專利名稱：基于模型的qPCR的系統(tǒng)和方法
基于模型的qPCR的系統(tǒng)和方法引用的相關(guān)申請(qǐng)本發(fā)明要求2010年4月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/322，895號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在此將其通過(guò)引用整體并入。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀器使得對(duì)生物樣品中的DNA或RNA水平實(shí)施可靠定量變得可能。商業(yè)上可提供的PCR儀器，以及相關(guān)的數(shù)據(jù)獲取和分析軟件，可處理由生物樣品產(chǎn)生的qPCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)。這些系統(tǒng)通過(guò)計(jì)算閾值循環(huán)值(Ct或CkT)作為分級(jí)PCR循環(huán)數(shù)來(lái)報(bào)告定量結(jié)果，其中報(bào)告信號(hào)高于軟件自動(dòng)或人工手動(dòng)設(shè)定的閾值。確定的Ct值可用于估算DNA物質(zhì)的初始量。本領(lǐng)域已知的分析PCR擴(kuò)增曲線的各種方法都依賴，至少部分依賴定義一部分PCR擴(kuò)增曲線的線性指數(shù)范圍，以便確定樣品的循環(huán)閾值。由于使這些曲線模型化的復(fù)雜性，使用PCR擴(kuò)增曲線建模確定樣品循環(huán)閾值的方法難以成功運(yùn)用。PCR擴(kuò)增曲線的各種模型要求至少約15個(gè)參數(shù)或更多，以便使PCR擴(kuò)增曲線近似模型化。此外，擴(kuò)增曲線的起始和更后點(diǎn)可能對(duì)參數(shù)變化有噪音且不靈敏。發(fā)明概述在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，提供了確定PCR擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值的方法。該方法包括接收用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)生物樣品的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集包括多條擴(kuò)增曲線，每條擴(kuò)增曲線都與多個(gè)生物樣品中的一個(gè)生物樣品相關(guān)。該方法還包括實(shí)施非線性優(yōu)化，其包含每條擴(kuò)增曲線與其互補(bǔ)模型化擴(kuò)增曲線的擬合，以確定模型化效率曲線和相關(guān)擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集。模型化擴(kuò)增曲線是基于模型化效率曲線。該方法包括基于模型化效率曲線與模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系來(lái)確定每個(gè)生物樣品的循環(huán)閾值，在各種實(shí)施方式中，非線性優(yōu)化是約束非線性優(yōu)化。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是描述分析qPCR樣品擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式的流程圖。圖2是可用于樣品PCR擴(kuò)增的PCR儀器的框圖。圖3是可用于PCR儀器的控制和接口的示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的組件的框圖。圖4是根據(jù)基于模型qPCR的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式模型化效率和相關(guān)模型化標(biāo)度擴(kuò)增曲線以及實(shí)際擴(kuò)增曲線圖解示意圖。圖5是在基于模型qPCR的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式中改變Xffif參數(shù)的圖解示意圖。圖6是在基于模型qPCR的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式中改變a 參數(shù)的圖解示意圖。圖7是在基于模型qPCR的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式中改變X0，相對(duì)位移參數(shù)的圖解不意圖。圖8是在基于模型qPCR的系統(tǒng)和方法的多種實(shí)施方式中改變a J1和上升基線的圖解示意圖。圖9是針對(duì)非擴(kuò)增樣品的檢驗(yàn)而實(shí)施的多種實(shí)施方式的摘要表格。圖10是根據(jù)多種實(shí)施方式噪音標(biāo)準(zhǔn)化擴(kuò)增曲線振幅對(duì)用于各種擴(kuò)增和非擴(kuò)增曲線/孔的調(diào)整的Xffif值的圖解示意圖。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及分析多個(gè)生物樣品的PCR擴(kuò)增曲線的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方式。如MIQE指南(MIQE Guidelines)所述的，可通過(guò)文獻(xiàn)所述的各種可選方法(相關(guān)術(shù)語(yǔ))計(jì)算分級(jí)循環(huán)值。(Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, HuggettJ,Kubista M, Mueller R, Nolan T,Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer,CT: The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitativereal-time PGR experiments (MIQE指南實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的公開(kāi)最小信息)· Clin Chem2009, 55:61 1-622.)