一種鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對(duì)鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì)鴨肉源 性成分核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速定性檢測(cè)。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，肉制品摻假問(wèn)題在社會(huì)上引起極大的關(guān)注。2013年，涉及歐洲16國(guó)的"馬 肉風(fēng)波"震驚整個(gè)歐洲。在我國(guó)，肉類(lèi)摻假摻雜事件近年來(lái)被媒體多次曝光。在山東、陜西 和河南等地陸續(xù)出現(xiàn)使用鴨肉冒充牛羊肉的報(bào)道，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及個(gè)別不法商家或個(gè)人將大 量鴨肉和少量牛羊脂肪、下腳料混合在一起作為牛羊肉出售，賺取高額利潤(rùn)。
[0003] 目前，普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR是肉制品品種鑒別最常用的方法，普通PCR法 具有耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，靈敏度不夠，容易產(chǎn)交叉污染等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR法則具有成本 昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求高，需要大型的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，因此其應(yīng)用仍存在一定的局限性。 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后近年發(fā)展起來(lái)的一種新的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)研 制了恒溫?cái)U(kuò)增鴨肉源性成分核酸，并結(jié)合核酸試紙條顯色來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，且整個(gè)反應(yīng)過(guò) 程不打開(kāi)反應(yīng)管蓋子，試紙條流動(dòng)檢測(cè)過(guò)程密閉，杜絕了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染外界的可能性。 研究表明該鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增-核酸試紙條檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度 高、對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，所以非常適用在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)使用，同時(shí)在農(nóng)貿(mào) 市場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)上也具有很好的應(yīng)用前景。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢 測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下 組成：
[0007] (1)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò) 增引物、lXThermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和無(wú)菌雙蒸水；其中：
[0008] 所述的外圍引物分別為：
[0009] 所述正向外圍引物為：5' -TGTCCGACGTGACTAGCT-3'(SEQIDN0. 2);
[0010] 反向外圍引物為：5' -CAGAGGCGCCAAAAAGCT-3'(SEQIDNO. 3)；
[0011] 所述兩條探針的序列分別為：
[0012] 正向 5，端Biotin標(biāo)記探針：5，-Biotin-GGCGCAAAAATGTGAGGAGG-3r(SEQID NO. 4)；
[0013] 反向 5' 端Fite標(biāo)記探針：5，-Fitc-AAAGTGGCATCTGTGGAATACTTC-3，（SEQID NO. 5)；
[0014] 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：
[0015] 擴(kuò)增正向引物：
[0016] 5r -GCCCTGACCGAGGAACCAGAGCCCATACGTTCCCCCTA-3r(SEQIDNO. 6)；
[0017] 擴(kuò)增反向引物：
[0018] 5，-TTCACTCACCTCTCCTTGCCCTGCCGCGATTACGCATTGA-3'(SEQIDNO.7);
[0019] (2)陽(yáng)性對(duì)照：含有鴨屬特異性的D-L〇〇p基因片段的DNA質(zhì)粒；
[0020] ⑶陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。
[0021] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的 1XThermolbuffer組成為：20mM的Tris-HCl、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S04、2mM的MgS04&及質(zhì)量濃度為 0.1% 的TritonX-100，pH7.8。
[0022] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照為含有長(zhǎng)199bp的鴨屬特異性的D-L〇〇p基因序列的
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：
[0024] 以包含擴(kuò)增區(qū)域的鴨屬特異性的D-L〇〇p基因片段為模板，通過(guò)兩條外圍引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將 純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Promega)構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì) 粒序列，用分光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A2S。定量并稀釋至10個(gè)拷貝/μ1，獲得陽(yáng)性對(duì) 照，-20 °C保存。
[0025] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自5. 7nmol，兩條探 針各自 11. 4nmol，兩條交叉引物各自 22. 8nmol，IXThermolbuffer，]\%304為 0.2μmol， dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，無(wú)菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25μ1。
[0026] 本發(fā)明還提供一種所述鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng) 用為：
[0027] a)提取待檢測(cè)標(biāo)本中DNA:剪取約米粒大小的鴨肉樣品，加入500μL雙蒸水后振 蕩15s，于95°C作用5min，離心后取上清，即獲得DNA;
[0028] b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 65 °C下擴(kuò)增反應(yīng)30分鐘；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板（即陽(yáng)性對(duì)照）加入陽(yáng)性對(duì)照PCR管中，標(biāo)準(zhǔn)陰性模 板（即陰性對(duì)照）加入陰性對(duì)照PCR管中，所述標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板為含有鴨屬特異性的D-L〇〇p 基因片段的DNA質(zhì)粒，所述標(biāo)準(zhǔn)陰性模板為無(wú)菌雙蒸水；
[0029] c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公 司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線(xiàn)呈陽(yáng)性時(shí)（C、T線(xiàn)均為 紅色），說(shuō)明樣品中含有鴨肉源性成分核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序有 樣品墊、有色顆粒結(jié)合物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設(shè)有檢 測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，其中有色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗Fite抗體包被，檢測(cè)線(xiàn)上有親和 素包被，質(zhì)控線(xiàn)上有抗Fite抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0030] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測(cè)探針。本試 劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA 合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。在本發(fā)明提供的鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中， 對(duì)不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本 發(fā)明與核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的 方法。該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出1個(gè)拷貝，可以滿(mǎn)足快速檢測(cè)鴨肉源性 成分核酸的要求。
[0031] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0032] (1)本發(fā)明簡(jiǎn)化了肉樣品核酸的提取方法，減低了成本，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí) 間。
[0033] (2)所述鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟簡(jiǎn) 單，可重復(fù)性高；
[0034] (3)反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需40分鐘左右；
[0035] (4)整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中不需要打開(kāi)PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)；整 個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為核酸檢測(cè)試紙條原理示意圖。
[0037] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)鴨肉源性成分核酸的特異性，圖中1-7分別表示鴨 肉、雞肉、豬肉、牛肉、羊肉、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品。
[0038] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)鴨肉源性成分核酸的靈敏度，圖中1-7分別表示104 拷貝/微升、1〇3拷貝/微升、10 2拷貝/微升、10 1拷貝/微升、10 °拷貝/微升、10 1拷貝/ 微升、陰性對(duì)照品。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0040] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0041] a)鴨肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：兩條外圍引物（5. 7nmol)，兩條探針 (11.4nmol)和兩條交叉引物（22.8nmol)，lXThermolbufTer，MgS04(0.2ymol)，dNTPs溶 液（各35pmol)，BstDNA聚合酶（8U)和無(wú)