專利名稱：用于檢測和定量寬范圍分析物的個人葡萄糖計的制作方法
技術領域：
本申請涉及傳感器、包括該傳感器的試劑盒以及制造和使用該傳感器的方法。所述傳感器允許檢測寬范圍的靶因子，例如核酸(例如DNA和RNA)、蛋白質、毒素、病原體、細胞和金屬，并且可以與隨時可用的個人葡萄糖計組合使用。政府資助本發(fā)明是在美國能源部給予的DE-FG02-08ER64568、美國國立衛(wèi)生研究院給予的ES16865和美國國立科學基金會給予的CTS-0120978政府資助下完成的。美國政府享有本發(fā)明的某些權利。
背景技術：
用于定量的便攜且價廉的傳感器的開發(fā)可以使目前的傳感技術在檢測對人健康和環(huán)境有重要影響的物質中實現(xiàn)現(xiàn)場和即時應用卜7。其還可以進一步產生家用和個人傳感器，用于與日常生活和健康相關的分析物。這種成功的實例之一是葡萄糖計，其已經作為血葡萄糖的常規(guī)傳感器市售近30年，并被證明是監(jiān)控糖尿病或低血糖的重要器件8’9。所述個人葡萄糖計(PGM)以其公眾廣泛可用、口袋大小的便攜性、低成本、定量結果可靠和操作簡單的優(yōu)勢而眾所周知。因此，其在個人健康護理中廣泛應用并提供巨大且增長的市場。PGM可以從商業(yè)來源容易且廉價地獲得，并且已經被整合到移動電話中，例如iPhone和LG模 式。盡管PGM是成功的，但是開發(fā)可以檢測除葡萄糖外的多種分析物且還顯示出葡萄糖計優(yōu)勢——廣泛可用性、便攜性、低成本和定量分析——的傳感器系統(tǒng)，仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。最近幾年，已經開發(fā)了使用光譜學3_6、電化學1A磁共振7和其他分析技術的可以高選擇性和高靈敏度地定量檢測多種分析物的傳感器。雖然這些傳感技術中的一部分使用簡單的儀器，但是大多數仍然需要實驗室開發(fā)的便攜裝置，這對公眾來說是不廣泛的且不是市售的。也開發(fā)了通過可見的顏色改變來簡單和現(xiàn)場地檢測多種分析物的比色傳感器1(1_13，因此不需要儀器。但是，這些傳感器是定性的或半定量的，因此不能提供定量結果。

發(fā)明內容
本申請公開了可以用于檢測靶因子的傳感器和制造所述傳感器的方法。在一個實例中，所述傳感器包括固體支持物，例如珠或膜。允許檢測所述靶因子的識別分子結合或固定在所述固體支持物上。在存在所述靶因子下所述識別分子可特異性結合所述靶因子，但是不顯著結合其他因子。這種識別分子的實例包括抗體、核酸分子(例如DNA、RNA、包括核酶/脫氧核酶的功能性核酸和適體)、肽核酸、聚合物、肽和蛋白質、細胞以及有機小分子。
所述傳感器還可以包括可以催化物質(例如蔗糖、纖維素、海藻糖、淀粉或麥芽糖)轉化為葡萄糖的酶。在一個實例中，所述酶例如作為可以結合所述識別分子的酶分析物類似物綴合物的一部分附著到可檢測所述靶因子的識別分子上，使得在存在所述靶因子下，所述酶從所述固體支持物釋放(例如，由于與所述靶因子的競爭，所述酶分析物類似物綴合物可以被釋放)，然后可以催化物質(例如蔗糖、纖維素、海藻糖、淀粉或麥芽糖)轉化為可以被檢測的葡萄糖(例如使用個人葡萄糖計)。在另一個實例中，所述靶因子可結合所述識別分子，所述酶分析物類似物綴合物結合已經結合所述識別分子的靶因子，從而形成“夾心”。因此，在存在所述靶因子下，結合所述靶因子的酶可以催化物質(例如蔗糖、纖維素、海藻糖、淀粉或麥芽糖)轉化為可以被檢測的葡萄糖(例如使用個人葡萄糖計，PGM)在一個實例中，所公開的傳感器是 橫流裝置的一部分。所述橫流裝置可以包括樣品或芯吸墊(其可與所述樣品接觸)、包含所述傳感器的綴合墊(conjugation pad)、包含可被轉化為葡萄糖的物質(例如蔗糖)的膜和吸收墊(通過毛細管作用吸引所述樣品穿過所述綴合墊和膜，并收集所述樣品以及產生的葡萄糖)。例如，所述橫流裝置可以與所述樣品接觸，隨后與葡萄糖計接觸以檢測所述樣品中靶因子的存在情況，其中所述樣品中靶的存在情況由對葡萄糖的檢測指示。本公開還提供了包括所公開的傳感器和橫流裝置的試劑盒。例如，該試劑盒還可以包括一種或多種緩沖液、將檢測的葡萄糖水平與存在的靶因子量關聯(lián)的圖表或可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質(例如蔗糖、海藻糖、纖維素、麥芽糖或淀粉)。還提供了使用所公開的傳感器檢測靶因子的方法。在一個實例中，所述方法包括使一個或多個傳感器與樣品(例如生物樣品或環(huán)境樣品)在足以使所述樣品中靶因子結合所述識別分子的條件下接觸。在某些實例中，所述結合可釋放之前已結合所述識別分子的酶(例如酶分析物類似物綴合物)。隨后，所述固體支持物與所述釋放的酶分離。所釋放的酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質接觸，從而生成葡萄糖。檢測所述生成的葡萄糖(例如使用PGM)，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子。所述方法還可以包括對所述靶因子進行定量，其中檢測到的葡萄糖水平指示存在的祀因子量(例如相對量或絕對量)。在其他實例中，在靶因子結合所述識別分子后，所述酶與所述靶因子-識別分子-固體基質復合物在允許所述酶(例如酶分析物類似物綴合物)結合所述靶因子的條件下接觸，從而形成“夾心”型結構。然后，所結合的酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質(例如酶的底物)接觸，從而生成葡萄糖。檢測所生成的葡萄糖(例如使用PGM)，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子。所述方法還可以包括對所述靶因子進行定量，其中檢測到的葡萄糖水平指示存在的靶因子量(例如相對量或絕對量)。在另一些實例中，所述方法可以包括使具有傳感器的橫流裝置與樣品在足以使所述樣品中靶因子流過所述橫流裝置并結合存在于所述橫流裝置上的識別分子的條件下接觸。所述識別分子可以綴合于可催化物質轉化為葡萄糖的酶。這導致靶因子-識別分子或靶因子-識別分子-酶復合物的形成，其中所述復合物的形成導致可將物質轉化為葡萄糖的所述酶的釋放。使所述酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質相互作用，從而生成葡萄糖。檢測(例如定量)所產生的葡萄糖，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子?？梢杂帽疚奶峁┑乃龉_的傳感器和方法檢測的示例性靶因子包括金屬、營養(yǎng)金屬離子(例如鈣、鐵、鈷、鎂、錳、鑰、鋅、鎘或銅)、微生物、細胞因子、激素、細胞(例如腫瘤細胞)、DNA、RNA、孢子(例如炭疽孢子)或毒素。例如，所述靶因子可以是重金屬，例如汞(Hg)、鎘(Cd)、砷(As)、鉻(Cr)、鉈(Tl)、鈾(U)、钚(Pu)或鉛(Pb)。在其他實例中，所述靶因子為微生物，例如病毒、細菌、真菌或原生動物(例如微生物抗原或核酸分子如DNA或RNA)。在一個實例中，所述靶因子為孢子，例如細菌孢子、真菌孢子或植物孢子。例如，桿菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)(例如肉毒梭菌(C. botulinum)、產氣莢膜梭菌(C. perfringens)、臘樣芽孢桿菌(B. cereus)和炭疽芽孢桿菌(B. anthracis))可產生可被檢測到的孢子。本公開前述的和其他的對象和特征在以下的詳細描述中會更清楚，詳細描述參照 附圖進行。


圖1A和IB的示意圖示出了，基于識別分子A和識別分子B和靶因子(分析物)之間的相互作用使用葡萄糖計進行所述靶因子檢測的示例性機制。圖2A和2B的示意圖示出了，基于抗體A和抗體B和靶因子(分析物)之間的相互作用使用葡萄糖計進行所述靶因子檢測的示例性機制。圖3A和3B的示意圖示出了，基于功能性核酸(FNA) A和FNAB和靶因子(分析物)之間的相互作用使用葡萄糖計進行所述靶因子檢測的示例性機制。圖4A和4B的示意圖示出了，基于核酸分子A和核酸分子B和靶因子(分析物)之間的相互作用使用葡萄糖計進行所述靶因子檢測的示例性機制，其中所述靶因子為核酸分子。圖5A-5C的示意圖示出了，基于功能性DNA和對應靶因子之間的相互作用使用葡萄糖計進行分析物檢測的示例性機制。(A)DNA-轉化酶綴合物通過與可以對目的靶作出特異性響應的功能性DNA進行DNA雜交被固定于磁珠。(B) —旦加入含有所述靶因子的樣品，功能性DNA和所述靶因子之間的相互作用就擾亂DNA雜交并且導致DNA-轉化酶綴合物從磁珠釋放到溶液中。(C)用磁鐵除去磁珠后，溶液中的所述DNA-轉化酶綴合物可以有效地催化蔗糖水解為葡萄糖，其可通過葡萄糖計定量。釋放到溶液中的DNA-轉化酶綴合物與存在于所述樣品中的靶因子的濃度成比例。因此，所述葡萄糖計的讀數可以用于定量所述靶因子的濃度。圖6的數字圖像示出了所述綴合產物的PAGE (4-20%的梯度膠)圖像。左突光圖像，1:巰基-DNA和的轉化酶，無接頭；2:轉化酶；3:巰基-DNA和轉化酶，有接頭；4:除去DNA后的3 ；5:胺DNA和轉化酶，無接頭；6:轉化酶；7:胺-DNA和轉化酶，有接頭；8:除去DNA后的7。右蛋白染色圖像，1:巰基-DNA和轉化酶，無接頭；2:轉化酶；3:巰基-DNA和轉化酶，有接頭；4:除去DNA后的3。圖7的曲線圖示出了溶液中實際葡萄糖濃度和葡萄糖計檢測濃度的相關性。圖8A和8B的示意圖示出了，通過(A)異雙官能接頭(磺基-SMCC)和⑶同雙官能接頭(roiTC)使DNA和轉化酶綴合的示例性方法。圖9A-9D的示意圖示出了，DNA-轉化酶綴合物通過與(A)可卡因適體(SEQ IDNO: 4), (B)腺苷適體(SEQ ID NO: 6), (C) IFN- y 適體(SEQ ID NO: 6)和(D)U022+DNAzyme (SEQID NO: 11)在鏈親和素包被的MB上雜交而固定，以及隨后存在這些分析物下DNA-轉化酶綴合物的釋放。圖10A-10B的圖示出了使用葡萄糖計得到的緩沖液中(A)可卡因和⑶腺苷傳感器的性能。圖11的圖示出了使用葡萄糖計得到的適體對傳感器的性能的作用。對于存在ImM靶下的可卡因和腺苷傳感器(-)圖中下劃線部分是截短的；(+)所述適體沒有被截短?？煽ㄒ蜻m體對照在SEQ ID NO:5示出；腺苷適體對照在SEQ ID NO:7示出。圖12的圖示出了使用葡萄糖計得到的20%人血清樣品中可卡因傳感器的性能。