。根據(jù)MIQE推薦，本文件通常使用Cq表示分級(jí)qPCR循環(huán)值。然而，當(dāng)我們需要特別辨別基線閾值(Ct)和相對(duì)閾值(Ckt)方法時(shí)，會(huì)分別使用Ct和CKT。根據(jù)本發(fā)明系統(tǒng)和方法的各種實(shí)施方式，基于模型確定循環(huán)閾值利用反應(yīng)效率模型作為基礎(chǔ)，由此可建立模型擴(kuò)增曲線。對(duì)于各種實(shí)施方式，可實(shí)施擴(kuò)增模型的約束非線性優(yōu)化，以確定樣品擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集。然后各種實(shí)施方式可使用最佳擬合參數(shù)集來(lái)建立模型化效率曲線和模型化擴(kuò)增曲線，由此可確定循環(huán)閾值。根據(jù)各種實(shí)施方式，可選擇部分?jǐn)U增曲線并用于獲得約束非線性優(yōu)化擬合。對(duì)于各種實(shí)施方式，預(yù)處理數(shù)據(jù)可包括清理以消除例如隨機(jī)噪音，例如棘波，平滑以降低系統(tǒng)噪音，以及將每條擴(kuò)增曲線重新標(biāo)度成標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)度。在各種實(shí)施方式中，可對(duì)數(shù)據(jù)實(shí)施至少一種檢驗(yàn)以鑒別非擴(kuò)增樣品。根據(jù)各種實(shí)施方式，可以為針對(duì)每個(gè)生物樣品而確定的每一循環(huán)閾值指定特性值。圖1描述了具有步驟10-40的方法100，其是根據(jù)本發(fā)明的分析PCR擴(kuò)增曲線的方法和系統(tǒng)。方法100可通過(guò)圖3所描述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)實(shí)施。特別是，根據(jù)本文所述實(shí)施方式的方法可通過(guò)執(zhí)行存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器306中的計(jì)算機(jī)指令的處理器304來(lái)實(shí)施。對(duì)于圖1的步驟10，可接收PCR樣品擴(kuò)增曲線的數(shù)據(jù)集。方法和系統(tǒng)的各種實(shí)施方式可使用從試驗(yàn)所實(shí)施的全部多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中收集的PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集。這些信號(hào)可存儲(chǔ)在多種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中，并可在分析期間進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析或后分析，下文將具體討論。用于證實(shí)分析PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方式特性的一種試驗(yàn)類型，可使用TAQMAN 熒光探針試劑，并可使用FAM和VIC染料標(biāo)記。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，包含標(biāo)記探針試劑在內(nèi)的多種試驗(yàn)也可用于生成能根據(jù)本發(fā)明方法和系統(tǒng)各種實(shí)施方式進(jìn)行分析的數(shù)據(jù)。根據(jù)各種實(shí)施方式，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記探針”通常是指用于擴(kuò)增反應(yīng)的分子，通常是用于定量或?qū)崟r(shí)PCR分析，以及終點(diǎn)分析。這些標(biāo)記探針可用于監(jiān)測(cè)目標(biāo)多核苷酸的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增反應(yīng)中存在的寡核苷酸探針適合用于監(jiān)測(cè)與時(shí)間成函數(shù)的擴(kuò)增子生成量。這些寡核苷酸探針包括但不限于本文所述的5’-外切核酸酶試驗(yàn)TAQMAN 熒光探針(也可參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5，538，848)、多種莖-環(huán)分子信標(biāo)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利 Nos. 8，103，478 和 5，925，517 和 Tyagi and Kramer, 1996，NatureBiotechnology 14:303-308)、無(wú)莖或線性信標(biāo)(參加例如 WO 99/21881)、PNA MOLECULARBEACONS (參見(jiàn)例如美國(guó)專利Nos. 6，355，421和6，593，091)、線性PNA信標(biāo)(參見(jiàn)例如 Kubista et al.，2001，SPIE 4264:53-58)、非 FRET 探針(參見(jiàn)例如美國(guó)No. 6，150，097)，SUNRISE /AMPLI FLUOR⑩探針(美國(guó)專利 No. 6，548，250)、莖-環(huán)和雙螺旋 Scorpion 探針(Soiinas et al. , 2001, Nucleic Acids Research29:E96和美國(guó)專利No. 6，589，743)、凸環(huán)探針(美國(guó)專利No. 6，590，091)、偽結(jié)探針(美國(guó)專利 No. 6，589，250)、環(huán)狀子(美國(guó)專利 No. 6，383，752)、MGB ECLIPSE 探針(EpochBiosciences)、發(fā)夾探針(美國(guó)專利No. 6，596，490)、肽核酸(PNA)亮探針、自裝配微粒探針和二茂鐵修飾探針，如美國(guó)專利No. 6，485，901 ；Mhlanga et al. , 2001, Methods25:463-471;Whitcombe et al. , 1999, Nature Biotechnology. 