專利名稱：使用光的核酸的擴(kuò)增抑制方法和高靈敏度的選擇性核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針(clamp probe)選擇性地檢測例如野生型核酸中混雜的突變型核酸的方法和試劑盒、以及具有350 380nm范圍的波長的光照射功能的核酸擴(kuò)增裝置。
背景技術(shù)：
人基因組序列解讀完畢后，將所解讀的基因信息有效用于診斷等醫(yī)療領(lǐng)域的活動進(jìn)行活躍。解讀基因組序列之后，接下來所關(guān)注的是基因表達(dá)模式分析或基因中的單堿基替換(一塩基置換)(SNPs)的分析等。研究在各種條件下表達(dá)的基因的表達(dá)量或基因突變，由此基因的功能或基因與疾病或藥物感受性的關(guān)聯(lián)日益明朗，因此與所累積的基因有關(guān)的信息不僅被用于疾病的診斷，還被用于治療方法的選擇。其中，單核苷酸多態(tài)性(一塩基多型)或突變成為疾病診斷或風(fēng)險判定等基因檢查中的重要目標(biāo)，在涉及糖尿病、風(fēng)濕病、惡性腫瘤、精神疾病、心臟病等多個方面的領(lǐng)域應(yīng)用。作為該單堿基替換的檢測方法，迄今為止開發(fā)了各種方法。具體而言，作為快速且高通量地進(jìn)行分析的方法，可以列舉:Invader法、SniPer法、TaqMan PCR法、雜交探針法、SNPIT法、焦磷酸微測序法(Pyrominisequencing法)、變性高效液相色譜(DHPLC)法、MALD1-T0F/MS 法、NanoChip 法等。在惡性腫瘤領(lǐng)域，狙擊體內(nèi)的特定分子以抑制其功能的分子靶向治療藥的開發(fā)在積極進(jìn)行，選擇治療方法時，在確定分子靶向治療藥的使用上，單堿基替換的檢測被定位成重要的檢查。例如，推薦在使用抗癌藥前實施EGFR基因或KRAS基因的突變分析檢查。其原因在于:根據(jù)是否存在突變，在藥效上存在差異，因此考慮突變以指導(dǎo)給藥。另外，通過事先研究是否存在這樣的突變，與藥物的有效性相比，還存在著選擇發(fā)生嚴(yán)重的副作用的危險性大、給藥效果差的患者的目標(biāo)。根據(jù)這樣的理由，在惡性腫瘤領(lǐng)域，特別是單堿基替換的檢測被視為重要的檢查。但是，在惡性腫瘤這樣的后發(fā)突變的檢測中，由于以來自占據(jù)多半檢體材料的正常細(xì)胞的野生型核酸分子為背景(background)，因此在上述的分析方法中，往往無法檢測單堿基替換等的突變。為了解決這個問題，人們開發(fā)了 Scorpion-ARMS法或PNA-LNA PCRClamping法(專利文獻(xiàn)I)。Scorpion-ARMS法是指，利用以突變點位于引物的3’末端附近的方式與突變型序列一并制備的該引物和另一個引物的組合，選擇性地擴(kuò)增突變型分子，再通過Scorpion法這種熒光檢測法分析該擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。PNA-LNA PCR Clamping法是指，利用設(shè)計在突變點上的與野生型序列互補(bǔ)的發(fā)夾引物選擇性地封閉(block)野生型分子，以突變型LNA作為熒光檢測探針，選擇性地擴(kuò)增并檢測突變型分子的方法。上述方法均利用已形成雜交體(〃 4 7'.； 'y K )的引物或探針和模板分子在平衡系統(tǒng)中的熱穩(wěn)定性之差， 無論是在引物或探針與模板分子完全互補(bǔ)的情況下形成雜交體、還是在引物或探針與模板分子有I個或多個堿基不互補(bǔ)的情況下形成不完全的雜交體，其不同之處也不過是熱穩(wěn)定性的不同。因此，區(qū)別兩者的適當(dāng)?shù)臈l件根據(jù)目標(biāo)堿基序列而不同，即使在更適當(dāng)?shù)臈l件下，使熱穩(wěn)定性發(fā)生變化的條件對兩者幾乎均等地發(fā)揮作用。即，只要是僅以平衡系統(tǒng)中的雜交體形成的熱穩(wěn)定性之差作為區(qū)別兩者的原理，就無法設(shè)定在特異性和靈敏度的均衡上妥協(xié)的溫度條件，而且尚需說明的是，可以設(shè)定的溫度條件的范圍往往非常窄，因此，存在著根據(jù)基因序列難以設(shè)計探針或引物的情形。鑒于上述檢測技術(shù)的狀況，目前在惡性腫瘤的突變檢測檢查中，對檢查材料的采集設(shè)有嚴(yán)密的限制。具體而言，推薦由癌癥組織制作病理標(biāo)本，再由染色標(biāo)本鑒定腫瘤部位，之后由連續(xù)切片的未染色標(biāo)本只集中在腫瘤部分(關(guān)于大腸癌患者的KRAS基因突變測定的指南)。但是，在腫瘤部位的鑒定中，需要組織形態(tài)學(xué)的專業(yè)知識、且操作繁雜，而且在成本方面負(fù)擔(dān)大。因此，人們要求確立不怎么受作為檢查要件的檢查材料的采集或靶基因的堿基序列所帶來的限制、且兼具特異性和靈敏度的檢測方法。作為兼具特異性和靈敏度的檢測方法，人們開發(fā)了利用光連接性核酸類的突變基因的檢測方法。例如，專利文獻(xiàn)2中記載著:基于使特定的堿基序列的靶核酸與互補(bǔ)鏈形成雜交體的原理，同時兼具高特異性和靈敏度來進(jìn)行檢測的方法。