圖13A和13B的圖示出了使用葡萄糖計得到的(A)緩沖液和⑶20%人血清中IFN-Y傳感器的性能。圖14A和14B的圖示出了使用葡萄糖計得到的UO22+傳感器的性能(A)及其選擇性(B)。選擇性l:50nM U022+;2:1uMU022+;3:1uM Pb2+; 4:1 uM Cd2+; 5:1OOu M Ca2+/Mg2+;6:luM Zn2+/Cu2+; 7:1 uM Co2+/Ni2+;8:1 u M V0+;9:luM Th4+。葡萄糖計的信號顯示為mg/dL0圖15的示意圖示出了通過所述DNA-轉化酶綴合物方式用個人葡萄糖計(PGM)進行的靶DNA檢測的機制。圖16A的圖示出了使用PGM檢測靶DNA。所述檢測在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7. 3)、0.1M NaCUO. 05%Tween-20中進行。圖中的線指示了所述PGM的上限(600mg/dL葡萄糖)。圖16B的條形圖示出了使用PGM進行的DNA檢測的單錯配選擇性。所述檢測在0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH7. 3),0.1M NaCl.O. 05%Tween_20 中進行。圖17A和B的圖示出了使用PGM檢測HBV DNA片段。所述檢測在0. 15M磷酸鈉緩沖液(pH7. 3),0. 25M NaCl.O. 05%Tween_20 中進行。(A)HBV DNA 片段檢測；(B)所述檢測的
單錯配選擇性。圖18的示意圖示出了通過由DNA-脫硫生物素和DNA-轉化酶綴合物的組裝進行的脫硫生物素-轉化酶綴合。圖19的示意圖示出了使用PGM進行的生物素檢測的機制。圖20的圖示出了使用PGM進行的生物素檢測的結果。圖21的示意圖示出了生物素-轉化酶綴合。圖22的示意圖示出了使用葡萄糖計進行的PSA檢測的分步機制。 圖23A和B的圖示出了使用PGM對(A)緩沖液B中的PSA和⑶緩沖液B中的25%人血清進行定量。圖24的示意圖示出了用于檢測樣品中靶因子的以適體-轉化酶綴合物改良的橫
流裝置。序列表附隨的序列表中列出的核苷酸序列使用37C. F. R.1. 822定義的核苷酸堿基的標準字母縮寫表示。每條核酸序列僅示出一條鏈，但是應認為互補鏈通過任何對所顯示的鏈的提及而被包括在內。除非另有指明，所有鏈均以5'到3'示出。SEQID NO:1是生物素修飾的DNA。SEQID NO:2 是巰基修飾的 DNA。SEQID N0:3 是胺修飾的 DNA。SEQID N0:4是可卡因適體。SEQID N0:5是可卡因適體對照。SEQID NO:6 是腺苷適體。SEQID NO:7是腺苷適體對照。 SEQID NO:8是針對IFN- y的生物素修飾的DNA。SEQID NO:9是針對IFN-Y的巰基修飾的DNA。SEQID NO: 10 是 IFN- y 適體。SEQID NO: 11 是 UO22+-依賴的 DNAzyme。SEQID NO: 12 是 UO22+-依賴的 DNAzyme 的底物。SEQID NO: 13是乙肝病毒(HBV)靶序列。SEQID NO: 14是有G錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 15是有A錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 16是有T錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 17是有兩個錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 18是針對HBV的巰基修飾的DNA。SEQID NO: 19 是 HBV 靶序列。SEQID NO: 20是有A錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 21是有G錯配的HBV靶序列。SEQID NO: 22是有C錯配的HBV靶序列。SEQID NO:23 是胺修飾的 DNA。SEQID NO:24 是巰基修飾的 DNA。
具體實施例方式除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語與本公開發(fā)明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的含義。除非上下文另有明確指示，單數形式的術語“a”、“an”和“the”包括復數的指示對象。類似地，除非上下文另有明確指示，詞“或”意欲包括“和”?！鞍ā币庵浮鞍?。因此“包括A或B”意指“包含A”或者“包含B”或者“包含A和B”。以下描述了用于本公開的實施方案的實施和/或測試的適合方法和材料。這樣的方法和材料僅是說明性的，并非意欲進行限制。可以使用與本文描述的那些相似或等價的其他方法和材料。例如，本公開所屬領域已知的常規(guī)方法描述于多種綜述性和更具體的參考文獻中，包括例如Sambrooketal. , MolecularCloning: ALaboratory Manual,2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;Sambrooketal. , Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3d ed. , Cold Spring HarborPress, 2001;Ausubel etal. , Current ProtocolsinMolecular Biology, GreenePublishing Associates, 1992 (and Supplements to2000) ;Ausubeletal. , ShortProtocols inMolecular Biology :ACompendiumof Methods from CurrentProtocolsinMolecular Biology, 4th ed. ,Wiley&Sons, 1999;Harlow andLane, Antibodies:ALaboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press,1990;andHarlow and Lane,Using Antibodies:ALaboratory Manual，Cold SpringHarborLaboratory Press,1999。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻，出于所有目的以引用的方式全文納入本文。與本文提及的GenBank登錄號有關的所有序列，以引用的方式以其在2010年5月26日顯示的形式全部納入本文，納入的程度為適用的規(guī)定和/或法律所容許。為幫助閱覽本公開的各個實施方案，提供了如下的具體術語的解釋抗體(Ab):至少包括輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)域并可特異性結合抗原(例如靶因子)表位的多肽?？贵w包括單克隆抗體、多克隆抗體或抗體片段以及本領域已知的其他抗體。在某些實例中，抗體是靶因子(例如微生物抗原、孢子、細胞表面受體或毒素)特異性的，因此可以被用作本文提供的傳感器中的識別分子。 抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈和輕鏈每個具有可變區(qū)域，稱作重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)?？傊鯲H區(qū)和VL區(qū)共同負責結合被所述抗體識別的抗原。這包括完整免疫球蛋白及本領域已知的其變體和部分，例如Fab’片段、F(ab)’2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)和二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過接頭結合，而在dsFv中，鏈被突變以引入二硫鍵以穩(wěn)定所述鏈的締合。該術語還包括重組形式，例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和異源綴合物抗體(例如雙特異性抗體)。還參見，Pierce Catalog andHandbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co. , Rockford, IL);Kuby,Immunology, 3rd Ed. , ff.
