專利名稱：一種鼠尾膠原蛋白的制備方法
一種鼠尾膠原蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠尾膠原蛋白的制備方法。尤其涉及一種鼠尾膠原蛋白適合的工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種重要的功能性蛋白質(zhì)，膠原蛋白含有一種獨(dú)有的氨基酸——羥脯氨酸(Hyp)，膠原蛋白與細(xì)胞增生、分化、運(yùn)動(dòng)、免疫、關(guān)節(jié)潤(rùn)滑等密切相關(guān)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工、生物合成等領(lǐng)域，如醫(yī)用膠囊、食用明膠、照相明膠、化妝品等。鼠尾膠原蛋白是膠原蛋白的一種，主要為I型膠原蛋白。I型膠原主要存在于真皮、腱、骨、牙本質(zhì)。最普遍的以纖維形式形成膠原，由三股纏繞形成多肽鏈組。鼠尾膠原蛋白可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)一些在普通細(xì)胞培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細(xì)胞；也可以用于制備三維膠， 模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。目前，提取鼠尾膠原蛋白的研究并不多， 主要采用的還是傳統(tǒng)的方法，比如酸溶法、堿溶法、超聲法、中性鹽法、酶法等等，但是都有其缺點(diǎn)。其中酸溶法、堿溶法、超聲法、中性鹽法不僅存在提取得率低，還可能破壞膠原蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。酶法應(yīng)用較廣，但是除去酶制劑需要酶抑制劑，且操作復(fù)雜，同時(shí)增加了后期分離純化鼠尾膠原蛋白的難度。迄今為止，還沒有針對(duì)鼠尾膠原蛋白進(jìn)行過(guò)大規(guī)模制備的相關(guān)研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有制備鼠尾膠原蛋白方法所存在的提取得率低、分離純化工藝復(fù)雜、沒有大規(guī)模生產(chǎn)的方法等缺點(diǎn)，提供一種工藝簡(jiǎn)單、提取率高、提取的產(chǎn)品純度高的鼠尾膠原蛋白的制備方法。本發(fā)明的制備方法包括如下步驟I、緩沖溶液的準(zhǔn)備和配置0. l-5mol/L NaCl 溶液、O. 01-0. 2mol/L Tris-HCl 緩沖鹽溶液、O. 05-2mol/L醋酸溶液。2、從鼠尾中分離出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置與0-10°C下的O. 01-0. 2mol/L Tris-HCl緩沖鹽溶液，所抽提的尾腱呈銀白色的絲狀。3、0_10°C下預(yù)處理4-36小時(shí)，期間定時(shí)攪拌，除去中性條件下可溶解的糖蛋白和其他雜蛋白。將處理過(guò)后的尾腱濾干水分，稱重。以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10°C下的O. 05-2mol/L醋酸溶液。4、以I 1000-1 50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小時(shí)加完。期間不間斷攪拌至所有尾腱均被酶解呈現(xiàn)乳膠狀。酶解持續(xù)36-144小時(shí)。5、將乳膠狀溶液于0-10°C條件下離心10-40分鐘，除去不呈現(xiàn)乳膠狀的固化物。 往乳膠溶液中以I : 0.5-1 2的體積配比加入O. 01-0. lmol/L醋酸溶液。攪拌至膠狀溶液成分混勻。6、加入O. l-5mol/L NaCl溶液至乳膠狀溶液并不斷攪拌至有白色絮狀沉淀在溶液中不再析出為止。高速離心溶液20-50min。收集沉淀。將乳膠溶液以I : 0.5-1 4的體積比的量加入O. l-5mol/L NaCl溶液，于0_10°C下放置6_48h。次日重復(fù)步驟6。