其依據(jù)于下述方法:由與靶核酸互補(bǔ)的光連接性核酸類和在3’末端或5’末端具有可以與該光連接性核酸類進(jìn)行光連接的堿基部分的被光連接性核酸類構(gòu)成，且該核酸類中的任一方具有標(biāo)記部分、而剩下的一方被固定在基材上的方法。根據(jù)該方法，位于同一條鏈上的光連接性核酸類和被光連接性核酸類利用光連接只在形成完全的雜交體時特異性地進(jìn)行光連接，可以將具有標(biāo)記部分的核酸分子以共價鍵固定在基材上，可以在互補(bǔ)的雙鏈發(fā)生解離的條件下進(jìn)行徹底的清洗，可以兼具高特異性和靈敏度(S/N比)。但是，在檢測靈敏度上有限度，該方法的使用目的在于:檢測包含在大量的靶核酸中的突變是否存在，但為了 檢測大量的野生型核酸中混雜的微量突變型核酸，該微量的突變型核酸的存在量往往在檢測靈敏度以下，因此無法使用。另外，由于光連接性核酸類與同鏈的被連接核酸形成共價鍵，因此還無法擴(kuò)增想要檢測的靶核酸中所含的突變。另一方面，專利文獻(xiàn)3中記載著下述方法:首先，通過PCR擴(kuò)增包含靶核酸的樣品，對于該樣品，結(jié)合專利文獻(xiàn)2的方法，檢測核酸樣品中的具有I個或2個以上的靶核苷酸序列的核酸。當(dāng)突變型核酸的比例為微量時，即使通過PCR可以擴(kuò)增，但與野生型核酸的含有比例也不會發(fā)生變化，通過在試管內(nèi)可以進(jìn)行檢測的范圍的擴(kuò)增，無法將突變型核酸擴(kuò)增至可以檢測的程度。該方法的使用目的在于:檢測包含在大量的靶核酸中的突變是否存在，但無法用于檢測大量的野生型核酸中混雜的微量突變型核酸。另外，為了通過PCR擴(kuò)增包含靶核酸的樣品，只要在某種程度上提高突變型核酸的含有比例，就有可能檢測到突變型核酸，但步驟多、繁雜，無法滿足要求快速的檢查結(jié)果的臨床現(xiàn)場的迫切需要?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:日本專利第4216266號說明書；
專利文獻(xiàn)2:W02007/058326號公報；
專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-213445號公報。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
本發(fā)明的目的在于提供:在核酸樣品中，檢測野生型核酸組中微量混雜的突變型核酸時，快速而簡便，且兼具高特異性和靈敏度的方法。解決課題的方法
本發(fā)明人為了解決上述課題反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過將包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與具有靶位點序列的野生型核酸進(jìn)行光連接，可以選擇性地阻止野生型核酸的擴(kuò)增，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸的序列的靶位點互補(bǔ)的序列。即，通過使用光連接性發(fā)夾探針，只在形成完全的雜交體時特異性地進(jìn)行光連接，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的溫度循環(huán)的任一個步驟中也保持連接、即處于非平衡狀態(tài)，從而可以阻止靶分子在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中作為模板的作用。由此，可以兼具野生型核酸的高聚集(々9 > C 7，clumping)(抑制)效果和突變型核酸的選擇性(特異性)核酸擴(kuò)增。本發(fā)明涉及下述[I] [15]:
[1]使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類的發(fā)夾探針共存，通過光照射使該具有 靶位點的核酸與該發(fā)夾探針進(jìn)行光連接，抑制由核酸擴(kuò)增法引起的包含靶位點的檢測區(qū)的擴(kuò)增的方法；
[2]突變型核酸檢測方法，該方法通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列；
步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應(yīng)產(chǎn)物供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)；
步驟(d):分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物；
[3]突變型核酸檢測方法，該方法通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列；
步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行上述步驟(a)、(b)；
步驟(d):分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物；
[4][I] [3]中任一項的方法，其中，上述核酸擴(kuò)增法為PCR法；