H.Freeman&Co.，New York, 1997?！皢慰寺】贵w”是由B淋巴細胞的單個克隆或由其中轉染有單個抗體的輕鏈和重鏈基因的細胞產生的。單克隆抗體通過本領域普通技術人員已知的方法產生，例如通過由骨髓瘤細胞與免疫脾細胞的融合制造抗體形成細胞。這些融合細胞及其子代被稱為“雜交瘤”。單克隆抗體包括人化的單克隆抗體?？乖纱碳っ庖唔憫姆肿??？乖ǔＪ堑鞍谆蚨嗵恰１砦皇强乖瓫Q定簇，即引起特異性免疫響應的分子上的具體化學基團或肽序列。抗體可結合特定的抗原表位?？贵w與特定的抗原或抗原表位的結合可以用于測定樣品中是否存在特定抗原(例如靶抗原或目的抗原)。結合兩種物質或分子之間的締合，例如一個核酸分子與另一個(或其自身)的雜交、抗體與肽的締合、蛋白與另一個蛋白或核酸分子的締合或半抗原與抗體之間的締合。結合可以通過本領域技術人員已知的任何方法檢測，例如使用本文提供的方法。當具體的因子(“特異性結合因子”)可以與具體的分析物特異性地反應，例如與抗體特異性地發(fā)生免疫反應或特異性結合具體的靶因子時，就稱為一個分子“特異性結合”到另一個分子。所述結合是，例如，抗體分子與抗原決定簇之間或者寡聚核苷酸(例如功能性核酸)與靶因子(例如DNA或RNA)之間的非隨機結合反應?？贵w的結合特異性一般從所述抗體有差別地結合其特異性抗原和不相關抗原的能力的參考點來測定，并因此區(qū)分兩種不同抗原，尤其是兩種有獨特表位的抗原?？商禺愋越Y合特定表位的抗體被稱為“特異性抗體”。如果足量的寡核苷酸分子與其靶核酸分子形成堿基對或雜交，則所述寡核苷酸分子結合或穩(wěn)定結合靶核酸分子，以允許檢測所述結合。在具體實例中，當兩種組分之間復合物形成的結合常數超過約104L/mol，例如超過約106L/mol，超過約IO8LAiol或超過約IOltlLAi0I時，就稱所述兩種化合物特異性結合。兩種組分的結合常數可以使用本領域已知的方法測定。檢測確定具體因子存在或不存在，在某些實例中，如果檢測到所述因子，則還包括對所述因子進行定量。葡萄糖計指用于確定血液中葡萄糖的大致濃度的任何醫(yī)療裝置。葡萄糖計包括任何市售的葡萄糖計，例如個人葡萄糖計(PGM)。這樣的葡萄糖計一般以mg/dl或mmol/1顯示葡萄糖的水平。本公開不限于具體品牌的葡萄糖計，但實例包括 ACCl -C^ ONOOIC [_、A1.)VOC'ATE紙
AGAMATRlX 、ASC:EXM A 、BIOWME 、CLVERC HK_、EASYGLUCO_、FREESTYLE 、MAXIMA , MEMSENSE 、PRESTIGE , TRI EBALANCE > TRUETEST .固定結合到表面,例如固體支持物。在一個實施方案中,所述固體表面是珠形式。所述表面可以包含可特異性結合靶因子的固定識別分子。在某些實例中，可催化物質轉化為葡萄糖的酶(直接或間接地)結合于使得可進行靶因子檢測的識別分子。在一個實例中，一旦所述靶因子與固定到所述固體支持物的分子結合，可以催化物質轉化為葡萄糖的所述酶就從所述固體支持物釋放(或被釋放從而其可移動到所固體支持物的另一部分，例如從橫流裝置的一部分到另一部分)。將因子固定到固體支持物的方法是本領域已知的。例如，在固體表面固定肽的方法可見于W094/29436和美國專利No. 5，858，358。在某些實例中，通過如下方式將因子固定到支持物，簡單地將溶液中的因子施加到所述支持物上，并使所述溶液干燥，從而將所述因子固定到所述支持物上。轉化酶(EC3. 2.1. 26)可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖的酶。還被稱為P -果糖呋喃苷酶。轉化酶的核酸和蛋白質序列是公眾可獲得的。例如，GENBANK 登錄號D10265;AY378100REGI0N:43839. 44963;Z46921REGI0N:37385. 38983 和 AB534221 公開了示例性的轉化酶核酸序列，GENBANKB登錄號BAA01107. 1;AAR07688. 1;BAA25684.1; CAA87030.1和BAJ07824.1公開了示例性的轉化酶蛋白序列，在2010年5月26日由GENBANK 提供的所有上述序列均以引用的方式納入本文。在某些實例中，轉化酶與公眾可獲得的轉化酶序列具有至少80%的序列同一性，例如至少85%、90%、95%或98%的序列同一性，并且是可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖的轉化酶。橫流裝置橫流色譜中使用的測試條形式的分析裝置，其中樣品流體，例如懷疑含有靶因子的液體，通過所述測試條(常常由吸水材料制造，例如紙、硝酸纖維素和纖維素)流動(例如通過毛細管作用)。所述測試樣品和任何懸浮的分析物(包括靶因子)可以沿所述條流到檢測區(qū)，在所述檢測區(qū)中所述靶因子(如果存在)與本文提供的傳感器的識別分子相互作用以指示所述靶因子的存在、不存在和/或量。已經公開了許多橫流分析裝置，包括如下文獻示出的那些美國專利No. 4，313，734 ;4，435，504 ;4，775，636 ;4，703，017 ;4，740，468 ;4，806，311 ;4，806，312 ；4，861，711 ;4，855，240 ;4，857，453 ;4，943，522 ;4，945，042 ;4，496，654 ;5，001，049 ；5，075，078 ；5, 126，241 ；5, 451，504 ；5, 424，193 ；5, 712，172 ；6, 555，390 ；6, 368，876 ；7，799，554 ；EP0810436 ；以及 W092/12428 ；W094/01775 ；W095/16207 ;和 W097/06439,其各自以引用的方式納入本文。在一個實例中，橫流裝置可以為一步(one-step)橫流測定，其中樣品流體被置于吸水條(盡管也可以使用非吸水材料，并通過在所述材料上施加表面活性劑提供吸水性)上的樣品或芯吸區(qū)域，并可沿所述條遷移直到所述樣品接觸到與所述液體中靶因子相互作用的識別分子。所述靶因子結合所述識別分子后，所述可將物質轉化為葡萄糖的酶被釋放(例如從所述識別分子)，并可與所述物質相互作用，從而生成葡萄糖，指示所述相互作用已經發(fā)生并且所述靶因子存在于所述樣品中。所產生的葡萄糖可以用PGM檢測。在某些實例中，多個分立的結合配偶體可以被置于所述條上(例如成平行線或作為所述裝置的其他分離部分)以檢測所述液體中的多個靶因子。所述測試條還可以包括對照指示劑，其提供所述測試已經充分進行的信號，即使沒有獲得指示分析物存在(或不存在)的陽性信號。橫流裝置可以包括樣品施加區(qū)域或芯吸墊，其是所述流體或液態(tài)樣品被引入的地方。在一個實例中，可以通過外部施加例如用滴管或其他點樣器將所述樣品引入到所述樣品施加區(qū)域。在另一個實例中，所述樣品施加區(qū)域可以直接浸在所述樣品中，例如當測試條浸在裝有樣品的容器中時。在另一個實例中，所述樣品可以被傾倒或擠壓到所述樣品施加區(qū)域。橫流裝置可以包括綴合墊——固定所述識別分子(例如可將物質轉化為葡萄糖的識別分子-酶)的橫流裝置區(qū)域。橫流裝置可以具有多于一個的綴合區(qū)域，例如，“第一級綴合區(qū)域”、“第二級綴合區(qū)域”等。