專利名稱：一種可視的多個(gè)基因突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可視的多個(gè)基因突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
基因突變是由于DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的插入、缺失或改變，而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變。近年來，對(duì)癌癥病人進(jìn)行個(gè)性化治療已經(jīng)成為一種趨勢(shì)，它是根據(jù)癌癥患者藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)特點(diǎn)，采用特異和最佳的化療藥物方案進(jìn)行治療的方法。目前，基因突變分析已經(jīng)使癌癥患者個(gè)性化治療成為可能，用基因突變分析可以為醫(yī)生提供有力的證據(jù)和信息，在實(shí)施治療方案時(shí)，可選擇對(duì)患者最有效的藥物治療方案，不僅提高了療效，還可以降低化療的毒副作用，同時(shí)提高患者的生存質(zhì)量。另外，人體內(nèi)一些基因型的存在會(huì)增加人類患某種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，這種基因就叫疾病易感基因。通過疾病易感基因突變分析，可向人們提供個(gè)性化健康指導(dǎo)服務(wù)、個(gè)性化用藥指導(dǎo)服務(wù)和個(gè)性化體檢指導(dǎo)服務(wù)。就可以在疾病發(fā)生之前的幾年、甚至幾十年進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)防，而不是盲目的保??；人們可以通過調(diào)整膳食營養(yǎng)、改變生活方式、增加體檢頻度、接受早期診治等多種方法，有效地規(guī)避疾病發(fā)生的環(huán)境因素。基因突變分析方法常采用電泳分析和固相雜交的方法，如DNA測(cè)序、限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性分析、異源雙鏈核酸分析、等位基因特異性寡聚核苷酸雜交、錯(cuò)配酶切分析、寡聚核苷酸連接分析等，這些方法需要繁瑣的分離或洗滌程序， 增加了檢測(cè)時(shí)間。采用均相檢測(cè)方法可以避免上述問題，目前的均相檢測(cè)方法均基于熒光偏振或小分子熒光染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，偏振化熒光的強(qiáng)度大大降低，導(dǎo)致了基于熒光偏振的方法靈敏度不高；基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法均要對(duì)探針分子進(jìn)行雙修飾，導(dǎo)致成本很高。隨著個(gè)性化醫(yī)療時(shí)代的到來，操作簡(jiǎn)單高靈敏多基因突變位點(diǎn)的均相的同時(shí)分析不僅能減少檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化工作流程，而且還能為患者節(jié)省時(shí)間，讓醫(yī)生快速準(zhǔn)確地制定治療和預(yù)防方案。目前一些已知的基因突變位點(diǎn)檢測(cè)不太靈敏，如PIK3CA基因(NM_006218)的突變位點(diǎn) E545K、H1047R、E542K、H1047L, BRCAl 基因(NM_007294)的突變位點(diǎn) 185delAG、 5382insC, BRCA2 基因(NM_000059)的突變位點(diǎn) 6174delT ；Kras 基因(NM_004985)的突變位點(diǎn);34G > A、38G > A.35G > A, BRAF基因(NM_004333)的突變位點(diǎn)V600E，因此研究一種可以檢測(cè)這些位點(diǎn)的方法可以為醫(yī)生快速準(zhǔn)確地制定治療和預(yù)防方案奠定基礎(chǔ)。EM^(為PIK3CA基因所編碼蛋白的第542位E突變?yōu)镵，PIK3CA基因的第16 位核苷酸G突變?yōu)锳。E545K為PIK3CA基因所編碼蛋白的第545位E突變?yōu)镵，PIK3CA基因的第1633位核苷酸G突變?yōu)锳。H1047R為PIK3CA基因所編碼蛋白的第1047位H突變?yōu)镽，PIK3CA基因的第3140位核苷酸A突變?yōu)镚。H1047L為PIK3CA基因所編碼蛋白的第
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的方法，包括以下步驟1)以待測(cè)DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，2)用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；3)將步驟幻得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與式(I)的化合物反應(yīng)，直接目測(cè)觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)； 式(I)中，R代表鏈端含有四級(jí)胺的直鏈或支鏈的烷基，所述烷基的主鏈長(zhǎng)為2-12個(gè)碳，X代表鹵素；所述式(I)化合物的數(shù)均分子量為5000-100000。 '
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為步驟1)中，所述多重PCR擴(kuò)增的引物為能夠擴(kuò)增所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的所有突變位點(diǎn)的引物組；所述引物組由若干個(gè)能擴(kuò)增所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)的引物對(duì)組成；步驟2、中，所述用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括如下步驟 