[5][I] [3]中任一項的方法，其中，上述核酸擴(kuò)增法為實時PCR法；
[6][I] [3]中任一項的方法，其中，上述發(fā)夾探針具有與靶核酸分子的有義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的序列；
[7][I] [6]中任一項的方法，其中，上述發(fā)夾探針的鏈長為7 30 ;
[8][I] [7]中任一項的方法，其中，上述光照射通過350 380nm范圍的波長來進(jìn)行；[1] [8]中任一項的方法，其中，上述光照射在通常的互補(bǔ)鏈彼此之間結(jié)合和解離的溫度循環(huán)中在互補(bǔ)鏈彼此之間可以結(jié)合的溫度下進(jìn)行I次以上；[1] [9]中任一項的方法，其中，上述光照射通過賦予了 350 380nm范圍的波長的光照射功能的核酸擴(kuò)增裝置來進(jìn)行；試劑盒，其中包含發(fā)夾探針和擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)的引物，所述發(fā)夾探針包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類，該試劑盒抑制由基因擴(kuò)增法引起的包含靶位點的檢測區(qū)的擴(kuò)增；突變型核酸檢測試劑盒，其中包含發(fā)夾探針和擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)的引物，所述發(fā)夾探針包含具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類，該試劑盒通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸；核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能；核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能，該裝置包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與靶位點互補(bǔ)的序列；步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接；步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應(yīng)產(chǎn)物供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)；核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能，該裝置包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與靶位點互補(bǔ)的序列；步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接；步驟(C):在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行上述步驟(a)、(b)。發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以兼具高靈敏度和特異性、且快速及簡便地檢測核酸樣品中是否存在混雜的突變型核酸。


圖1是3-氰基乙烯基咔唑-1’ -脫氧核苷(CNVK)的結(jié)構(gòu)式；
圖2是顯示實施例1中實施的、使用LightCycler確認(rèn)是否存在由光連接反應(yīng)引起的野生型基因的PCR擴(kuò)增抑制的結(jié)果的曲線圖3是顯示實施例2中實施的、使用LightCycler確認(rèn)是否存在由光連接反應(yīng)引起的突變型基因的PCR擴(kuò)增抑制的結(jié)果的曲線圖4是顯示實施例4中實施的、通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)在PCR擴(kuò)增反應(yīng)時進(jìn)行光連接反應(yīng)的情況下是否存在突變型基因的選擇性擴(kuò)增的結(jié)果的圖。泳道I為標(biāo)志物(φ X174 HaeIII消化液)，泳道2為野生型，泳道3為突變型；
圖5是顯示實施例5中實施的、使用LightCycler確認(rèn)作為對照的在PCR擴(kuò)增反應(yīng)時未進(jìn)行光連接反應(yīng)的情況下突變型基因的檢測靈敏度的結(jié)果的曲線 圖6是顯示實施例5中實施的、使用LightCycler確認(rèn)作為比較例的(在PCR擴(kuò)增反應(yīng)時未進(jìn)行光連接反應(yīng))PNA-LNA Clamp PCR反應(yīng)的突變型基因的檢測靈敏度的結(jié)果的曲線 圖7是顯示實施例5中實施的、使用LightCycler確認(rèn)在PCR擴(kuò)增反應(yīng)時進(jìn)行光連接反應(yīng)的情況下突變型基因的檢測靈敏度的結(jié)果的曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明中，關(guān)于DNA、RNA、核酸、基因、基因表達(dá)、編碼、互補(bǔ)、模板、啟動子、探針、弓丨物、雜交、PCR等用語的定義，與目前分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因工程學(xué)等中通常廣泛使用的用語意思相同。