17:804-807;isacsson et al. , 2000, Molecular Cell Probes. 14:321-328;Svanvik et al. , 2000, AnalBiochem.281:26-35;Wolffs et al.,2001,Biotechniques 766:769-771;Tsourkas etal.,2002,Nucleic Acids Research. 30:4208-4215;Riccelli et al. ,2002, NucleicAcids Research30:4088-4093;Zhang et al.,2002 Shangha1.34:329-332;MaxwelIet al. , 2002, J. Am. Chem. Soc. 124 : 9606-9612 ; Broude et al. , 2002, TrendsBiotechnol. 20:249-56;Huang et al. , 2002, Chem Res. Toxicol. 15:118-126;和 Yuet al. , 2001, J. Am. Chem. Soc 14:11155-11161所述。標(biāo)記探針也可以包含黑洞淬滅子(Biosearch)、Iowa Black (IDT)、QSY 萍滅子(Molecular Probes)和 Dabsyl 和 Dabcel 橫酸鹽/羧化物淬滅子。標(biāo)記探針也可包含兩個(gè)探針，其中例如熒光基團(tuán)位于一個(gè)探針上，而淬滅子位于另一個(gè)探針上，其中兩個(gè)探針與目標(biāo)雜交在一起淬滅信號(hào)，或其中與目標(biāo)雜交通過(guò)熒光變化改變信號(hào)標(biāo)記。標(biāo)記探針也可包含以磺酸基團(tuán)取代羧基的熒光素染料的磺酸鹽衍生物，亞磷酰胺形式的熒光素，亞磷酰胺形式的CY5 (例如可從Amersham獲得)。根據(jù)本發(fā)明用于分析PCR擴(kuò)增曲線的方法和系統(tǒng)的各種實(shí)施方式，可使用如圖2所示框圖描述的熱循環(huán)儀的多個(gè)實(shí)施方式。如圖2所示，熱循環(huán)儀可包括熱蓋214，其位于包含在樣品支持裝置中的多個(gè)樣品216上。在各種實(shí)施方式中，樣品支持裝置可以是具有多個(gè)樣品區(qū)的玻璃或塑料載片，該樣品區(qū)在樣品區(qū)和熱蓋214之間具有蓋。樣品支持裝置的一些實(shí)例可包括但不限于多孔板，例如標(biāo)準(zhǔn)微量滴定96孔板、384孔板，或微卡，或?qū)嵸|(zhì)平坦的支持物，例如玻璃或塑料載片。樣品支持裝置各種實(shí)施方式的樣品區(qū)可包括由凹陷、凹入、凸起和其組合，它們?cè)诨妆砻嫔闲纬傻囊?guī)則或不規(guī)則排列的陣列。在熱循環(huán)儀的各種實(shí)施方式中，包括樣品塊218、加熱和冷卻的元件220和熱交換器222。圖2中，熱循環(huán)系統(tǒng)200的各種實(shí)施方式提供了在試驗(yàn)實(shí)施的全部擴(kuò)增循環(huán)數(shù)中可實(shí)時(shí)獲取多個(gè)生物樣品中的每個(gè)樣品信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)可具有發(fā)射電磁能的照明光源，和檢測(cè)器或成像器210，其用于接收來(lái)自樣品支持裝置中樣品216的電磁能?？刂葡到y(tǒng)224可用于控制檢測(cè)、熱蓋和熱塊組裝的功能。終端用戶可通過(guò)熱循環(huán)儀200的用戶接口 226進(jìn)入控制系統(tǒng)。如圖3所述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可用于控制熱循環(huán)儀的功能，以及用戶接口功能。此外，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可提供數(shù)據(jù)處理、顯示和報(bào)告制作功能。所有這些儀器控制功能可專用于本地?zé)嵫h(huán)儀，或計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可提供部分或全部控制，分析和報(bào)告功能的遠(yuǎn)程控制，下文將具體討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知各種實(shí)施方式的操作都可使用硬件、軟件、固件或其適當(dāng)組合來(lái)執(zhí)行。例如，可使用在軟件、固件或硬連線邏輯電路(logic)的控制下的處理器或其他數(shù)字電路系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行一些處理。(本文中術(shù)語(yǔ)“邏輯電路”是指固定硬件、程序控制的邏輯電路和/或其適當(dāng)組合，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知如何組合以執(zhí)行所列功能)。軟件和固件可存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中?？墒褂妙愃齐娐穲?zhí)行一些其他處理，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的。此外，存儲(chǔ)器或其他存儲(chǔ)器，以及通信部件可用于本發(fā)明實(shí)施方式中。