向步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入突變型特異性引物和與所述突變型特異性引物對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；所述突變型特異性引物與所述突變位點(diǎn)相鄰20-2^p的序列互補(bǔ)，且所述突變型特異性引物的3'末端核苷酸與所述突變位點(diǎn)的突變型核苷酸互補(bǔ)；所述突變型特異性引物對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP與所述突變位點(diǎn)相鄰的堿基互補(bǔ)；所述突變位點(diǎn)相鄰的堿基為位于所述突變型特異性引物延伸方向下游的一個(gè)堿基；每一條所述突變型特異性引物及其對(duì)應(yīng)的所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP對(duì)應(yīng)一個(gè)突變位點(diǎn)；所述突變型特異引物的條數(shù)和所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的個(gè)數(shù)均與所述目標(biāo)基因中的突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)相同；每一個(gè)所述熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)的熒光顏色不同； 步驟幻中，所述將步驟幻得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與上述式(I)的化合物反應(yīng)包括如下步驟將步驟幻得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與上述式(I)的化合物混勻，得到反應(yīng)產(chǎn)物；所述觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)為 若反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)顏色相同，則所述待測(cè) DNA的目標(biāo)基因含有或候選含有與所述dNTP或ddNTP互補(bǔ)的堿基相鄰的突變位點(diǎn)；若反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP的熒光物質(zhì)顏色不同，則所述待測(cè)DNA的目標(biāo)基因不含有或候選不含有與所述dNTP或ddNTP互補(bǔ)的堿基相鄰的突變位點(diǎn)； 所述熒光物質(zhì)具體為熒光素、德克薩斯紅或Cy3。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征為 步驟1)中，所述引物組為如下的任一一種1)所示的引物組由引物對(duì)A和引物對(duì)B組成；2)所示的引物組由引物對(duì)C、引物對(duì)D和引物對(duì)E組成；3)所示的引物組由引物對(duì)F和引物對(duì)G組成； 所述引物對(duì)A由引物1和引物2組成，所述引物對(duì)B由引物3和引物4組成， 所述引物對(duì)C由引物5和引物6組成， 所述引物對(duì)D由引物7和引物8組成， 所述引物對(duì)E由引物9和引物10組成， 所述引物對(duì)F由引物11和引物12組成， 所述引物對(duì)G由引物13和引物14組成， 所述引物1-14的核苷酸序列依次為序列表中的1-14 ；步驟2、中，所述突變型特異性引物及其對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP和對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)分別為如下1)-3)中任一一種1)、所述突變型特異性引物由引物組H和引物組I組成；所述引物組H由引物15和引物16組成；所述引物組I由引物17和引物18組成； 所述引物15對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標(biāo)記的dATP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為E545K ；所述引物16對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為熒光素標(biāo)記的dUTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為H1047R ；所述引物17對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標(biāo)記的dATP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為EMI；所述引物18對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為熒光素標(biāo)記的dUTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為H1047L ；2)所述突變型特異性引物為所述引物組J，所述引物組J由引物19-21組成；所述引物19對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為熒光素標(biāo)記的ddUTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為185delAG ；所述引物20對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標(biāo)記的ddATP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為5382insC ；所述引物21對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為Cy3標(biāo)記的ddGTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為6174delT ；3)所述突變型特異性引物為所述引物組K和/或所述引物組L，所述引物組K由引物 22和引物23組成；所述引物組L由引物M和引物25組成；所述引物22對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標(biāo)記的dATP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為34G > A ；所述引物23對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為熒光素標(biāo)記的dCTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為38G > A ；所述引物M對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為熒光素標(biāo)記的dUTP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為35G > A ；所述引物25對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記的dNTP或ddNTP為德克薩斯紅標(biāo)記的dATP，其對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)為V600E ；所述引物15-25的核苷酸序列為序列表中的序列15-25 ；步驟3)中，所述反應(yīng)為混勻；所述觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色是在紫外燈下進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征為 步驟1)所述多重PCR擴(kuò)增的退火溫度均為60°C ； 步驟幻中，所述單堿基延伸反應(yīng)的退火溫度均為60°C ；在步驟1)和步驟2~)之間，還包括如下步驟將步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸外切酶I和磷酸水解酶消化，得到消化產(chǎn)物；在步驟幻和步驟幻之間，還包括如下步驟將步驟幻得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行堿性磷酸酶消化，得到消化產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征為所述待測(cè)DNA是癌細(xì)胞、癌組織、正常細(xì)胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結(jié)腸癌或乳腺癌。
6.一種檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的引物，由引物組a、b、c組成；所述引物組a由權(quán)利要求3-5中任一所述方法中的所述1)所示的引物組、所述引物組 H和所述引物組I組成；所述引物組b由權(quán)利要求3-5中任一所述方法中的所述2、所示的引物組和所述引物組J;所述引物組c由權(quán)利要求3-5中任一所述方法中的所述幻所示的引物組、所述引物組 K和所述引物組L組成；所述引物組a、b、c為獨(dú)立包裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的引物，其特征在于所述待測(cè)DNA是癌細(xì)胞、癌組織、正常細(xì)胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結(jié)腸癌或乳腺癌。
8.一種檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的反應(yīng)試劑，由試劑al-cl和試劑a2_c2組成， 所述試劑al由所述1)所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴(kuò)增緩沖液組成； 所述試劑bl由所述2、所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴(kuò)增緩沖液組成； 所述試劑cl由所述幻所示的引物組、DNA聚合酶、dNTPs和PCR擴(kuò)增緩沖液組成； 所述1)- 所示的引物組中的各條引物在所述試劑al-cl中的終濃度均為200nM ； 所述試劑a2由所述引物組H、熒光素標(biāo)記的dUTP、德克薩斯紅標(biāo)記的dATP、DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成或由所述引物組I、熒光素標(biāo)記的dUTP、德克薩斯紅標(biāo)記的dATP、DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液組成；所述引物組H或所述引物組I中的各條引物在所述試劑a2中的終濃度均為1 μ M ； 所述試劑1^2由所述引物組J、熒光素標(biāo)記的ddUTP、德克薩斯紅標(biāo)記的ddATP和Cy3標(biāo)記的ddGTP和反應(yīng)緩沖液組成；所述引物組J中的各條引物在所述試劑1^2中的終濃度均為1 μ M ；所述試劑c2由所述引物組K、熒光素標(biāo)記的dUTP、德克薩斯紅標(biāo)記的dATP和反應(yīng)緩沖液組成或由所述引物組L、熒光素標(biāo)記的dCTP、德克薩斯紅標(biāo)記的dATP和反應(yīng)緩沖液組成；所述引物組K或所述引物組L中的各條引物在所述試劑c2中的終濃度均為1 μ M ； 所述待測(cè)DNA是癌細(xì)胞、癌組織、正常細(xì)胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結(jié)腸癌或乳腺癌。
9.一種檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的試劑盒，由試劑盒1-3組成； 所述試劑盒1包括所述試劑al和所述試劑a2 ；所述試劑盒2包括所述試劑bl和所述試劑1^2 ； 所述試劑盒3包括所述試劑cl和所述試劑c2 ； 所述試劑盒中的各物質(zhì)均為獨(dú)立包裝。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑，其特征在于所述待測(cè)DNA是癌細(xì)胞、癌組織、正常細(xì)胞或正常組織的基因組DNA ； 所述癌為結(jié)腸癌或乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可視的多個(gè)基因突變位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的方法。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)DNA中突變位點(diǎn)的方法，包括以下步驟1)以待測(cè)DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，2)用熒光物質(zhì)標(biāo)記步驟1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物；3)將步驟2)得到標(biāo)記熒光物質(zhì)的產(chǎn)物與上述式(I)的化合物反應(yīng)，觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色確定所述待測(cè)DNA中的目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用少量DNA就能夠檢測(cè)到多個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)的突變情況，對(duì)于癌癥的用藥指導(dǎo)和早期診斷具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102382892SQ20111036999
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者宋金召, 楊瓊, 王樹 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所