通常會將不同的捕獲因子固定在所述第一級、第二級或其他綴合區(qū)域。多個綴合區(qū)域在所述橫流基質上相互之間可以為任何方向；例如第一級綴合區(qū)域可以在第二級(或其他)綴合區(qū)域的遠側或近側，反之亦然。或者，第一級綴合區(qū)域和綴合(或其他)捕獲區(qū)域可以相互為垂直方向，使得所述兩個(或更多)綴合區(qū)域形成乘號或加號或其他符號。例如，Apilux et al. (Anal. Chem. 82:1727-32, 2010), Dungchaiet al. (Anal. Chem. 81:5821-6,2009)和 Dungchai et al. (Analytica Chemica Acta674:227-33, 2010)提供了示例性的橫流裝置，其具有中心樣品區(qū)域和在所述樣品區(qū)域的遠側的一個或多個綴合區(qū)域，該裝置提供了可以發(fā)生獨立反應的獨立測試區(qū)(例如，每個測試區(qū)有不同的識別分子，還可以包括含有可轉化為葡萄糖的物質的膜和接收所生成的葡萄糖的吸收墊，其中每個吸收墊可用PGM獨立地讀數)，所述樣品區(qū)域和綴合區(qū)域可例如形成“Y”、四葉式交叉或輻條輪樣式。橫流裝置可以包括含有可轉化為葡萄糖的物質(例如蔗糖)的膜，和通過毛細管作用吸引所述樣品穿過所述綴合墊和膜并收集所述樣品的吸收墊。傳感器用于檢測靶例如靶分析物/因子的存在情況的裝置。所述公開的傳感器包括對靶因子特異的、附著到固體支持物的識別分子和可催化物質轉化(例如在存在所述靶因子下)為葡萄糖的酶。所述酶可以直接或間接地附著到所述識別分子上。靶因子需要檢測的任何物質，包括但不限于化學化合物、金屬、病原體、毒素、核酸(例如DNA或RNA)或蛋白質(例如細胞因子、激素或抗原)，以及具體的細胞(例如癌細胞或細菌細胞)、病毒或孢子。
用于檢測靶因子的傳感器本文提供了可用于檢測目的分析物(本文中稱為靶因子)的傳感器。這樣的傳感器可以使用本文提供的方法設計以檢測寬范圍的靶，可顯著地促進合理設計以及增加傳感器開發(fā)的效率。通過組合可特異性結合靶因子的分子(本文稱為識別分子)、可將物質(例如酶底物)轉化為葡萄糖的酶和市售的個人葡萄糖計(PGM)，提供了用于設計對寬范圍分析物特異的便攜、低成本且可定量傳感器的通用平臺。在一個實例中，所述方法基于靶因子誘導的所述酶從固體支持物的釋放，或者基于也可結合所述靶因子的酶-識別分子復合物的使用，其中所述酶可以有效地將PGM-惰性物質(例如蔗糖)轉化為PGM-可檢測的葡萄糖。本文報告了使用這種通用方法，定量可卡因、腺苷、干擾素-Y (IFN-Y)和UO22+的靈敏且具有選擇性的具體傳感器實例，其僅需市售的PGM進行所述檢測?？煽ㄒ蚴浅砂a藥物，其檢測對于藥物濫用的管理是重要的32，43 ;腺苷是重要的代謝產物，參與許多生物過程4SlFN-Y是與人免疫系統(tǒng)相關的細胞因子47，IFN-Y釋放測定目前用于診斷肺結核48，肺結核是傳染性疾病，估計潛伏于三分之一的世界人口中，潛伏感染者中的10%可在生命中 變得活躍；U022+是對人和環(huán)境都有危險的放射性重金屬離子49。使用此平臺，通過本文描述的通用方法可以實現(xiàn)用于使用PGM的多種分析物的許多其他傳感器。本文公開了可檢測靶因子的傳感器。在一個實例中，這樣的傳感器包括固體支持物，其上附著有可檢測靶因子的識別分子。例如，所述識別分子在存在所述靶因子下可以高特異性地結合所述靶因子，但是不顯著結合其他因子。在某些實例中，所述傳感器還包括可催化物質(酶底物)轉化為葡萄糖(或可被任意葡萄糖計檢測的任何其他產物)的酶。例如，所述酶可以是可將蔗糖轉化為葡萄糖的轉化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-異麥芽糖酶，可將麥芽糖轉化為葡萄糖的麥芽糖酶，可將海藻糖轉化為葡萄糖的海藻糖酶，可將乳糖轉化為葡萄糖的乳糖酶，可將淀粉轉化為葡萄糖的淀粉酶或葡糖淀粉酶或者可以是可將纖維素轉化為葡萄糖的纖維素酶。所述酶還可以是任意來源的a-或￠-葡糖苷酶或脫支酶。在一個實例中，所述酶附著到可檢測靶因子的識別分子，使得在存在所述靶因子下，所述酶從所述固體支持物釋放并可將物質轉化為葡萄糖，所述葡萄糖可被檢測且在某些實例中可被定量。在另一個實例中，所述酶最初不是所述傳感器的一部分，而是在所述靶因子結合所述識別分子后，已經與所述酶綴合的第二識別分子(其可以與附著到所述固體支持物的識別分子相同或不同)結合于已結合到所述第一識別分子的靶因子，所述第一識別分子已經結合到所述固體支持物上，從而形成“夾心”型。然后，所述結合的酶可以將所述物質轉化為葡萄糖，所述葡萄糖可被檢測且在某些實例中可被定量本領域技術人員應該認識到，使用其他技術將一種靶因子的濃度信息轉變?yōu)榱硪环N靶因子的濃度信息一隨后使用本申請的方法檢測所述另一種靶因子的濃度信息一的任何方法都可以被使用。例如，如果靶因子A可以通過某種技術定量地產生物質B，則可以簡單地使用本申請的方法檢測物質B，然后將物質B的濃度轉化為樣品中靶因子A的濃度。圖1A-B提供了所述傳感器及其使用方法的概況。在圖1A和IB中，識別分子A和識別分子B (本文稱為可以高特異性地結合靶因子的識別分子)可以是相同或不同的分子，其中兩者都可以結合分析物(本文中稱為靶因子)。使用綴合方法，使可催化物質(酶底物)轉化為葡萄糖的酶與分析物類似物(即所述靶因子的類似物；圖1A)或識別分子B (圖1B)綴合，以分別形成酶-分析物類似物綴合物(圖1A)或酶-識別分子B綴合物(圖1B)。所述酶底物可以被酶催化轉化為葡萄糖，所產生的葡萄糖可以通過葡萄糖計定量。所述測試因子(分析物)可以是可被識別分子A和識別分子B識別的任何物質。所述分析物類似物可以是可結合識別分子A的任何物質，并與所述靶因子與識別分子A之間的結合相競爭的任何物質。分析物類似物的實例包括但不限于抗體與抗原；適體與對應的靶；核酶與對應的輔因子或靶；DNAzyme或催化性DNA或DNA酶與對應的輔因子或靶；以及核酸或其他類似物，例如肽核酸、鎖核酸和任何的化學修飾的類似物。所述酶-分析物類似物綴合物和所述酶-識別分子B綴合物是通過使用常規(guī)的綴合方法，將所述酶分別與所述分析物類似物或識別分子B綴合而制備的?！D1A示出了示例性的基于釋放的測定。最初，酶-分析物類似物綴合物通過酶-分析物類似物綴合物與識別分子A之間的相互作用結合到所述固體支持物。當含有測試因子的樣品被施加到所述固體支持物時，由于酶-分析物類似物綴合物和測試因子之間對結合識別分子A的競爭，所述酶-分析物類似物綴合物會被釋放。所釋放的酶-分析物類似物綴合物的濃度可以與所述樣品中的測試因子濃度成比例。在除去所述固體支持物后，留在溶液中的酶-分析物類似物綴合物可以催化所述酶底物轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所述分析物濃度成比例。圖1B示出了示例性的基于結合的測定。最初，識別分子A被固定到所述固體支持物。當含有或懷疑含有測試因子(分析物)的樣品被施加到固體支持物時，所述分析物結合識別分子A。隨后，加入酶-識別分子B綴合物，其會結合識別分子A上的分析物，形成夾心結構。結合的酶-識別分子B綴合物的量可以與所述樣品中分析物的濃度成比例。