本發(fā)明中，對核酸沒有特別限定，只要是DNA或RNA、或后述的核苷酸類似物即可，可以是天然的核酸，也可以是合成的核酸。作為天然的核酸，例如有從生物中回收的基因組DNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等。作為合成的核酸，有利用β ~氰基乙基亞磷酰胺法、DNA固相合成法等公知的化學(xué)合成法合成的DNA、或利用PCR等公知的核酸擴(kuò)增法合成的核酸、利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA等。本發(fā)明中，“野生型核酸”是指發(fā)生突變之前的核酸，其典型的例子為:未發(fā)生突變、且包含具有本來的正常功能的遺傳信息的核酸。這里所說的遺傳信息不僅包括編碼mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等信息的轉(zhuǎn)錄區(qū)，還包括啟動子等的基因表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明中，“突變型核酸”是指發(fā)生了突變的核酸?！巴蛔儭笔侵窪NA或RNA等的核酸序列的變化，遺傳學(xué)等中使用的堿基取代(塩基置換)、插入、缺失、逆位、重復(fù)、易位等符合。在該突變型核酸中，突變所存在的區(qū)域不僅包括轉(zhuǎn)錄區(qū)，還包括啟動子等的基因表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)區(qū)。需要說明的是，通過突變，突變型核酸未必具有功能上的變化。另外，“突變”既包括先天的突變，也包括 后天的突變。本發(fā)明中，“靶位點”是指，核酸序列中作為包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針的靶的位點，該位點具有與該發(fā)夾探針的全部或一部分雜交的核苷酸序列。在通常的實施方案中，“靶位點”是指突變型核酸中發(fā)現(xiàn)突變的堿基所存在的位點，包括野生型核酸，而在本發(fā)明中是指作為檢測目標(biāo)的位點。例如，當(dāng)存在堿基取代時，在野生型核酸、突變型核酸中均為該堿基取代了的堿基符合。當(dāng)存在插入時，在突變型核酸中，被插入的堿基符合，在野生型基因中，突變型核酸中插入有堿基的位點符合。當(dāng)存在缺失時，在突變型核酸中，通過缺失而失去了堿基的位點符合，在野生型核酸中，突變型核酸中失去的堿基符合。該靶位點的序列可以是顯示出具有編碼遺傳信息的序列的鏈(以下稱作有義鏈)的序列，也可以是顯示出具有與有義鏈互補(bǔ)的序列的鏈(以下稱作反義鏈)的序列。本發(fā)明中，“核酸擴(kuò)增反應(yīng)”是指，利用公知的聚合酶反應(yīng)進(jìn)行的模板核酸的擴(kuò)增反應(yīng)?！昂怂釘U(kuò)增裝置”是指進(jìn)行“核酸擴(kuò)增反應(yīng)”的裝置。本發(fā)明的擴(kuò)增抑制方法是指，使用可以擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)的引物實施普通的核酸擴(kuò)增法時，根據(jù)上述靶位點的突變，抑制一種核酸(例如野生型核酸)的擴(kuò)增，而只選擇性地擴(kuò)增其以外的核酸(例如突變型核酸)的方法。
在本發(fā)明中，以野生型核酸或突變型核酸中的任一種作為擴(kuò)增抑制的對象，或者根據(jù)其目的可以適當(dāng)選擇，沒有特別限定，但是例如核酸樣品中的存在比具有大的偏差時，通過抑制大量存在的核酸(例如野生型核酸)的擴(kuò)增、而只選擇性地擴(kuò)增微量存在的核酸(例如突變型核酸)，可以檢測是否有微量存在的核酸。以下，關(guān)于本發(fā)明方法，主要基于本發(fā)明的一個方案、即檢測是否存在突變型核酸的突變型核酸檢測方法進(jìn)行說明，如上所述，本發(fā)明方法的本質(zhì)在于:使用可以擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)的引物，在實施普通的核酸擴(kuò)增法時，基于上述靶位點的突變，只對一種核酸可以抑制其擴(kuò)增。作為本發(fā)明方法的第I實施方式，涉及突變型核酸檢測方法，該方法是通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸的序列的靶位點互補(bǔ)的序列；
步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應(yīng)產(chǎn)物供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)；