圖3是說(shuō)明在圖2熱循環(huán)儀系統(tǒng)200的實(shí)施方式的基礎(chǔ)上根據(jù)各種實(shí)施方式可以用于執(zhí)行處理功能的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300的框圖。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可包括一個(gè)或多個(gè)處理器，例如處理器304。處理器304可采用普通或特定目的的處理裝置例如微處理器、控制器或其他控制邏輯電路執(zhí)行。在該實(shí)例中，處理器304與總線302或其他通信介質(zhì)相連。而且，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到圖3的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可具體成任意多種形式，例如架裝計(jì)算機(jī)、主機(jī)、超級(jí)計(jì)算機(jī)、服務(wù)器、客戶端、臺(tái)式計(jì)算機(jī)、便攜計(jì)算機(jī)、本式計(jì)算機(jī)、手持計(jì)算機(jī)裝置(如PDA、手機(jī)、智能電話、掌上電腦等)、群集網(wǎng)格、上網(wǎng)本、嵌入式系統(tǒng)或任何其他類型的特定或普通目的計(jì)算機(jī)裝置，只要對(duì)于給定應(yīng)用或環(huán)境是理想的或適宜的。此外，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可包括常規(guī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其包括客戶端/服務(wù)器環(huán)境和一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)服務(wù)器，或LIS/LIMS基本結(jié)構(gòu)的集成。多種常規(guī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包括局域網(wǎng)(LAN)或廣域網(wǎng)(WAN)，包括無(wú)線和/或有線部件，都是本領(lǐng)域已知的。此外，客戶端/服務(wù)器環(huán)境、數(shù)據(jù)庫(kù)服務(wù)器和網(wǎng)絡(luò)在本領(lǐng)域中有很詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道。。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可包括總線302或用于信息通訊的其他通信機(jī)制，和用于處理信息的與總線302相連的處理器304。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300也包括存儲(chǔ)器306，其可以是隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)或其他動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)器，其與總線302相連用于存儲(chǔ)由處理器304執(zhí)行的指令。存儲(chǔ)器306也可用于在存儲(chǔ)處理器304執(zhí)行指令期間存儲(chǔ)臨時(shí)變量或其他中間信息。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300還包括只讀存儲(chǔ)器(ROM) 308或與總線302相連的其他靜態(tài)存儲(chǔ)器，用于存儲(chǔ)處理器304的靜態(tài)信息和指令。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300也可包括存儲(chǔ)裝置310，例如磁盤、光盤或固態(tài)驅(qū)動(dòng)器(SSD)，并與總線302相連用于存儲(chǔ)信息和指令。存儲(chǔ)裝置310可包括介質(zhì)驅(qū)動(dòng)器和可移除的存儲(chǔ)接口。介質(zhì)驅(qū)動(dòng)器可包括支持固定的或可移除的存儲(chǔ)介質(zhì)的驅(qū)動(dòng)器或其他機(jī)制，例如硬盤驅(qū)動(dòng)器、軟盤驅(qū)動(dòng)器、磁帶驅(qū)動(dòng)器、光盤驅(qū)動(dòng)器、CD或DVD驅(qū)動(dòng)器(R或RVV)、閃存驅(qū)動(dòng)器或其他可移除或固定介質(zhì)驅(qū)動(dòng)器。如示例所解釋的，存儲(chǔ)介質(zhì)可包括其中存儲(chǔ)了特定計(jì)算機(jī)軟件、指令或數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。在可選實(shí)施方式中，存儲(chǔ)裝置310可包括用于實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)程序或其他指令或數(shù)據(jù)裝載至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300中的其他類似部件。這種部件可包括例如可移除的存儲(chǔ)單元和接口，例如程序盒和盒接口、可移除的存儲(chǔ)器(例如閃速存儲(chǔ)器或其他可移除的存儲(chǔ)器模塊)和存儲(chǔ)器插槽，和可實(shí)現(xiàn)將軟件和數(shù)據(jù)從存儲(chǔ)裝置310轉(zhuǎn)移至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300的其他可移除的存儲(chǔ)單元和接口。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300也可包括通信接口 318。通信接口 318可用于實(shí)現(xiàn)軟件和數(shù)據(jù)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300與外部裝置之間的轉(zhuǎn)移。