在將酶底物(例如蔗糖)施加到固體支持物上后，所述結合的酶-識別分子B綴合物可以將酶底物轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所述分析物濃度成比例。所以，在該實例中，所述酶沒有與識別分子A結合，也沒有從所述固體支持物釋放或分離。所述酶實際上與所述靶因子結合，并且所述靶因子可以結合識別分子A和B兩者。這樣，在存在更多所述靶因子下，更多酶將結合到所述固體支持物，所述固體支持物可以將更多蔗糖轉化為葡萄糖，得到更大的葡萄糖計讀數。如圖2A和2B所示，圖1A和IB中的所述識別分子可以是抗體(例如抗體A和抗體B)。通過圖2A或2B示出的方法，具有抗體的任何靶因子均可通過葡萄糖計被定量。如圖2A和2B所示，抗體A和抗體B都可以結合所述分析物(靶因子)；它們可以是相同抗體或對相同分析物特異的不同抗體。圖2A示出了基于釋放的方法。使用常規(guī)綴合方法將抗體A固定到所述固體支持物。加入所述酶-類似物綴合物(例如轉化酶-抗體綴合物)，其會結合抗體A。所述酶-類似物綴合物可以使用常規(guī)方法制備。使含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合抗體A的條件下，與所述固體支持物接觸，從而因競爭而取代所述酶-類似物綴合物。釋放的酶-類似物綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在除去所述固體支持物后，所述酶-抗體綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中靶因子濃度成比例。圖2B示出了基于結合的方法。使用常規(guī)方法將抗體A固定到所述固體支持物。將含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合抗體的條件下，與所述固體支持物接觸。加入酶-抗體B綴合物(例如轉化酶-抗體B綴合物)，其會結合已與抗體A結合的分析物(靶因子)，形成夾心結構。所述酶-抗體B綴合物可以使用常規(guī)方法制備。結合的酶-抗體B綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在將酶底物(例如蔗糖)溶液施加到所述固體支持物后，所述結合的酶-抗體B綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中靶因子濃度成比例。如圖3A和3B所示，圖1A和IB中的識別分子可以是功能性核酸，例如適體、DNAzyme或適體酶(aptazyme)(例如功能性核酸(FNA)A和B)。如圖3A和3B所示，F(xiàn)NA A和FNA B都可以結合所述分析物(靶因子)；它們可以是相同F(xiàn)NA或對相同分析物特異的不同 FNA。
圖3A示出了基于釋放的方法。使用常規(guī)固定方法將FNA A固定到所述固體支持物。加入所述酶-類似物綴合物(例如轉化酶-分析物類似物綴合物)，其會結合FNA A0所述酶-類似物綴合物可以使用常規(guī)方法制備。使含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合FNA A的條件下，與所述固體支持物接觸，從而因競爭而取代所述酶-類似物綴合物。釋放的酶-類似物綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在除去所述固體支持物后，所述酶-抗體綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中靶因子濃度成比例.圖3B示出了基于結合的方法。使用常規(guī)方法將FNAA固定到所述固體支持物。使含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合FNA A的條件下，與所述固體支持物接觸。加入酶-FNA B綴合物(例如轉化酶-FNA B綴合物)，其會結合已與FNA A結合的分析物(靶因子)，形成夾心結構。所述酶-FNA B綴合物可以使用常規(guī)方法制備。結合的酶-FNA B綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在將酶底物(例如蔗糖)溶液施加到所述固體支持物后，所述結合的酶-FNA B綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中靶因子濃度成比例。因為所述靶分析物可以是可被圖1A和IB示出的識別分子A和B識別的任何物質，所以本公開不受限于使用具體的識別組分。例如，除抗體(圖2A和2B)和功能性核酸(圖3A和3B)外，它們可以包括肽、蛋白質、聚合物以及可識別靶分析物的更小分子。例如，如圖4A和4B所示，可以通過核酸之間的雜交檢測核酸。在該實例中，所述靶因子為核酸，圖1A和IB的識別分子A和識別分子B被替換為可與所述分析物雜交的核酸。還應該認識到，還可以使用組合的方法，例如用抗體和功能性核酸分別代替識別分子A和識別分子B (圖1A和1B)(或者反之亦然)。如圖4A和4B所示，在圖1A和IB中的識別分子可以是核酸(例如DNA)，所述分析物(靶因子)也可以是核酸。如圖4A和4B所示，核酸A和核酸B兩者都可以結合所述分析物(靶因子)；它們可以是相同核酸或對相同的核酸靶因子特異的不同核酸。圖4A示出了基于釋放的方法。使用常規(guī)固定方法將DNA A固定到所述固體支持物。加入所述酶-類似物綴合物(例如轉化酶-分析物類似物綴合物)，其會結合DNA A0所述酶-類似物綴合物可以使用常規(guī)方法制備。使含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合DNA A的條件下，與所述固體支持物接觸，從而因競爭而取代所述酶-類似物綴合物。釋放的酶-類似物綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在除去所述固體支持物后，所述酶-抗體綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中靶因子濃度成比例.圖4B示出了基于結合的方法。使用常規(guī)方法將DNA A固定到所述固體支持物。使含有分析物(例如懷疑含有所述靶因子)的樣品，在允許所述靶因子特異性結合DNA A的條件下，與所述固體支持物接觸。加入酶-DNA B綴合物(例如轉化酶-DNA B綴合物)，其會結合已與DNA A結合的分析物(靶因子)，形成夾心結構。所述酶-DNA B綴合物可以使用常規(guī)方法制備。結合的酶-DNA B綴合物的量可以與所述樣品中靶因子的濃度成比例。在將酶底物(例如蔗糖)溶液施加到所述固體支持物后，所述結合的酶-DNA B綴合物可以將所述酶底物(例如蔗糖)轉化為葡萄糖，所述葡萄糖通過葡萄糖計檢測，其讀數與所測試的樣品中 靶因子濃度成比例。圖5示出了所公開的傳感器的具體實例。所述傳感器設計是基于以下兩者作為信號發(fā)生器的分析物誘導的DNA從固定在磁珠上的功能性DNA雙鏈體的釋放，以及，作為信號放大器的DNA-轉化酶綴合物。