7、集中步驟6中收集到的沉淀。用O. 01_2mol/L醋酸溶液重復(fù)溶解后加入 O. l-5mol/L NaCl溶液再次析出膠原蛋白。高速離心溶液20_50min。收集沉淀。重復(fù)此步驟1-5次直至所沉淀的膠原蛋白能夠完全溶解。8、將純化完全的膠原蛋白用O. 01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于萬(wàn)級(jí)分子量截留的透析袋中透析48-96h。每天換水2-8次。透析外液用雙蒸水進(jìn)行。9、將透析完全的膠原蛋白溶液分裝入20mL每瓶的小型玻璃瓶，_40°C _0°C條件下進(jìn)行冷凍干燥48-144h。凍干產(chǎn)品即為鼠尾膠原蛋白凍干粉。依照本發(fā)明專利使用的酸聯(lián)合酶法提取工藝，每只鼠尾大約可以提取膠原蛋白 200mg,與傳統(tǒng)的酸溶法、堿溶法及中性鹽法相比較(IOmg)，提取率有了大幅度的提高。本發(fā)明的鼠尾來(lái)自于成年各品系大鼠鼠尾(如ACI、BVF、F344、PA、M520、WAB、WAC、 WKA、SD、RF、Wistar 等品系)、各品系小鼠鼠尾等(C3H、CBA/N、C57BL/6、C57BL/10、C57L、 DBA/2、A、AKR、BALB/c、RF、SffR 等品系)。為了保證制備的鼠尾膠原蛋白的質(zhì)量，本發(fā)明涉及的鼠尾膠原蛋白的提取也可以來(lái)自于SPF級(jí)(無(wú)特定病原體)成年SD大鼠鼠尾。前述步驟4中胃蛋白酶三次加入的時(shí)間和量分別是首次加入三分之一，后1-12小時(shí)后加入三分之一，12-36小時(shí)后加入剩余三分之一。前述步驟4中胃蛋白酶的配比為I : 10000，酶解持續(xù)72小時(shí)。前述步驟5中離心轉(zhuǎn)速為1000-10000rpm/min,前述步驟6中高速離心轉(zhuǎn)速為 4000-12000rpm/min,前述步驟 7 中高速離心轉(zhuǎn)速 4000-12000rpm/min。前述步驟8中，透析時(shí)，采用搖床，低速(1-5轉(zhuǎn)/min)，采用硝酸銀溶液檢驗(yàn)透析外液無(wú)沉淀，表明透析完成。本發(fā)明聯(lián)合酸法提取的溫和操作工藝及酶法操作的高效率，避開了使用單一提取方法所產(chǎn)生的提取率低、分離純化困難等問(wèn)題。聯(lián)合使用此兩種方法，并通過(guò)“分級(jí)鹽析”、 “微波萃取”等新工藝的方法簡(jiǎn)化了后期蛋白質(zhì)分離純化的工藝及操作流程。本發(fā)明簡(jiǎn)化了提取工藝，每條大鼠鼠尾平均重5g，可以提取到干重為200mg的鼠尾膠原蛋白，提取率約為4%左右。較傳統(tǒng)的方法提取率僅為0.2%，提取率提高了 20倍以上。本發(fā)明所提取的鼠尾膠原蛋白經(jīng)過(guò)如下鑒定=(I)SDS-PAGE電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定，其制備的鼠尾膠原蛋白以美國(guó)SIGMA公司的鼠尾膠原蛋白產(chǎn)品為對(duì)照， 與現(xiàn)有SMGA公司的商業(yè)化鼠尾膠原蛋白進(jìn)行了對(duì)比，兩者圖譜無(wú)差異。從電泳結(jié)果上可以看出，制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，純度好。其電泳結(jié)果一致。Maker檢測(cè)，三條帶的分子量分別為220KD，105KD, 95KD。(2)樣品經(jīng)水解，經(jīng)高壓液相色譜檢驗(yàn)(樣品處理按GB/T 5009. 124-2003水解，檢測(cè)方法按JY/T 024-1996)，采用氨基酸分析儀，經(jīng)廣州市分析檢測(cè)中心對(duì)本專利中制備的鼠尾膠原蛋白進(jìn)行氨基酸含量分析表明，其含有①膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸，含量約為8%左右其不含胱氨酸、色氨酸這兩種氨基酸，與其自身特征相符；③甘氨酸含量接近總氨基酸含量的三分之一，與其自身特征相符。制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，純度好。