通信接口 318的實(shí)例可包括調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口(例如以太網(wǎng)或其他NIC卡)、通信端口(例如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和卡、藍(lán)牙等。通過(guò)通信接口 318轉(zhuǎn)移的軟件和數(shù)據(jù)采用信號(hào)形式，其可以是電子、電磁、光學(xué)或能被通信接口 318接收的其他信號(hào)。這些信號(hào)可通過(guò)通路例如無(wú)線介質(zhì)、導(dǎo)線或電纜、光纖或其他通信介質(zhì)傳送并被通信接口 318接收。通路的一些示例報(bào)刊電話線、手機(jī)聯(lián)接和RF聯(lián)接、網(wǎng)絡(luò)接口、局域或廣域網(wǎng)和其他通信通路。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300可通過(guò)總線302與顯示器312相連，例如陰極射線管(CRT)或液晶顯示器(LCD)，用于向計(jì)算機(jī)用戶顯示信息。輸入裝置314包括字母數(shù)字和其他電鑰與總線302相連，用于向處理器304傳達(dá)信息和命令選擇。輸入裝置也可以是配有觸屏輸入功能的顯示器，例如IXD顯示器。其他類型的用戶輸入裝置有光標(biāo)控制316，例如鼠標(biāo)、軌跡球或光標(biāo)方向鍵，用于向處理器304傳達(dá)方向信息和命令選擇和控制光標(biāo)在顯不器312上的運(yùn)動(dòng)。該輸入裝置通常在兩個(gè)軸上具有兩個(gè)自由度，第一軸(如X)和第二軸(如y)，這可實(shí)現(xiàn)裝置到平面內(nèi)的指定位置。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300提供了數(shù)據(jù)處理，并提供了這些數(shù)據(jù)的可信度。與本發(fā)明實(shí)施方式的某些執(zhí)行方式一致，數(shù)據(jù)處理和可信值是由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300響應(yīng)執(zhí)行包含在存儲(chǔ)器306內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)序列的一個(gè)或多個(gè)指令的處理器304來(lái)提供的。這些指令可從另一計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)例如存儲(chǔ)裝置310，讀取至存儲(chǔ)器306。執(zhí)行包含在存儲(chǔ)器306中的指令序列可使處理器304實(shí)施本文所述的處理狀態(tài)?？蛇x地，硬連線電路可用于取代軟件指令或與其結(jié)合以執(zhí)行本發(fā)明的實(shí)施方式。因而執(zhí)行本發(fā)明實(shí)施方式不限于硬件電路和軟件的任何特定組合。本文所述的術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”和“計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品”通常是指與向處理器304提供一個(gè)或多個(gè)序列或一個(gè)或多個(gè)指令用于執(zhí)行的任何介質(zhì)。這些指令通常稱為“計(jì)算機(jī)程序代碼”(可歸于計(jì)算機(jī)程序的形式或其他類型)，若被執(zhí)行，能夠使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式的特性或功能。這類以及其他形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可采取多種形式，包括但不限于不揮發(fā)介質(zhì)、可揮發(fā)介質(zhì)和傳送介質(zhì)。不揮發(fā)介質(zhì)包括例如固態(tài)光盤或磁盤，例如存儲(chǔ)裝置310?？蓳]發(fā)介質(zhì)包括動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)器，例如存儲(chǔ)器306。傳送介質(zhì)包括同軸電纜、銅線和光纖，包括含有總線302的線。常見(jiàn)形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括例如軟盤(floopy disk)、軟盤(flexibledisk)、硬盤、磁帶或任何其他磁介質(zhì)、CD-ROM、任何其他光學(xué)介質(zhì)、穿孔卡、紙帶、具有洞模式的任何其他物理介質(zhì)、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPR0M、任何其他存儲(chǔ)條或盒、下文所述的載波或計(jì)算機(jī)可讀取的任何其他介質(zhì)。多種形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可用于攜帶一個(gè)或多個(gè)序列的一個(gè)或多個(gè)指令至處理器304用于執(zhí)行。例如，指令最初可攜帶在遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)的磁盤上。遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)可將指令下載至其動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)器中并使用調(diào)制解調(diào)器通過(guò)電話線送出指令。定位至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)300的調(diào)制解調(diào)器可接收電話線上的數(shù)據(jù)并使用紅外變送器將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成紅外信號(hào)。與總線302相連的紅外檢測(cè)器可接收紅外信號(hào)所攜帶的數(shù)據(jù)并將數(shù)據(jù)置于總線302上?？