一旦具體的祀結合所述DNA,與所述適體或所述DNAzyme的底物部分互補的單鏈DNA(ssDNA)就被釋放,這是由于所述適體的結構轉換或所述DNAzyme的催化反應。因為所述ssDNA與轉化酶共價地綴合，所以所述轉化酶與所述ssDNA —起被釋放。然后，所釋放的轉化酶可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖，葡萄糖可被PGM進一步檢測并可用于定量所述樣品中分析物的濃度。固體支持物形成所述傳感器的基礎的固體支持物可以由已知材料形成，例如任何不溶于水的材料。在某些實例中，可用于形成所述固體支持物表面的材料的適合特性包括可進行表面活化，使得一旦活化，所述支持物表面能夠共價地連接可高特異性結合所述靶因子的識別分子，例如例如寡核苷酸或蛋白質；是化學惰性的，使得所述支持物上未被所述可高特異性結合靶因子的分子占據的區(qū)域不發(fā)生非特異性的結合，或者當發(fā)生非特異性結合時，這些材料可以被容易地從所述表面除去而不會除去所述可高特異性結合靶因子的分子。固相可按其吸引和固定因子(例如可高特異性結合所述靶因子的識別分子)的固有能力來選擇?；蛘?，所述固相可以有具有吸引并固定因子例如識別分子的能力的因素。所述因素可以包括帶電荷的物質，其帶有相對于例如所述識別分子本身或相對于綴合到所述識別分子的帶電荷的物質相反的電荷。在另一個實施方案中，可將特異性結合部件固定在所述固相上，以固定其結合配偶體(例如識別分子)。因此，在該實例中，所述特異性結合部件使所述識別分子間接地結合到固相材料。固體支持物表面可以通過導致因子(例如對所述靶因子特異的識別分子)共價連接到所述支持物的化學過程而活化。但是，也可以使用任何其他適合的方法來將因子(例如識別分子)固定到固體支持物，包括但不限于離子相互作用、疏水性相互作用、共價相互作用等。導致識別分子固定到固相上的具體力對于本文描述的方法和裝置是不重要的。在一個實例中，所述固體支持物是顆粒，例如珠。這種顆?？梢杂山饘?例如金、銀、鉬)、金屬化合物顆粒(例如氧化鋅、硫化鋅、硫化銅、硫化鎘)、非金屬化合物(例如硅或聚合物)以及磁性顆粒(例如氧化鐵、氧化錳)組成。在某些實例中，所述珠是乳膠或玻璃珠。所述珠的大小不是關鍵的；示例性的大小包括直徑5nm到5000nm。在一個實例中，這種顆粒直徑為約I U m。在另一個實例中，所述固體支持物是疏松材料，例如紙、膜、多孔材料、不溶于水的凝膠、與水不混溶的離子液體、不溶于水的聚合物(例如有機聚合物)等。例如，所述固體支持物可以包括膜，例如允許某些材料通過而截留其他材料的半多孔膜。在一個實例中，所述膜包括硝酸纖維素。在一個具體實例中，所述固體支持物是橫流裝置的一部分，所述橫流裝置包括含有本文所公開的傳感器的區(qū)域。在某些實施方案中，多孔固體支持物例如硝酸纖維素是片狀物形式或條狀物形式，例如見于橫流裝置中的這些。這種片狀物或條狀物的厚度可以在大限度內變化，例如至少0. 01mm、至少0.1mm或至少Imm,例如約0. 01到5mm、約0. 01到2mm、約0. 01到1mm、約
0.01 到 0. 5mm、約 0. 02 到 0. 45mm、約 0. 05 到 0. 3mm、約 0. 075 到 0. 25mm、約 0.1 到 0. 2mm或約0. 11到0. 15mm。這種片狀物或條狀物的孔的大小可以類似地在大限度內變化，例如 約0. 025到15微米，或更特別是約0.1到3微米；但是，孔的大小不應成為選擇所述固體支持物的限制性因素。固體支持物的可適用的流速也可以在大限度內變化，例如約12. 5到90sec/cm (即 50 到 300sec/4cm)、約 22. 5 到 62. 5sec/cm (即 90 到 250sec/4cm)、約 25 到62. 5sec/cm (即 100 到 250sec/4cm)、約 37. 5 到 62. 5sec/cm (即 150 到 250sec/4cm)或約50到62. 5sec/cm (即200到250sec/4cm)。在本文描述的裝置的具體實施方案中，所述流速為約62. 5sec/cm (即250sec/4cm)。在本文描述的裝置的其他具體實施方案中，所述流速為約 37. 5sec/cm (即 150sec/4cm)。在一個實例中，所述固體支持物由有機聚合物組成。用于所述固體支持物的適合材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚異戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯-丙烯、聚乙烯-乙烯醇、聚甲基戊烯、聚三氟氯乙烯、聚砜、羥基化的雙向拉伸聚丙烯、胺化的雙向拉伸聚丙烯、硫醇化雙向拉伸聚丙烯、乙烯丙烯酸、亞甲基甲基丙烯酸及其共聚物的摻合物。在其他的實例中，所述固體支持物是含有例如涂層的材料，所述涂層含有本文提供的成分的任意一種或多種或其混合物。根據本公開可以使用多種固體支持物。除非物理學上另受約束，固體支持物可以以任何適合的形狀被使用，例如薄膜、片狀物、條狀物或板狀體，或者其可以被包被或結合或層壓到適當的惰性支持物上，所述惰性支持物例如紙、玻璃、塑料薄膜或織物。所述固體支持物可以是可附加對所述測試因子特異的分子的任何形式，例如微量滴定板、ELISA板、測試管、無機片狀物、試紙、橫流裝置等。一個實例包括對所述靶因子特異的分子的線性陣列，在本領域中通常稱為試紙(dipstick)。另一種適合的形式包括獨立單元的二維樣式(例如64*64陣列的4096方塊)。本領域技術人員應該理解，包括但不限于的槽形(矩形)和圓形陣列的其他陣列形式同樣適合使用。在一個實例中，所述陣列形成在聚合物介質上，所述介質是線、膜或薄膜。有機聚合物介質的實例是厚度大約為Imil. (0.001英寸)到約20mil.的聚丙烯片狀物，但所述薄膜的厚度不是關鍵的并可以在相當寬的范圍內變化。在一個實例中，所述形式是珠，例如二氧化硅珠。在另一個實例中，所述形式是硝酸纖維素膜。在另一個實例中，所述形式是濾紙。在仍然另一個實例中，所述形式是玻璃載玻片。在一個實例中，所述固體支持物是聚丙烯線。一根或多根聚丙烯線可被附加到塑料試紙型裝置；聚丙烯膜可被附著到玻璃載玻片。在一個實例中，所述固體支持物是微量滴定板。例如，傳感器可被附加到微量滴定板的孔中(例如其中某些孔可以含有檢測靶X的傳感器，而其他孔可以含有檢測靶Y的傳感器；或者幾個孔可以包括相同傳感器，其中可同時分析多個樣品)?？赡芎心康姆治鑫锏臏y試樣品被放置于含有本文所公開傳感器的微量滴定板的孔中，使用本文提供的方法檢測所述靶的存在情況。所述微量滴定板形式的一個優(yōu)勢是可以同時測試多個樣品(和對照)，每個樣品在相同板的一個或多個不同孔中；因此，可允許高通量分析許多樣品。在某些實例中，所公開的傳感器被附著到多于一個的固體支持物。例如，如圖24所示，含有識別分子-酶復合物的傳感器可被附著到珠，然后所述珠可以被附著到橫流裝置的綴合墊。在某些實施方案中，本文論述的支持物和裝置的每一個(例如ELISA、橫流裝置)均可以被安排用于，通過加入對其他目的分析物特異的識別分子來檢測多個分析物。例如，微量滴定板的某些孔可以包括對其他目的分析物特異的識別分子。某些橫流裝置實施方案可以包括含有對其他目的分析物特異的識別分子的二級、三級或更多的捕獲區(qū)域。