專利名稱：各種癌癥病理演變前期microrna-21原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與各種癌癥病理演變RNA表達(dá)改變(病理演變過程)的相關(guān)檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)260萬，死亡人數(shù)近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費(fèi)用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達(dá)地區(qū)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20萬)，700多萬患者，每年的花費(fèi)是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現(xiàn)有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時(shí)介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個(gè)年度報(bào)告，對 1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進(jìn)行回顧，報(bào)告認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結(jié)論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性(多態(tài)性);2.腫瘤細(xì)胞耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善(動物模型設(shè)計(jì)不科學(xué))等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現(xiàn)有的臨床醫(yī)學(xué)影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細(xì)胞膜因子、細(xì)胞核因子、細(xì)胞流式技術(shù))指標(biāo)來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學(xué)變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標(biāo)記物。傳統(tǒng)臨床觀念認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認(rèn)真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，從?xì)胞學(xué)角度來分析，1公分的腫塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止 2億個(gè)腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實(shí)的是在這個(gè)病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨(dú)的病灶，可能癌細(xì)胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實(shí)，一旦形成腫塊的同時(shí)，其它癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發(fā)灶后，其它器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，其實(shí)這時(shí)已經(jīng)是晚期診斷和晚期治療，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預(yù)防癌癥，已取得長足進(jìn)步。至今，我們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物(mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(癌癥病人、高危人群、正常對照)，對MICR0RNA-21與各種癌癥的早期預(yù)警進(jìn)行檢測分析。微小核糖核酸(microRNA/miRNA)是一段長度約為22核苷酸的寡核醣核酸分子， 它們可以藉由調(diào)控mRNA來抑制轉(zhuǎn)譯作用或是造成mRNA的降解來降低基因的表現(xiàn)。近來有許多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與癌癥具有高度的相關(guān)性。因此推論miRNA可能是癌化過程的一個(gè)導(dǎo)因。到目前為止，在人體上有超過700個(gè)miRNA被發(fā)現(xiàn)，而大約有100左右的miRNA被確認(rèn)與人類癌癥具有相關(guān)性，這其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、腦癌、肝癌、直腸結(jié)腸癌、 膠質(zhì)細(xì)胞瘤、垂體瘤等多種腫瘤在食道癌細(xì)胞中，miR-21在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、 結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等多惡性腫瘤中上調(diào)表達(dá)。PTEN是miR-21的主要靶基因，其產(chǎn)物是一種具有蛋白與脂質(zhì)磷酸酯酶活性的雙特異性磷酸酯酶，對磷脂酰肌醇_3、4、 5-三磷酸有特異性的3p位脫磷酸活性，該功能可使PTEN抑制PI!3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能，從而導(dǎo)致PTEN的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲相關(guān)。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)microRNA-21在各種癌癥患者、癌癥高危人群、正常對照人有明顯的表達(dá)量變化，將microRNA-21作為早期篩查各種癌癥變前期有非常重要的臨床診斷意義。MICR0RNA-21在各種癌癥變前期過程中高表達(dá)。他作于癌變前期篩查、及各種癌癥治療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)警也有非常重要的臨床意義。發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已病(發(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)癌前變的RNA水平，與癌癥早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預(yù)防性診治，爭取了腫瘤診治的時(shí)間和空間，達(dá)到預(yù)防癌癥。目前對MICR0RNA-21的研究都采用目前研究microRNA表達(dá)譜的常用技術(shù)主要有 Northern雜交、表達(dá)芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Solexa測序等高通量基因芯片分析技術(shù)，而這些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，而檢測RNA比DNA分析更科學(xué)(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性體現(xiàn))，比蛋白分析更可靠(RNA與蛋白轉(zhuǎn)錄有時(shí)候不同步)。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料MicroRNA-21的檢測技術(shù)及試劑盒未見報(bào)道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，設(shè)計(jì)了(癌癥患者、高危人群、正常對照)不同數(shù)據(jù)例組，用原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明以上癌癥病人MICR0RNA-21高表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá)15-2596，正常對照都是低表達(dá)。表明MICR0RNA-21各種癌癥變前期篩查的重要標(biāo)志物。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有咕、353、1251和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測的靶RNA是采用堿基互補(bǔ)(雜交互補(bǔ))的原理，同時(shí)經(jīng)過長時(shí)間研究和觀察，經(jīng)過嚴(yán)格的洗脫，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果沒有影響。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫(yī)學(xué)和生化指標(biāo)物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到預(yù)防性診治，將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測到癌前變RNA水平量化改變技術(shù)，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供癌前變RNA水平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的癌前變RNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床癌癥的診治爭取時(shí)間和空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與各種癌變前期篩查及治療后轉(zhuǎn)移早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的互補(bǔ)序列，序列號NR_(^9493. 1，MICR0RNA-21序列核苷酸序列長度是72bp，在染色體 17q23. 1"。
本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期MICR0RNA-21篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，對各種癌變前期篩查，及癌變后或術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散發(fā)生預(yù)警，進(jìn)一步配合臨床治療。本發(fā)明還提供一種MICR0RNA-21原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本來自各種癌癥患者、癌癥高危人群、健康正常人群。本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以 MICR0RNA-21為檢測對象，合成探針是MICR0RNA-21序列的反義互補(bǔ)序列，檢測的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供 MICR0RNA-21的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上RNA的表達(dá)量，正常人MICR0RNA-21低表達(dá)，即少量顯色，MICR0RNA-21在癌癥病人和正常對照有顯著差異，該基因的表達(dá)量比正常人表達(dá)量都高。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以MICR0RNA-21合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的RNA的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的 MICR0RNA-21表達(dá)量，用來確定各種癌癥病理演變前期的RNA變化量，預(yù)警各種癌變是否發(fā)生及各種癌癥患者治療后是否復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的預(yù)測。因?yàn)镸ICR0RNA-21在正常人中低表達(dá)，如果MICR0RNA-21表達(dá)量增高，說明有患癌的風(fēng)險(xiǎn)，說明癌變已發(fā)生，或癌癥病人術(shù)后已經(jīng)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，從而獲得癌癥的診斷信息。一個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測各種癌變發(fā)生和病理演變過程中MICR0RNA-21表達(dá)量的變化，預(yù)警各種癌癥發(fā)生、發(fā)展趨勢。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在RNA水平檢測MICR0RNA-21異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶復(fù)發(fā)之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集， 給臨床癌病患者一個(gè)真正的早期預(yù)警以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早預(yù)測。這樣才有可能實(shí)施癌癥的早期篩查、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治各種癌癥惡疾。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。


圖1是本發(fā)明MICR0RNA-21原位雜交技術(shù)流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中肝癌癌癥病人MICR0RNA-21表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中高危人群圖片。圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人MICR0RNA-21表達(dá)圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以MICR0RNA-21設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說明書，其中本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成___
權(quán)利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的互補(bǔ)序列。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種microRNA-21基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細(xì)胞標(biāo)本選自癌癥、高危人群、正常人標(biāo)本。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述標(biāo)本包括臨床上的各種癌癥的高危人群癌前病理演變過程，以及各種癌癥經(jīng)治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病理演變過程。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與各種癌癥早期病理演變有密切相關(guān)microRNA-21的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測microRNA-21表達(dá)量，比影像醫(yī)學(xué)和現(xiàn)有的臨床生化檢測指標(biāo)更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的癌變前期RNA水平篩查，同時(shí)，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102533976SQ20111041960
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者張?jiān)聘? 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:蘇州福英基因科技有限公司