偩€302攜帶數(shù)據(jù)至存儲(chǔ)器306，由此處理器304取回并執(zhí)行指令。在處理器304執(zhí)行之前或之后，存儲(chǔ)器306接收的指令可任選地存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置310中。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，為闡述清楚，以上敘述參照了不同功能單元和處理器來(lái)描述本發(fā)明的實(shí)施方式。然而，顯而易見(jiàn)的是在不偏離本發(fā)明的情況下可在不同功能單元，處理器或結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行任何適宜的功能分配。例如，示意由獨(dú)立處理器或控制器所實(shí)施的功能可由相同處理器或控制器實(shí)施。因此，提及特定功能單元僅視為提到用于提供所述功能的適宜方式，而非表示嚴(yán)格的邏輯或物理結(jié)構(gòu)或組織。在一些實(shí)施方式中，可進(jìn)行多個(gè)樣品擴(kuò)增曲線中每條的預(yù)處理。這種預(yù)處理可以用于清除、降低和其他減輕PCR擴(kuò)增曲線中可干擾數(shù)據(jù)分析步驟中數(shù)據(jù)有效處理的不利特性的影響。在方法和系統(tǒng)的各種實(shí)施方式中，預(yù)處理數(shù)據(jù)可使用多種預(yù)處理方法來(lái)清除，例如，棘波、陷波和噪音。根據(jù)各種實(shí)施方式，可使用多種方法清理PCR擴(kuò)增曲線用于棘波和陷波過(guò)濾。在各種實(shí)施方式中，平滑PCR擴(kuò)增曲線可減少噪音。對(duì)于各種實(shí)施方式，可使用窗口平滑功能完成平滑，其可利用本領(lǐng)域已知的任意多個(gè)平滑窗口。根據(jù)各種實(shí)施方式，重新標(biāo)度PCR擴(kuò)增曲線可將多條曲線調(diào)整至常用標(biāo)度，在各種實(shí)施方式中，樣品PCR擴(kuò)增曲線可標(biāo)度在0-1區(qū)域。參照?qǐng)D1的步驟20，對(duì)于本發(fā)明所述的用于分析PCR擴(kuò)增曲線的各種方法和系統(tǒng)，實(shí)時(shí)RT-PCR效率的分析表達(dá)式可提供使PCR擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)模型化的基礎(chǔ)。對(duì)于各種實(shí)施方式，實(shí)時(shí)RT-PCR效率的三參數(shù)分析表達(dá)式可提供使PCR擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)模型化的基礎(chǔ)。在各種實(shí)施方式中，3個(gè)參數(shù)可包括曲線位移參數(shù)、曲線彎曲參數(shù)和曲線位移調(diào)整參數(shù)。效率表達(dá)式可用于在循環(huán)乘循環(huán)的基礎(chǔ)上迭代地遞歸地生成PCR擴(kuò)增曲線，其中由此生成的擴(kuò)增曲線具有確定的基線。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式，可在效率模型的各種實(shí)施方式基礎(chǔ)上建立PCR擴(kuò)增曲線的相應(yīng)模型。這表示在循環(huán)乘循環(huán)基礎(chǔ)上可基于PCR效率曲線的顯式模型使PCR擴(kuò)增曲線進(jìn)行隱式模型化。在此方法中，生成擬合大部分?jǐn)?shù)據(jù)的模型曲線，只需要更少的參數(shù)，從而使得更易于實(shí)施約束優(yōu)化。對(duì)于基于效率模型的擴(kuò)增曲線模型的各種實(shí)施方式，可添加定義模型的其他參數(shù)，在各種實(shí)施方式中，5-參數(shù)擴(kuò)增曲線模型可包括擴(kuò)增曲線基線的斜率參數(shù)和相對(duì)擴(kuò)增參數(shù)。在各種實(shí)施方式中，可采用約束非線性優(yōu)化，其中可為每條擴(kuò)增曲線確定用于擴(kuò)增曲線模型的最佳擬合參數(shù)集。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到實(shí)施方 式不限于3個(gè)或5個(gè)參數(shù)。例如，根據(jù)一些實(shí)施方式，可采用4個(gè)或更多參數(shù)使效率曲線或擴(kuò)增曲線模型化。如圖1的步驟20所描述的，參照?qǐng)D4，對(duì)于本發(fā)明系統(tǒng)和方法的各種實(shí)施方式，一旦每個(gè)樣品擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集確定后，就可建立模型化效率曲線和模型化擴(kuò)增曲線。在圖4中，曲線I是模型化效率曲線，曲線II是樣品擴(kuò)增曲線，而曲線III是模型化擴(kuò)增曲線。使用5參數(shù)擴(kuò)增曲線模型的方法和系統(tǒng)的各種實(shí)施方式可提供模型化擴(kuò)增曲線與樣品擴(kuò)增曲線的最接近擬合，如繪圖1V所述(其顯示了曲線III和曲線II之間的10倍差異)。作為擬合量度，可為多個(gè)曲線交叉點(diǎn)中的每個(gè)點(diǎn)生成樣品擴(kuò)增曲線和模型化擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)之間的剩余差異的表達(dá)式。對(duì)于圖1V，這種擬合量度是圖形顯示的，其中剩余可乘以因數(shù)10以觀察曲線II和III交叉剩余。在第η個(gè)離散(分級(jí))循環(huán)步驟中的效率η Λ x，被假定成平滑單調(diào)減少函數(shù)，通常(但不是必須)從I開(kāi)始(對(duì)于分級(jí)循環(huán)步驟n=l)并趨于O (對(duì)于循環(huán)步驟η=⑴)。因此由Λ X給出循環(huán)步驟大小離散度。注意，在通常情況中，若Λ X是1，則ηΛ χ變成第η個(gè)循環(huán)。在各種實(shí)施方式中，根據(jù)熒光曲線位移參數(shù)(Xffif)熒光曲線彎曲參數(shù)(a 以及位移調(diào)整參數(shù)(Xtl)使效率模型化。根據(jù)圖1的系統(tǒng)和方法的各種實(shí)施方式，可給出如下步驟20，3參數(shù)效率模型