橫流裝置在一個實例中，所述固體支持物是橫流裝置，其可被用于確定流體樣品中一種或多種靶因子的存在情況和/或量。橫流裝置是具有測試條的分析裝置，懷疑(或已知)含有靶因子的測試樣品流體通過所述測試條流動。橫流裝置用于簡化和自動化用戶樣品界面和處理。橫流裝置的一個實例是懷孕測試條?；趹言袦y試條的原理，可以開發(fā)包括本公開的傳感器的橫流裝置。在某些實例中，通過使用例如橫流裝置，可以將樣品直接地與所述橫流裝置接觸或施加到所述橫流裝置，不需要進一步的液體轉移或混合。這種裝置可被用于例如定性地或定量地檢測靶因子。橫流裝置是本領域眾所周知的，并且具有多種物理形式。本公開涵蓋以適當功能關系支持和/或容納橫流裝置的基本組分的任何物理形式。在一個實例中，使用了美國專利 No. 7，799，554、Liu et al. (Angew. Chem.1nt. Ed. 45:7955-59, 2006) > Apilux etal. (Anal. Chem. 82:1727-32，2010)、Dungchai et al. (Anal. Chem. 81:5821-6, 2009)或Dungchai et al. (Analytica Chemica Acta674:227-33，2010)(以上所有均以引用的方式納入本文)中公開的橫流裝置，例如使用Millipore H1-Flow Plus Assembly Kit制造的橫流裝置。有大量市售橫流型測試及專利公開了對大分析物(分子量大于1000道爾頓)進行檢測的方法(參見例如美國專利 No. 5，229，073; 5，591，645; 4，168，146; 4，366，241; 4，855，240;4, 861, 711;和 5，120，643;歐洲專利 No. 0296724;W097/06439;和 W098/36278)。也有用于檢測小分析物(分子量100-1000道爾頓)的橫流型測試(參見例如美國專利No. 4，703，017;5，451，504; 5, 451，507; 5, 798，273;和 6，001，658)。橫流裝置的構建和設計是本領域熟知的， 例如描述于MilliporeCorporation,A Short Guide Developing Immunochromatographic TestStrips，2nd Edition，pp. 1-40，1999，其可通過請求(800)645-5476 而獲得； 以及 Schleicher&Schuell,EasytoWork with BioScience， Productsand Protocols2003, pp. 73-98, 2003,其可通過請求 Schleicher&SchuelIBioScience, Inc.，IOOptical Avenue, Keene, NH03431, (603) 352-3810 而獲得；以上兩者都以引用的方式納入本文。本文描述的裝置通常包括吸收材料的條狀物(例如微孔膜)，其可由區(qū)域內彼此相連的不同物質制成，其可以是鄰接的和/或重疊的。在某些實例中，所述吸收條狀物可以被固定到支持性的非相互作用材料(例如非編織聚酯)上，目的是例如給所述條狀物提供增加的剛性。每個條狀物內的區(qū)域可以不同地含有，檢測和/或定量所測試的具體分析物所需要的特異性識別分子和/或其他試劑(例如可被酶轉化為葡萄糖的酶底物，例如蔗糖)。因此，這些區(qū)域可以被視為所述測試裝置內的功能性部分或功能性區(qū)域。這些裝置一般包括樣品施加區(qū)域和一個或多個分離的靶因子捕獲區(qū)域(綴合墊)，其中提供了本文公開的固定化傳感器，所述傳感器包括對靶因子具有特異性結合親和力的 識別分子。例如，含有至少兩個分離的靶因子捕獲區(qū)域(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多)的橫流裝置可被用于檢測單一樣品中大量不同的靶因子。任何被施加在所述樣品施加區(qū)域的的液體(例如流體生物樣品)沿著從所述樣品施加區(qū)域到所述捕獲區(qū)域的流動路線流動。一旦所述靶因子結合所述識別分子，可催化物質轉化為葡萄糖的所述酶就被釋放(這種酶和物質的實例參見表2)。所述酶流動到含有所述適當物質的下游膜。所述物質(例如蔗糖)被轉化為葡萄糖，所述葡萄糖流動到下游吸收墊，其可作為液體儲存器。在所述橫流條帶上的產生的葡萄糖可用PGM檢測，例如通過將所述裝置插入PGM。在一個可檢測多種靶的橫流裝置的實例中，所述裝置包括單一芯吸墊或樣品施加區(qū)域，和多個綴合墊、膜和吸收墊(使得每個綴合墊與具體的膜和吸收墊相關聯(lián))。例如，每個綴合墊可以包括對具體的靶因子特異的不同識別分子。因此，因所述靶因子產生的并存在于每個吸收墊上的葡萄糖可用于檢測具體靶因子的存在情況。為使得PGM在許多不同樣品中能夠檢測寬范圍的非葡萄糖靶，可生成包括識別分子的橫流裝置，所述識別分子可與可催化物質(例如蔗糖)轉化為葡萄糖的酶(例如轉化酶)綴合。在一個實例中，所述識別分子為對所述靶有高特異性的核酸適體(例如DNA適體)。在另一個實例中，所述識別分子是對所述靶特異的抗體。理想地，識別分子能夠以高靈敏度和選擇性識別靶。這種分子是已知的，并可以使用已知方法容易地獲得?？纱呋镔|(例如蔗糖)轉化為葡萄糖的所述酶(例如轉化酶)可與所述識別分子綴合，產生例如適體-酶綴合物(例如適體-轉化酶綴合物)或Ab-酶綴合物(例如Ab-轉化酶綴合物)。在一個具體實例中，所述識別分子是對病原體例如乙肝表面抗原(HBsAg)或HIV的Tat蛋白特異的DNA適體，并與轉化酶綴合。這種適體可使用已知方法生成49。本文提供了其他示例性的識別分子和可催化物質(例如蔗糖)轉化為葡萄糖的酶。所述橫流裝置可以包括芯吸墊、綴合墊、膜、吸收墊及其組合。這些墊可以相互鄰接或重疊，并可被附著到背面。可用于橫流裝置的組件的示例性材料在表I示出。但是，本領域技術人員應該認識到，在具體橫流裝置中使用的具體材料將依賴于許多變量，包括例如要檢測的分析物、樣品容量、需要的流速以及其他變量，可以相應地常規(guī)選擇有用的材料。表1:用于橫流裝置的示例性材料
權利要求
1.一種傳感器,包括 附著有識別分子從而可檢測靶因子的固體支持物，其中所述識別分子在存在所述靶因子下特異性結合所述靶因子，但是不顯著結合其他因子；以及 可催化物質轉化為葡萄糖的酶，其中所述酶直接或間接附著到所述識別分子，其中在存在所述靶因子下所述酶可以將所述物質轉化為葡萄糖。
2.權利要求1的傳感器，其中所述酶直接附著到所述識別分子。
3.權利要求1的傳感器，其中所述酶間接附著到所述識別分子，所述酶是可結合所述識別分子的分析物-類似物綴合物的一部分，其中在存在所述靶因子下所述酶從所述固體支持物釋放，然后可以將所述物質轉化為葡萄糖。
4.權利要求1的傳感器，其中所述酶間接附著到所述識別分子，所述酶是可結合結合于所述識別分子的所述靶因子的分析物-類似物綴合物的一部分，其中在存在所述靶因子下所述酶可以將所述物質轉化為葡萄糖。
5.權利要求1-4任一項的傳感器,其中所述固體支持物包括珠或膜。
6.權利要求1-5任一項的傳感器,其中所述固體支持物包括玻璃或硝酸纖維素。
7.權利要求1-6任一項的傳感器，其中所述識別分子包括核酸分子、蛋白質、聚合物或可特異性結合所述靶因子的抗體。