圖I為本發(fā)明的SDS-PAGE電泳圖，其中靠左邊二條帶為市售SIGMA公司鼠尾膠原蛋白的電泳帶，第三、四條為實(shí)施例I的電泳帶，第五、六條為實(shí)施例2的電泳帶，靠右邊二條帶為實(shí)施例3的電泳帶。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施方式實(shí)施例I :鼠尾膠原蛋白的制備本發(fā)明涉及的鼠尾膠原蛋白的提取來(lái)自于SPF級(jí)(無(wú)特定病原體)成年SD大鼠鼠尾。短頸處死大鼠。機(jī)械方法取下SD大鼠鼠尾。用醫(yī)用剪刀拋開外部皮膚，取出整根裸露的大鼠尾。將大鼠尾骨分小段折斷但不斷開。用醫(yī)用止血鉗從鼠尾根部較粗的地方抽提鼠尾腱。本發(fā)明的鼠尾膠原蛋白提取包括以下步驟I、緩沖溶液的準(zhǔn)備和配置0. l-5mol/L NaCl 溶液、O. 01-0. 2mol/LTris_HCl 緩沖鹽溶液、O. 05-2mol/L醋酸溶液。2、從鼠尾中分離出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置與4°C下的O. 01-0. 2mol/ LTris-HCl緩沖鹽溶液，所抽提的尾腱呈銀白色的絲狀。3、0-10°C下預(yù)處理24小時(shí)，期間定時(shí)攪拌，除去中性條件下可溶解的糖蛋白和其他雜蛋白。將處理過(guò)后的尾腱濾干水分，稱重。以每克鼠尾腱配置50mL，置于4°C下的 O. 5mol/L醋酸溶液。4、以I : 10000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入(首次加入三分之一后 1-12小時(shí)后加入三分之一，12-36小時(shí)后加入剩余三分之一)。期間不間斷攪拌至所有尾腱均被酶解呈現(xiàn)乳膠狀。酶解持續(xù)72小時(shí)。5、將乳膠狀溶液于0-10°C條件下6000rpm/min離心30分鐘，除去不呈現(xiàn)乳膠狀的固化物。往乳膠溶液中以I : 0.5-1 2的配比加入O. 01-0. lmol/L醋酸溶液。攪拌至膠狀溶液成分混勻。6、加入O. l-5mol/LNaCl溶液至乳膠狀溶液并不斷攪拌至有白色絮狀沉淀在溶液中不再析出為止。8000rpm/min高速離心溶液30min。收集沉淀。將乳膠溶液以 I O. 5-1 4的量加入O. l-5mol/L NaCl溶液，于0-10°C下放置6_48h。次日重復(fù)步驟 6。7、集中步驟6中收集到的沉淀。用O. 01_2mol/L醋酸溶液重復(fù)溶解后加入 O. l-5mol/L NaCl溶液再次析出膠原蛋白。8000rpm/min高速離心溶液30min。收集沉淀。 重復(fù)此步驟1-5次直至所沉淀的膠原蛋白能夠完全溶解。8、將純化完全的膠原蛋白用O. 01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于萬(wàn)級(jí)分子量截留的透析袋中透析72h。每天換水2-8次。透析用雙蒸水進(jìn)行。采用搖床，低速(1-5轉(zhuǎn) /min)，采用硝酸銀溶液檢驗(yàn)透析外液無(wú)沉淀，表明透析完成。9、將透析完全的膠原蛋白溶液分裝入20mL每瓶的小型玻璃瓶，_40°C _0°C條件下進(jìn)行冷凍干燥48-144h。凍干產(chǎn)品即為鼠尾膠原蛋白凍干粉。依照本發(fā)明專利使用的酸聯(lián)合酶法提取工藝，每只鼠尾大約可以提取膠原蛋白200mg,與傳統(tǒng)的酸溶法、減溶法及中性鹽法相比較(IOmg)，提取率有了大幅度的提高。實(shí)施例2 :將實(shí)施例I鼠尾膠原蛋白的制備工藝將實(shí)施例I中步驟2的Tris-HCl緩沖鹽溶液溫度調(diào)整為(TC;步驟3的預(yù)處理時(shí)間調(diào)整為4小時(shí)，鼠尾腱置于0°C下的O. 05mol/L醋酸溶液；步驟4胃蛋白酶配比為I : 1000， 酶解持續(xù)36小時(shí)；步驟5乳膠狀溶液于1000rpm/min離心40分鐘；步驟6、7以4000rpm/ min轉(zhuǎn)速高速離心乳膠狀溶液50min ;步驟8中透析袋中透析48h,采用搖床,低速(1_5轉(zhuǎn)/ min)，采用硝酸銀溶液檢驗(yàn)透析外液無(wú)沉淀，表明透析完成，其余同實(shí)施例I。