權(quán)利要求
1.確定PCR擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值的方法，所述方法包括 接收用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)生物樣品的數(shù)據(jù)集，其中所述數(shù)據(jù)集包括多條擴(kuò)增曲線，每條擴(kuò)增曲線都與所述多個(gè)生物樣品中的一個(gè)生物樣品相關(guān)； 實(shí)施非線性優(yōu)化，其包含每條擴(kuò)增曲線與模型化擴(kuò)增曲線的擬合，以確定模型化效率曲線和所述擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集，其中所述模型化擴(kuò)增曲線基于模型化效率曲線；以及 基于所述模型化效率曲線與所述模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系確定每個(gè)生物樣品的循環(huán)閾值。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非線性優(yōu)化是約束非線性優(yōu)化。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括 基于最佳擬合參數(shù)集生成所述模型化效率曲線；以及 基于所述模型化效率曲線生成相關(guān)的擴(kuò)增曲線。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使所述模型化效率曲線顯式模型化，而使模型擴(kuò)增曲線基于所述顯式模型化效率曲線隱式模型化。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中確定所述循環(huán)閾值基于預(yù)定的效率參數(shù)值。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括鑒別非擴(kuò)增樣品。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述鑒別非擴(kuò)增樣品包括實(shí)施選自以下的檢驗(yàn)閾值擴(kuò)增、模型曲線擬合、噪音閾值、最大循環(huán)、最小循環(huán)、終點(diǎn)擴(kuò)增、模型效率閾值、最小噪音、相對(duì)噪音、相對(duì)標(biāo)度或跌落。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括 基于所述最佳擬合參數(shù)集生成基線模型擴(kuò)增曲線，其中所述循環(huán)閾值確定基于所述基線模型擴(kuò)增曲線與對(duì)應(yīng)的效率曲線之間的互補(bǔ)關(guān)系。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述模型化效率曲線的最佳擬合參數(shù)集包括三個(gè)參數(shù)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述三個(gè)最佳擬合參數(shù)集是曲線位移參數(shù)、曲線彎曲參數(shù)和曲線位移調(diào)整參數(shù)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括基于所述模型化效率曲線與所述模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系生成超出最大PCR循環(huán)數(shù)的估計(jì)Cq的設(shè)定。
12.由處理器可執(zhí)行的指令編碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，用于確定PCR擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，所述指令包括以下指令 接收用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)生物樣品的數(shù)據(jù)集，其中所述數(shù)據(jù)集包括多條擴(kuò)增曲線，每條擴(kuò)增曲線都與所述多個(gè)生物樣品中的一個(gè)生物樣品相關(guān)； 實(shí)施非線性優(yōu)化，其包含每條擴(kuò)增曲線與模型化擴(kuò)增曲線的擬合，以確定模型化效率曲線和所述擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集，其中所述模型化擴(kuò)增曲線基于模型化效率曲線；以及 基于所述模型化效率曲線與所述模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系確定每個(gè)生物樣品的循環(huán)閾值。
13.如權(quán)利要求12所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述非線性優(yōu)化是約束非線性優(yōu)化。
14.如權(quán)利要求12所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述指令還包括以下指令基于最佳擬合參數(shù)集生成所述模型化效率曲線；以及 基于所述模型化效率曲線生成相關(guān)的擴(kuò)增曲線。
15.如權(quán)利要求12所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中使所述模型化效率曲線顯式模型化，而使所述模型化擴(kuò)增曲線基于所述顯式模型效率曲線隱式模型化。
16.如權(quán)利要求15所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中確定所述循環(huán)閾值基于預(yù)定的效率參數(shù)值。