8.權利要求7的傳感器，其中所述核酸分子包括DNA、RNA、肽核酸(PNA)或鎖核酸(LNA) ο
9.權利要求7或8的傳感器，其中所述核酸分子包括功能性核酸。
10.權利要求9的傳感器，其中所述功能性核酸包括適體、DNAzyme或適體酶。
11.權利要求7的傳感器，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體或抗體片段。
12.權利要求1-11任一項的傳感器，其中所述靶因子包括金屬、微生物、細胞因子、激素、細胞、核酸分子、孢子、蛋白質、消遣性藥物或毒素。
13.權利要求12的傳感器，其中所述金屬為 重金屬，其包括汞(Hg)、鎘(Cd)、砷(As)、鉻(Cr)、鉈(Tl)、鈾(U)、钚(Pu)或鉛(Pb)，或者 營養(yǎng)金屬，其包括鈣、鐵、鈷、鎂、錳、鑰、鋅、鎘或銅。
14.權利要求12的傳感器，其中所述微生物為病毒、細菌、真菌或原生動物。
15.權利要求12的傳感器，其中所述激素為外分泌激素。
16.權利要求12的傳感器，其中所述細胞為癌細胞。
17.權利要求1-16任一項的傳感器，其中所述酶為 可將蔗糖轉化為葡萄糖的轉化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-異麥芽糖酶， 可將麥芽糖轉化為葡萄糖的麥芽糖酶， 可將海藻糖轉化為葡萄糖的海藻糖酶， 可將淀粉轉化為葡萄糖的淀粉酶，或 可將纖維素轉化為葡萄糖的纖維素酶。
18.一種橫流裝置，其包括 權利要求1-17任一項的固體支持物。
19.權利要求18的橫流裝置，其中所述橫流裝置包括樣品或芯吸墊； 綴合墊，其中所述傳感器綴合到所述綴合墊； 膜，其包括可被轉化為葡萄糖的物質；和 吸收墊。
20.權利要求19的橫流裝置，其中所述傳感器包括DNA適體-轉化酶綴合物或抗體-轉化酶綴合物，其中所述DNA適體或抗體對靶因子是特異的，其中可被轉化為葡萄糖的物質為蔗糖。
21.權利要求20的橫流裝置，其中所述靶因子為金屬、微生物抗原、孢子或微生物核酸序列。
22.—種試劑盒，其包括 權利要求1-17任一項的一個或多個傳感器或者權利要求18-21任一項的橫流裝置；以及 一種或多種緩沖液，將檢測的葡萄糖水平與存在的靶因子量建立關聯(lián)的圖表，或可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質。
23.權利要求22的試劑盒，其中可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維素或淀粉。
24.一種檢測靶因子的方法，其包括 將權利要求1-3和5-17任一項的一個或多個傳感器與樣品在足以使所述樣品中的靶因子可將所述酶從所述固體支持物釋放的條件下接觸； 分離所述固體支持物與所釋放的酶； 將所述釋放的酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質接觸，從而生成葡萄糖； 檢測葡萄糖，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子。
25.一種檢測靶因子的方法，其包括 將權利要求1-17任一項的一個或多個傳感器或權利要求18-21任一項的橫流裝置與樣品在足以使所述樣品中的靶因子結合所述識別分子的條件下接觸，從而形成靶因子-識別分子復合物； 將所述靶因子-識別分子復合物與酶接觸，其中所述酶與第二識別分子綴合，從而形成靶因子-識別分子-酶識別分子復合物； 將所述酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質接觸，從而生成葡萄糖； 檢測葡萄糖，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子。
26.權利要求25的方法，其中所述識別分子和所述第二識別分子是不同分子，但是都可特異性結合所述靶因子。
27.一種檢測靶因子的方法，其包括 將權利要求18-21任一項的一個或多個橫流裝置與樣品在足以使所述樣品中的靶因子流過所述橫流裝置并結合到存在于所述橫流裝置上的識別分子的條件下接觸； 形成靶因子-識別分子復合物，其中所述靶因子-識別分子復合物的形成導致可將物質轉化為葡萄糖的酶的釋放；使所述酶與可以被所述酶轉化為葡萄糖的物質相互作用，從而生成葡萄糖； 檢測葡萄糖，其中檢測到葡萄糖指示所述樣品中存在所述靶因子，沒有檢測到葡萄糖指示所述樣品中不存在所述靶因子。
28.權利要求24-27任一項的方法，還包括定量所述靶因子，其中檢測到的葡萄糖水平指示存在的靶因子量。
29.權利要求24-28任一項的方法，其中所述樣品包括生物樣品、食物樣品或環(huán)境樣品O
30.權利要求24-29任一項的方法，其中 所述酶包括轉化酶、蔗糖酶或蔗糖酶-異麥芽糖酶，并且可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括鹿糖，或者 所述酶包括麥芽糖酶，并且可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括麥芽糖，或者 所述酶包括海藻糖酶，并且可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括海藻糖，或者 所述酶包括纖維素酶，并且可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括纖維素，或者 所述酶包括淀粉酶，并且可被所述酶轉化為葡萄糖的所述物質包括淀粉。
31.權利要求24-30任一項的方法，其中使用個人葡萄糖計檢測所述葡萄糖。
32.權利要求24-31任一項的方法，其中所述靶因子包括金屬、微生物、細胞因子、激素、細胞、核酸分子、孢子、蛋白質、消遣藥物或毒素。
33.權利要求32的方法，其中所述金屬為 重金屬，其包括汞(Hg)、鎘(Cd)、砷(As)、鉻(Cr)、鉈(Tl)、鈾(U)、钚(Pu)或鉛(Pb)，或者 營養(yǎng)金屬，其包括鈣、鐵、鈷、鎂、錳、鑰、鋅、鎘或銅。
34.權利要求32的方法，其中所述微生物為病毒、細菌、真菌或原生動物。
35.權利要求32的方法，其中所述激素為外分泌激素。
36.權利要求32的方法，其中所述細胞為癌細胞。
全文摘要
公開了一種開發(fā)高靈敏度和選擇性傳感器的通用方法，所述傳感器僅使用個人葡萄糖計(PGM)就可以實現(xiàn)對寬范圍靶的便攜、低成本和定量檢測。所述方法使用對靶因子特異的識別分子、可將酶底物轉化為葡萄糖的酶以及PGM。還提供了傳感器，其可以包括附著有識別分子從而可檢測靶因子的固體支持物，其中所述識別分子在存在所述靶因子下可特異性結合所述靶因子，但是不顯著結合其他因子，以及可催化物質轉化為葡萄糖的酶，其中所述酶直接或間接附著到所述識別分子，其中在存在所述靶因子下所述酶可以將所述物質轉化為葡萄糖。所公開的傳感器可以是橫流裝置的一部分。還提供了使用這些傳感器檢測靶因子的方法。
文檔編號C12Q1/00GK103025885SQ201180036296
公開日2013年4月3日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權日2010年5月26日
發(fā)明者陸藝, 向宇 申請人:伊利諾伊大學評議會