步驟(d):分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物。作為本發(fā)明方法的第2實施方式，涉及突變型核酸檢測方法，該方法是通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟:
步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸的序列的靶位點互補(bǔ)的序列；`
步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行上述步驟(a)、(b)；
步驟(d):分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物。通過上述步驟，抑制野生型核酸的擴(kuò)增，選擇性地擴(kuò)增突變型核酸，從而可以高靈敏度地檢測突變型核酸。以下，對每一個步驟進(jìn)行說明。需要說明的是，除步驟(C)以外，第I實施方式與第2實施方式相同，所以以下在主要按照第I實施方式進(jìn)行說明后，關(guān)于第2實施方式，列舉與第I實施方式的不同點進(jìn)行說明。在步驟(a)中，使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有野生型核酸序列的靶核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸的序列的靶位點互補(bǔ)的序列。該反應(yīng)可以在適合形成雜交體的通常條件(溫度、pH、鹽濃度、緩沖液等)下進(jìn)行，但通過在反應(yīng)液中加入二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺等，還可以促進(jìn)發(fā)夾探針與野生型核酸特異性地形成雜交體。但優(yōu)選避免混入阻礙之后或同時進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)。特別是與核酸擴(kuò)增反應(yīng)同時進(jìn)行時，優(yōu)選為適合核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)組成。步驟(a)中使用的“核酸樣品”，只要是含有核酸、且有可能含有包含靶位點的核酸的樣品即可，沒有特別限定，但優(yōu)選有可能含有具有靶位點的野生型核酸或其突變型核酸的至少一種的樣品，進(jìn)一步優(yōu)選為有可能含有上述兩者的樣品。例如，以血液或組織等作為樣品，由樣品中的全細(xì)胞得到的基因組DNA或RNA符合。該核酸的提取可以通過苯酚/氯仿法等公知的方法進(jìn)行。此時，作為檢測對象的靶核酸中的突變型的存在率沒有限定。例如，可以100%為野生型，也可以50%為野生型、剩下的50%為突變型。另外，該核酸樣品可以是由細(xì)胞得到的基因組DNA，也可以是由細(xì)胞制備的mRNA，還可以是以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA。而且，可以是將克隆化的多個基因進(jìn)行人工混合得到的樣品，還可以是通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)人工擴(kuò)增的核酸或它們的混合物。作為本發(fā)明中可以使用的光連接性核酸類，只要是通過光連接可以與靶位點的核酸或靶位點附近的核酸交聯(lián)即可。例如可以使用:補(bǔ)骨脂素衍生物(Chang，E.等人.Biochemistry 1991，30, 8283)或氨基嘌呤衍生物(日本特開2001-206896)或4-硫尿嘧啶等。上述補(bǔ)骨脂素衍生物具有與作為5’ -AT-3’的堿基序列的胸腺嘧啶進(jìn)行特異性反應(yīng)的性質(zhì)，另外，氨基嘌呤衍生物雖然不存在序列依賴性，但卻是胞苷特異性，因此適用范圍存在一定的限制，所以更優(yōu)選不存在上述限制的下述光連接性核酸類。作為優(yōu)選使用的第I光連接性核酸類，可以列舉具有式I所表示的基團(tuán)作為堿基部分的核酸類(Org.Lett.,第 10 卷，N0.15，2008，日本特開 2009-254279):
權(quán)利要求
1.使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類的發(fā)夾探針共存，通過光照射使該具有靶位點的核酸與該發(fā)夾探針進(jìn)行光連接，抑制由核酸擴(kuò)增法引起的包含靶位點的檢測區(qū)的擴(kuò)增的方法。