17.如權(quán)利要求12所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述指令還包括鑒別非擴(kuò)增樣品的指令。
18.如權(quán)利要求17所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述鑒別非擴(kuò)增樣品包括實(shí)施選自以下的檢驗(yàn)閾值擴(kuò)增、模型曲線擬合、噪音閾值、最大循環(huán)、最小循環(huán)、終點(diǎn)擴(kuò)增、模型效率閾值、最小噪音、相對(duì)噪音、相對(duì)標(biāo)度或跌落。
19.如權(quán)利要求12所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中所述指令還包括以下指令 基于所述最佳擬合參數(shù)集生成基線模型擴(kuò)增曲線，其中所述循環(huán)閾值確定基于所述基線模型擴(kuò)增曲線與對(duì)應(yīng)的效率曲線之間的互補(bǔ)關(guān)系。
20.確定PCR擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 處理器；以及 存儲(chǔ)所述處理器可執(zhí)行指令的存儲(chǔ)器，所述指令包含以下指令 接收用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)生物樣品的數(shù)據(jù)集，其中所述數(shù)據(jù)集包括多條擴(kuò)增曲線，每條擴(kuò)增曲線都與所述多個(gè)生物樣品中的一個(gè)生物樣品相關(guān)； 實(shí)施非線性優(yōu)化，其包含每條擴(kuò)增曲線與模型化擴(kuò)增曲線的擬合，以確定模型化效率曲線和擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集，其中所述模型化擴(kuò)增曲線基于模型化效率曲線；以及基于所述模型化效率曲線與所述模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系確定每個(gè)生物樣品的循環(huán)閾值。
21.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述非線性優(yōu)化是約束非線性優(yōu)化。
22.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述存儲(chǔ)器還存儲(chǔ)以下指令 基于所述最佳擬合參數(shù)集生成模型化效率曲線；以及 基于模型化效率曲線生成相關(guān)的擴(kuò)增曲線。
23.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中使所述模型效率曲線顯式模型化，而使所述模型化擴(kuò)增曲線基于所述顯式模型效率曲線隱式模型化。
24.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中確定所述循環(huán)閾值基于預(yù)定的效率參數(shù)值。
25.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述存儲(chǔ)器還存儲(chǔ)鑒別非擴(kuò)增樣品的指令。
26.如權(quán)利要求25所述的系統(tǒng)，其中所述鑒別非擴(kuò)增樣品包括實(shí)施選自以下的檢驗(yàn)閾值擴(kuò)增、模型曲線擬合、噪音閾值、最大循環(huán)、最小循環(huán)、終點(diǎn)擴(kuò)增、模型效率閾值、最小噪音、相對(duì)噪音、相對(duì)標(biāo)度或跌落。
27.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述存儲(chǔ)器還存儲(chǔ)以下指令 基于所述最佳擬合參數(shù)集生成基線模型擴(kuò)增曲線，其中所述循環(huán)閾值確定基于所述基線模型擴(kuò)增曲線與對(duì)應(yīng)的效率曲線之間的互補(bǔ)關(guān)系。
28.如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述模型效率曲線的最佳擬合參數(shù)集包括三個(gè)參數(shù)。
29.如權(quán)利要求28所述的系統(tǒng)，其中所述三個(gè)最佳擬合參數(shù)集是曲線位移參數(shù)、曲線彎曲參數(shù)和曲線位移調(diào)整參數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了確定PCR擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值的方法。該方法包括接收用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的多個(gè)生物樣品的數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集包括多條擴(kuò)增曲線，每條擴(kuò)增曲線都與多個(gè)生物樣品中的一個(gè)生物樣品相關(guān)。該方法還包括實(shí)施非線性優(yōu)化，其包含每條擴(kuò)增曲線與其互補(bǔ)模型化擴(kuò)增曲線的擬合以確定模型化效率曲線和相關(guān)擴(kuò)增曲線的最佳擬合參數(shù)集。模型化擴(kuò)增曲線基于模型效率曲線。該方法包括基于模型化效率曲線與模型化擴(kuò)增曲線的互補(bǔ)關(guān)系確定每個(gè)生物樣品的循環(huán)閾值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103038774SQ201180027423
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月11日
發(fā)明者華萊士·R·喬治 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司