專利名稱：一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及醫(yī)療、診斷用酶生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自然界中存在大量輔酶依賴酶類，黃素酶是比較重要的一類，在眾多的生物反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，如生物能量合成、氧化還原、生物發(fā)光、生物降解、染色體重構(gòu)、 DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)折疊、生物解毒作用、神經(jīng)發(fā)育、生物合成等。黃素酶類非常適用于使用生物催化的過程，具有較高的對映體及區(qū)域的選擇性，應(yīng)用潛力非常廣泛；其中，氧化酶類和單加氧酶類的研究最多，由于其底物和輔酶的高度特異性(包括對映體選擇性)， 在醫(yī)藥工業(yè)、精細(xì)化工和食品工業(yè)中有很大的應(yīng)用潛力(見表1)。表1黃素氧化酶類和單加氧酶類的特性及應(yīng)用
"P 実名稱，^jiSMffi.
黃素甘氨酸氧化 ^硫胺素(維生素Bi)的生化合成,
氧化_氨基以及D-氨基酸的脫氨基作用
職糖氧化纖維素、多糖的降解P — 己糖氧化Ifr1 生產(chǎn)乳酸。 乳糖氧化生產(chǎn)乳酸。 巰基氧化食品生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)或者肽段的 _氧化交聯(lián)》 _
L-色氨酸氧化抗腫瘤藥物rebeccamycm的生化合 _^_
芳香基-醇氧化多聚非飽和醇脫置反應(yīng)^
H00041膽固醇氧化B+ _體外診斷》·_
黃嘌呤氧化酶^_體外珍斷^_
mm 黃素羥基化■ (α迎家族)ρ芳苷族的底物特異性的反應(yīng)ρ
馳 B丑家族成員^_FM/FAD依賴型^_
氧· C丑家族成員^ 以FM為埔廣泛參與生物代謝途美 _@_
JD-Hydr oxyphenylac etaie擁有乙酰輔HaK置■的功能^
a-hydro^ylase (D亞家族成員)_
E丑家族成員^氧化苯乙烯及其衍生物,生產(chǎn)對應(yīng)
_的環(huán)氧化合物_
F 家族的成員-活化底物的定點(diǎn)氳化或溴化反應(yīng)過
程，用于抗生素、抗腫瘤藥物以及 _其他天然產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)和修飾^ 長期以來，硫酸銨沉淀、三氯乙酸沉淀、透析、凝膠層析等傳統(tǒng)方法被用于葡萄糖氧化酶、硫辛酰胺脫氫酶、乳酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、對苯二酚羥化酶等黃素酶的提取與制備；近二十年來，一些較為先進(jìn)的純化技術(shù)也被引入，如離子交換層析、 羥基磷灰石層析、共價(jià)層析、藍(lán)染料層析、金屬離子親和層析等?？傮w而言，黃素酶種類繁多，各自的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)各不相同，制備的方法也各不相同，整體制備步驟復(fù)雜且回收率較低。其中，金屬離子親和層析是基因工程菌表達(dá)重組蛋白酶純化的重要手段，但組氨酸標(biāo)簽的加入可能對目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重大影響。藍(lán)染料層析雖然對蛋白質(zhì)的吸附量比較大，但是藍(lán)染料分子本身具有較強(qiáng)的疏水性，非特異性吸附較強(qiáng)。因此，需要提供一種黃素酶親和介質(zhì)，其分離黃素酶快速簡單高效，回收效率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種黃素酶親和介質(zhì)及其合成和應(yīng)用，利用該黃素酶親和介質(zhì)可以大規(guī)?？焖俜蛛x純化黃素酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到黃素酶純品，蛋白和活性回收率較高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種黃素酶親和介質(zhì)，其特點(diǎn)是，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。較佳地，所述黃素酶親和配體是黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物，所述層析介質(zhì)是kpharose、殼聚糖、硅膠或陶瓷顆粒。更佳地，所述的黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物是乳清酸、胞嘧啶、7-氯異咯嗪或8-氯異咯嗪。較佳地，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺或1，4_ 丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述的黃素酶親和介質(zhì)的合成方法，其特點(diǎn)是， 將所述黃素酶親和配體和所述層析介質(zhì)進(jìn)行連接得到。較佳地，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺或1，4_ 丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用上述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特點(diǎn)是，將含有黃素酶的溶液流經(jīng)所述黃素酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶，從而純化黃素酶。較佳地，所述黃素酶是膽固醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶。較佳地，所述親和吸附的條件為pH值6. 5 7. 5，電導(dǎo)率為5-lOms/cm。較佳地，采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值6. 5 7. 5，電導(dǎo)率 5 IOms/cm。較佳地，用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶的洗脫條件為pH 值 2. 8。本發(fā)明的有益效果具體如下1、本發(fā)明通過采用黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物作為黃素酶親和配體，與層析介質(zhì)連接合成黃素酶親和介質(zhì)，可快速高效純化黃素酶，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用；2、本發(fā)明通過優(yōu)化蛋白質(zhì)吸附條件使得黃素酶的純化效率顯著增加，具有較大工業(yè)應(yīng)用潛力，體現(xiàn)出較大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是本發(fā)明的16種黃素酶親和介質(zhì)的間隔臂與親和配體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是圖1所示的16種黃素酶親和介質(zhì)在處理與大腸桿菌破碎液混合后的膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶溶液的特異性吸附結(jié)果SDS-PAGE電泳圖，其中A.泳道M 分子量marker ；泳道1 大腸桿菌破碎液；泳道2 膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品；泳道3 黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品；泳道4 膽固醇氧化酶與大腸桿菌破碎液混合物；泳道5 黃嘌呤氧化酶與大腸桿菌破碎液混合物；B.