2.突變型核酸的檢測方法，該方法是通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟: 步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列； 步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應(yīng)產(chǎn)物供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)； 步驟(d):分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.突變型核酸檢測方法，該方法是通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟: 步驟(a):使包含光連接性核酸類的發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列； 步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行上述步驟(a)、(b)； 步驟(d):分析上述擴(kuò) 增產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述核酸擴(kuò)增法為PCR法。
5.權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述核酸擴(kuò)增法為實時PCR法。
6.權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述發(fā)夾探針具有與靶核酸分子的有義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的序列。
7.權(quán)利要求1 6中任一項所述的方法，其中，上述發(fā)夾探針的鏈長為7 30。
8.權(quán)利要求1 7中任一項所述的方法，其中，上述光照射通過350 380nm范圍的波長來進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1 8中任一項所述的方法，其中，上述光照射在通常的互補(bǔ)鏈彼此之間結(jié)合和解離的溫度循環(huán)中在互補(bǔ)鏈彼此之間可以結(jié)合的溫度下進(jìn)行I次以上。
10.權(quán)利要求1 9中任一項所述的方法,其中，上述光照射通過賦予了350 380nm范圍的波長的光照射功能的核酸擴(kuò)增裝置來進(jìn)行。
11.試劑盒，其中包含發(fā)夾探針和引物，所述發(fā)夾探針包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類，所述引物擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)，該試劑盒抑制由基因擴(kuò)增法引起的包含靶位點的檢測區(qū)的擴(kuò)增。
12.突變型核酸檢測試劑盒，其中包含發(fā)夾探針和引物，所述發(fā)夾探針包含具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類，所述引物擴(kuò)增包含靶位點的檢測區(qū)，該試劑盒通過選擇性地擴(kuò)增包含突變型核酸的靶位點的檢測區(qū)，來檢測是否存在該突變型核酸。
13.核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能。
14.核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能，該裝置包括下述步驟: 步驟(a):使發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的核酸分子特異性地形成雜交體，所述發(fā)夾探針包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類； 步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應(yīng)產(chǎn)物供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
15.核酸擴(kuò)增裝置，該裝置具有350 380nm范圍的波長的光照射功能，該裝置包括下述步驟: 步驟(a):使發(fā)夾探針與核酸樣品共存，使發(fā)夾探針與具有靶位點的核酸分子特異性地形成雜交體，所述發(fā)夾探針包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類； 步驟(b):對已形成雜交體的發(fā)夾探針和靶核酸分子進(jìn)行光照射，使之進(jìn)行光連接； 步驟(C):在核酸擴(kuò)增 反應(yīng)中進(jìn)行上述步驟(a)、(b)。
全文摘要
本發(fā)明提供在核酸樣品中，檢測野生型核酸組中微量混雜的突變型核酸時，快速而簡便、且兼具高特異性和靈敏度的方法。在本發(fā)明方法中，使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補(bǔ)的序列的光連接性核酸類的發(fā)夾探針共存，通過光照射使該具有靶位點的核酸與該發(fā)夾探針進(jìn)行光連接，抑制由核酸擴(kuò)增法引起的包含靶位點的檢測區(qū)的擴(kuò)增。
文檔編號C12N15/09GK103080310SQ20118004335
公開日2013年5月1日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者寺崎浩司, 今野玄理, 島津光伸, 藤本健造, 坂本隆 申請人:三菱化學(xué)美迪恩斯株式會社