使愈傷組織進(jìn)行再生。待抗性愈傷組織分化出的小苗長到4 6 cm時，將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，繼續(xù)在 ^TC光照培養(yǎng)。待小苗長至10 12 cm，葉片寬大、顏色深綠且根系生長健全后，洗掉培養(yǎng)基及其基部附著的愈傷組織，在室外進(jìn)行盆栽種植，即得到轉(zhuǎn)基因水稻(過表達(dá)miR397)。上述篩選培養(yǎng)基的配方為N6培養(yǎng)基大量+MS培養(yǎng)基微量+B5培養(yǎng)基少量+Ig/ L水解酪蛋白+lg/L脯氨酸+2mg/L (2，4_D) +30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+頭孢500mg/ L+4g/L植物凝膠，篩選培養(yǎng)基的終PH=5. 8。上述預(yù)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+ lg/L水解酪蛋白+ 20g/L蔗糖+lmg/L (2，4-D) +頭孢500mg/L+潮霉素50mg/L + 4g/L植物凝膠，預(yù)分化培養(yǎng)基的終pH=5. 8。上述分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基+ang/L (6-BA)+0. 5mg/L萘乙酸+ lmg/L激動素+30g/L蔗糖+3%山梨醇+4g/L植物凝膠，分化培養(yǎng)基的終pH=5. 8。上述生根培養(yǎng)基的配方為1/2 MS培養(yǎng)基。本實施例中所采用的MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基等的配方均采用本領(lǐng)域的常規(guī)配方。上述各培養(yǎng)基配方中所涉及的試劑均為市售。實施例4轉(zhuǎn)基因水稻種植和表型分析
所有表型分析均使用T3代水稻植株。水稻種子用水萌發(fā)，在平盤上種植一周后，轉(zhuǎn)種于大田中長至谷粒成熟。其中，種子大小，千粒重比較使用完全成熟并烘干后的種子；每穗粒數(shù)統(tǒng)計使用完全成熟并烘干的完整的穗；所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均為多于60棵的水稻苗的平均值。每穗產(chǎn)量計算是用單顆谷粒重量乘以每穗粒數(shù)。
權(quán)利要求
1.miR397在培育高產(chǎn)水稻中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用是通過篩選過表達(dá)miR397的水稻從而得到高產(chǎn)水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開miR397在培育高產(chǎn)水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明人通過分析水稻谷粒和胚胎中特異性表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR397在谷粒中大量表達(dá)，并在胚后發(fā)育中顯著下調(diào)，暗示了miR397在水稻谷粒發(fā)育中的調(diào)控作用。然后本發(fā)明人構(gòu)建了過表達(dá)miR397的水稻突變株，該突變株生長迅速，提前抽穗，并且在成熟期時稻穗明顯比野生型下垂。對該突變株進(jìn)行詳細(xì)分析后，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR397的突變株谷粒明顯大于野生型谷粒，并且穗型更大，每穗粒數(shù)顯著高于野生型，千粒重和產(chǎn)量也有顯著提高。這一結(jié)果為培育高產(chǎn)水稻提供了一種全新的并且簡單有效的方法，可投入大規(guī)模推廣使用，且不會對環(huán)境造成污染，食用安全。
文檔編號C12N15/113GK102409055SQ20111036486
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者于洋, 張玉嬋, 徐杰, 李洪清, 王小菁, 陳月琴 申請人:中山大學(xué), 華南師范大學(xué)