泳道M 分子量marker ；泳道1_4 =L-A-I至L_A_4吸附的膽固醇氧化酶；泳道 5-8 =L-B-I至L-B-4吸附的膽固醇氧化酶；泳道9_12 =L-C-I至L-C-4吸附的膽固醇氧化酶；泳道13-16 =L-D-I至L-D-4吸附的膽固醇氧化酶；C.泳道M 分子量marker ；泳道1_4 =L-A-I至L_A_4吸附的黃嘌呤氧化酶；泳道 5-8 =L-B-I至L-B-4吸附的黃嘌呤氧化酶；泳道9_12 =L-C-I至L-C-4吸附的黃嘌呤氧化酶；泳道13-16 =L-D-I至L-D-4吸附的黃嘌呤氧化酶。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。實(shí)施例1 :kphar0Se-乳清酸的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液PH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH 溶液，加入20ml乙二胺(或1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h，用去離子水清洗。乳清酸(2，4-dioxohexahydropyrimidine-5-carboxylic acid)與 50ml 活化緩沖液(0. 8M Na0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h后與介質(zhì)在0. IMNaOH溶液中30°C恒溫12h。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。依據(jù)乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四種不同的黃素酶親和介質(zhì)，分別命名為L-A-l，L-A-2，L-A-3，L-A-4。(1)介質(zhì)最大吸附量的確定確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0，分別加入 o.oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測定上清膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系見表2。(2)特異性吸附的驗(yàn)證考察該組介質(zhì)對膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶的特異性識別，分別取Img膽固醇氧化酶及2mg黃嘌呤氧化酶與20mg大腸桿菌破碎后提取蛋白(提取液采用20mM PBs, pH 7. 0)混合，與該組介質(zhì)進(jìn)行吸附使用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脫，測定酶活、含量并進(jìn)行電泳分析，見表3和圖2。蛋白含量測定使用Bradford法。膽固醇氧化酶活性測定3ml溶液A(42氨基2安替比林lmmol/L ；苯酚6mmol/CN 102513065 A說明書4/8 頁
L ；疊氮鈉0. 2g/L ；過氧化物酶:5000U/L ；磷酸鉀緩沖液:25mmol/L, pH 7. 5)，150 μ 1溶液 Β(膽固醇8. 26mg/ml ；Triton X-100 體積分?jǐn)?shù)4. 26%;異丙醇為溶劑),50 μ 1酶液，37°C 反應(yīng)5min，沸水浴3min，于500nm測吸光度。酶活(U/ml) = 1.6832XA500。酶活力單位定義37°C，lmin轉(zhuǎn)化Ιμπιο 膽固醇生成膽甾_4_烯_3_酮的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。黃嘌呤氧化酶活性測定檢測反應(yīng)顯色液4-氨基安替比林 (4-Aminoantipyrine, ΑΑΡ),Immo1/L ；苯酚(Phenic Acid, PA),6mmol/L ;50mmol/L Tris-HCL 緩沖液，50mmol/L ；疊氮鈉，0. 02% ；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)，7000U/L。在具塞試管中，依次加入3mL反應(yīng)顯色液，100 μ L黃嘌呤(Xanthine，XAN)溶液 (40mmol/L)，50 μ L黃嘌呤氧化酶(XOD)酶液(3200U/L)。混勻在37°C加熱20min，煮沸5min 終止反應(yīng)。以不加XOD反應(yīng)體系作為參比，測定UV-Vis譜(508nm)。實(shí)施例2 =Sepharose-胞嘧啶的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液PH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH 溶液，加入20ml乙二胺(或1，3-丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h，用去離子水清洗。胞嘧啶(Cytosine)與50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h后與介質(zhì)在0. IM NaOH溶液中30°C恒溫12h。 反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。依據(jù)乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四種不同的黃素酶親和介質(zhì)，分別命名為L-B-l，L-B-2, L-B-3, L-B-4。(1)介質(zhì)最大吸附量的確定確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0，分別加入 o.oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測定上清膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系見表2。(2)特異性吸附的驗(yàn)證考察該組介質(zhì)對膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶的特異性識別，分別取Img膽固醇氧化酶及2mg黃嘌呤氧化酶與20mg大腸桿菌破碎后提取蛋白(提取液用20mM PBs, pH 7. 0)混合，與該組介質(zhì)進(jìn)行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脫，采用與實(shí)施例1相同的方法測定酶活、含量并進(jìn)行電泳分析，見表3，圖2。實(shí)施例3 :Sepharose-7氯異咯嗪的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液PH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH溶液，加入20ml乙二胺(或1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h，用去離子水清洗。7 氯異咯嗪(7-chloroalloxazine)與 50ml 活化緩沖液(0. 8M Na0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h后與介質(zhì)在0. IM NaOH溶液中30°C恒溫12h。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。依據(jù)乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四種不同的黃素酶親和介質(zhì)，分別命名為L-C-l，L-C-2，L-C-3，L-C-4。(1)介質(zhì)最大吸附量的確定確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0，分別加入 o.oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測定上清膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系見表2。