實(shí)施例3 :將實(shí)施例I鼠尾膠原蛋白的制備工藝將實(shí)施例I中步驟2的Tris-HCl緩沖鹽溶液溫度調(diào)整為10°C ;步驟3的預(yù)處理時(shí)間調(diào)整為36小時(shí)，鼠尾腱置于10°C下的2mol/L醋酸溶液；步驟4胃蛋白酶配比為 I 50000，酶解持續(xù)144小時(shí)；步驟5乳膠狀溶液于8000rpm/min離心10分鐘；步驟6、7 以12000rpm/min轉(zhuǎn)速高速離心乳膠狀溶液20min ;步驟8中透析袋中透析96h,采用搖床, 低速(1-5轉(zhuǎn)/min)，采用硝酸銀溶液檢驗(yàn)透析外液無(wú)沉淀，表明透析完成，其余同實(shí)施例I。實(shí)施例4 :本發(fā)明鼠尾膠原蛋白的重量檢測(cè)、SDS-PAGE電泳試驗(yàn)和氨基酸含量分析以大鼠鼠尾為原料，每條鼠尾平均重5g，使用本專利的方法可以提取到干重為 200mg的鼠尾膠原蛋白，提取率約為4%左右。較傳統(tǒng)的方法提取率僅為O. 2%左右提高20 倍以上。實(shí)施例I、2、3樣品經(jīng)水解，經(jīng)高壓液相色譜檢驗(yàn)(樣品處理按GB/T 5009. 124-2003 水解，檢測(cè)方法按JY/T 024-1996)，采用氨基酸分析儀，經(jīng)廣州市分析檢測(cè)中心對(duì)本專利中制備的鼠尾膠原蛋白進(jìn)行氨基酸含量分析，測(cè)定鼠尾膠原蛋白的羥脯氨酸及其他氨基酸的含量，結(jié)果如表I ;采用5%濃縮膠濃度，8%分離膠濃度的SDS-PAGE電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定，其制備的鼠尾膠原蛋白以美國(guó)SIGMA公司的鼠尾膠原蛋白產(chǎn)品為對(duì)照，結(jié)果見圖I。與現(xiàn)有SMGA公司的商業(yè)化鼠尾膠原蛋白進(jìn)行了對(duì)比，兩者圖譜無(wú)差異。從電泳結(jié)果上可以看出，制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，純度好。膠原蛋白純度已達(dá)SDS-PAGE純度。 Maker檢測(cè)，三條帶的分子量分別為220KD，105KD，95KD。表I氨基酸含量分析表
權(quán)利要求
1.一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，包括如下步驟1)、緩沖溶液的準(zhǔn)備和配置0.l-5mol/L NaCl溶液、0. 01-0. 2mol/LTris_HCl緩沖鹽溶液、0. 05-2mol/L醋酸溶液；2)、從鼠尾中分離出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置與0-10°C下的0. 01-0. 2mol/L Tris-HCl緩沖鹽溶液，所抽提的尾腱呈銀白色的絲狀；3)、0-10°C下預(yù)處理4-36小時(shí)，期間定時(shí)攪拌，除去中性條件下可溶解的糖蛋白和其他雜蛋白；將處理過(guò)后的尾腱濾干水分，稱重；以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10°C下的0.05-2mol/L醋酸溶液；4)、以I 1000-1 50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小時(shí)加完。 期間不間斷攪拌至所有尾腱均被酶解呈現(xiàn)乳膠狀；酶解持續(xù)36-144小時(shí)；5)、將乳膠狀溶液于0-10°C條件下離心10-40分鐘，除去不呈現(xiàn)乳膠狀的固化物；往乳膠溶液中以I : 0. 5-1 : 2的體積配比加入0. 