(2)特異性吸附的驗(yàn)證考察該組介質(zhì)對膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶的特異性識別，分別取Img膽固醇氧化酶及2mg黃嘌呤氧化酶與20mg大腸桿菌破碎后提取蛋白(提取液采用20mM PBs, pH 7. 0)混合，與該組介質(zhì)進(jìn)行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脫，采用與實(shí)施例1相同的方法測定酶活、含量并進(jìn)行電泳分析，見表3，圖2。實(shí)施例4 :Sepharose-8氯異咯嗪的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH, 20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液PH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH 溶液，加入20ml乙二胺(或1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺等溶液)，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h，用去離子水清洗。8 氯異咯嗪(8-chloroalloxazine)與 50ml 活化緩沖液(0. 8M Na0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/ml硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5h后與介質(zhì)在0. IM NaOH溶液中30°C恒溫12h。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。依據(jù)乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺及1，4_ 丁二胺溶液的不同，可以得到四種不同的黃素酶親和介質(zhì)，分別命名為L-D-l，L-D-2，L-D-3，L-D-4。(1)介質(zhì)最大吸附量的確定確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0，分別加入 o.oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測定上清膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系見表2。(2)特異性吸附的驗(yàn)證考察該組介質(zhì)對膽固醇氧化酶及黃嘌呤氧化酶的特異性識別，分別取Img膽固醇氧化酶及2mg黃嘌呤氧化酶與20mg大腸桿菌破碎后提取蛋白(提取液采用20mM PBs, pH 7. 0)混合，與該組介質(zhì)進(jìn)行吸附用pH 7. 0的20mM PBs清洗，最后用0. IM HAc洗脫，采用與實(shí)施例1相同的方法測定酶活、含量并進(jìn)行電泳分析，見表3，圖2。
權(quán)利要求
1.一種黃素酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃素酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述黃素酶親和配體是黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物，所述層析介質(zhì)是kpharose、殼聚糖、硅膠或陶瓷顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃素酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述的黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物是乳清酸、胞嘧啶、7-氯異咯嗪或8-氯異咯嗪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃素酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述黃素酶親和介質(zhì)由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3_丙二胺、2-羥基_1，3丙二胺或1， 4- 丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。
5 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃素酶親和介質(zhì)的合成方法，其特征在于，將所述黃素酶親和配體和所述層析介質(zhì)進(jìn)行連接得到。
6.一種利用根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特征在于，將含有黃素酶的溶液流經(jīng)所述黃素酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶，從而純化黃素酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特征在于，所述黃素酶是膽固醇氧化酶或黃嘌呤氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特征在于，所述親和吸附的條件為pH值6. 5 7. 5，電導(dǎo)率為5-lOms/cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特征在于，采用清洗液沖洗所述黃素酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值6. 5 7. 5，電導(dǎo)率5 lOms/cm。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃素酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化黃素酶的方法，其特征在于，用洗脫緩沖液洗脫所述黃素酶親和介質(zhì)上吸附的黃素酶的洗脫條件為PH值2. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃素酶親和介質(zhì)，由黃素酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。較佳地，黃素酶親和配體是黃素輔酶核心構(gòu)件異咯嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)類似物，層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖、硅膠或陶瓷顆粒；黃素酶親和配體和層析介質(zhì)通過環(huán)氧氯丙烷和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羥基-1，3丙二胺或1，4-丁二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。還提供了一種上述的黃素酶親和介質(zhì)的合成方法及使用方法，利用該黃素酶親和介質(zhì)可以大規(guī)?？焖俜蛛x純化黃素酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到黃素酶純品，蛋白和活性回收率較高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N9/04GK102513065SQ201110425508
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者仝艷軍, 張玉然, 張玲, 楊海麟, 辛瑜, 陳亦 申請人:江南大學(xué)