01-0. lmol/L醋酸溶液；攪拌至膠狀溶液成分混勻；6)、加入0.l-5mol/L NaCl溶液至乳膠狀溶液并不斷攪拌至有白色絮狀沉淀在溶液中不再析出為止；高速離心溶液20-50min ;收集沉淀；將乳膠溶液以I : 0.5-1 4的體積比的量加入0. l-5mol/L NaCl溶液，于0_10°C下放置6_48h ;次日重復(fù)步驟6 ;7)、集中步驟6中收集到的沉淀，用0.01-2mol/L醋酸溶液重復(fù)溶解后加入0. l_5mol/ L NaCl溶液再次析出膠原蛋白；高速離心溶液20-50min ;收集沉淀；重復(fù)此步驟1_5次直至所沉淀的膠原蛋白能夠完全溶解；8)、將純化完全的膠原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解；灌注于萬(wàn)級(jí)分子量截留的透析袋中透析48-96h ;每天換水2-8次；透析外液用雙蒸水進(jìn)行；9)、將透析完全的膠原蛋白溶液分裝入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-400C-(TC條件下進(jìn)行冷凍干燥48-144h，凍干產(chǎn)品即為鼠尾膠原蛋白凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于鼠尾來(lái)自于成年各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟4中胃蛋白酶三次加入的時(shí)間和量分別是首次加入三分之一，后1-12小時(shí)后加入三分之一，12-36小時(shí)后加入剩余三分之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟4中胃蛋白酶的配比為I : 10000，酶解持續(xù)72小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟5中離心轉(zhuǎn)速為1000-10000rpm/min,步驟6中高速離心轉(zhuǎn)速為4000-12000rpm/min,步驟7中高速離心轉(zhuǎn)速 4000-12000rpm/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于步驟8中，透析時(shí)，采用搖床低速轉(zhuǎn)動(dòng)，采用硝酸銀溶液檢驗(yàn)透析外液無(wú)沉淀，表明透析完成。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，其特征在于鼠尾來(lái)自于 SPF級(jí)成年SD大鼠鼠尾。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鼠尾膠原蛋白的制備方法，采用酶法與酸法相混合的新型提取方案，采用不同鹽濃度的溶液多次鹽析與離心的方法在純化步驟上大為簡(jiǎn)化。本發(fā)明所使用的制備方法可以從每條鼠尾提取干重為200mg的膠原蛋白，較傳統(tǒng)提取的酸溶法每條鼠尾10mg相比可以提高20倍左右，避免了傳統(tǒng)方法提取率低、純化困難、破壞膠原蛋白生物活性等缺點(diǎn)和問(wèn)題。獲得的鼠尾膠原蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE鑒定，獲得了三條目的條帶，與現(xiàn)有SIMGA公司的商業(yè)化鼠尾膠原蛋白進(jìn)行了對(duì)比，圖譜無(wú)差異。經(jīng)過(guò)氨基酸含量分析，制備的鼠尾膠原蛋白質(zhì)量高，純度好。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102586372SQ201210007089
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日 公開號(hào)201210007089.發(fā)明者嚴(yán)家榮, 任海濤, 劉科, 唐小江, 王剛, 鄺少松, 鄭佳琳, 鐘志勇, 饒子亮 申請(qǐng)人:廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心